CN106047786B - 一种快速提高藻类孢囊产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种快速提高藻类孢囊产量的方法。将处于对数生长期中早期的藻种培养至细沙与培养基混合的体系中，光照培养至平台期后期，即可获得大量孢囊。本发明主要通过添加天然的物理介质与藻类共培养，达到加快孢囊形成、有效增加孢囊产量和稳定性的目的。本发明解决了因孢囊量少且形成时间缓慢甚至难以在实验室产生从而无法开展其亚细胞水平、分子水平上的研究等问题,同时为应用微藻孢囊评价压舱水处理效果增加了实验材料的易得性。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种快速提高藻类孢囊产量的方法。
背景技术
休眠孢囊(Resting cyst)是很多微藻类群特别是甲藻通过有性生殖方式产生的休眠合子(少数为无性方式)，是藻类生活史中的一个重要阶段(Dale,1983；Anderson,2012)。很多海洋微藻尤其是甲藻、针胞藻的繁盛可导致海洋有害藻华(Harmful algalblooms,HABs)或“赤潮”(Red tide)，其中有些种类可以产生各种毒素危及海洋动物甚至人类健康。由于孢囊在藻类种群的基因重组、抵抗不良环境、藻华的年际爆发与复发、藻种的地理扩散和生物入侵(Hallegraeff&Bolch,1991)中起着重要的作用，对孢囊产生的条件和孢囊本身的研究是海洋生物学和生态学的重要方向。
目前国内外对孢囊的研究主要是基于野外沉积物中分离得到的孢囊。研究孢囊的分离鉴定和形态描述(Anderson,1988；齐雨藻,1997；Matsuoka,1998；Weller,2006；王朝晖,2003&2011&2014；Tang,2012&2013；Satta,2014；Hyeon Ho Shin,2014)、空间分布及扩散迁移(Hallegraeff,1992；Marret,1997&2003；Irwin,2003；Smayda,2007；Lacasse,2013；Satta,2014；Martin Jennifer,2014)、萌发条件和影响因素(Kokinos&Anderson,1995；Bravo,2010；Kennaway,2004；Figueroa,2005；Anderson,1979&1980&1985&1987；Tang,2008)及与赤潮生消的关系(Anderson1978&1989；DALE,1983；Kremp&Heiskanen,1999；Matsuoka&Fukuyo 2002；Bravo&Figueroa,2014；Anderson,2014)等。另外，孢囊由于处于休眠状态，且通常具有一层较厚的孢囊壁保护，在各种环境压力如厌氧、低(高)温、黑暗、极端盐度等条件下能长期存活，因此成为检测船舶压舱水(Ships'ballast water)处理效果的理想实验材料。鉴于藻类孢囊的实验室产生过程受众多环境条件影响，常常很难稳定、快速地获得所需要的孢囊数量，而通过收集海洋沉积物的孢囊又涉及用船、特殊取泥设备、海况、海洋底质条件、繁复和困难的孢囊分离和鉴定流程等众多限制条件，使能获得的孢囊数量常常无法满足实验室和应用的急切需要，比如对孢囊在亚细胞、分子水平上的研究和压舱水处理中大量的材料需求。
在室内条件下实现基于纯培养的孢囊大量生产，一方面有助于研究孢囊形成和萌发的过程、与有害藻华赤潮生消的关系和在亚细胞、分子水平上探索孢囊形成的诱因及其分子调控机制，以及设计出可用于野外检测或鉴定特定甲藻孢囊的探针，另一方面，稳定、大量、快速的孢囊生产将为发展和应用压舱水处理技术提供重要的检测材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速提高藻类孢囊产量的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种快速提高藻类孢囊产量的方法，将处于对数生长期中早期的藻种培养至细沙与培养基混合的体系中，光照培养到平台期后期(约一个半月至两月左右，成熟孢囊形态、颜色等随种类而异)，即可获得大量孢囊。
所述培养基为以天然海水或人工海水(盐度32左右)为基础介质配制的培养基；如，以天然海水(盐度32左右)为基础介质的f/2培养基或GSe培养基、L1培养基等。
所述藻种为皆为已被证实在其生活史中能够产生休眠孢囊的甲藻；如锥状斯氏藻、短沟别什莱藻、哈曼褐多沟藻、亚利山大藻、链状裸甲藻等。
所述细沙为经100μm网筛筛选天然海水细沙。
具体：
将处于对数生长期中早期的藻种培养至细沙与培养基混合的体系中，每毫升体系中培养400-2000个藻种细胞，体系中细沙与培养基的体积比为1：160-620，进而在21℃±0.5℃的恒温光照，光暗比为12L:12D,光照强度～100μmol photons·m-2·s-1的条件下培养，培养大致1-2个月，使平板内的孢囊在平台期后期以接近指数的增长速率增长，即可以获得大量孢囊。但培养条件可以根据种类的特殊需求做出相应调整。
在上述一定范围内，孢囊的数量随细沙量的增加而增加，增长呈正相关关系。因此通过添加物理介质的方式可以有效加快并增加孢囊的产生。
获得大量孢囊，其计数是在倒置显微镜(OLMPUS，1I73型)的十倍物镜下进行，计数视野采取从上到下、以“S”形对每个孔内形态完整的孢囊进行计数统计并拍照。
所述藻类产孢囊的方法可应用于海洋性微型藻类的实验室培养或压舱水处理效果检测中。
本发明所具有的优点：
本发明方法采用添加天然的物理介质与藻类细胞共培养的方式，快藻类孢囊的形成，在不添加任何化学成分和改变藻生长所需各种理化因子的情况下，简单有效地提高了孢囊产量和产速。其中，在锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)中，孢囊产量比同期未添加细沙组最高提高了107％；在短沟别什莱藻(Biecheleria brevisulcata)中，孢囊产量比同期未添加细沙组最高提高了500％。
同时，本发明方法可快速、大量、稳定的生产微藻孢囊，其解决因孢囊量少、不稳定且形成时间缓慢而影响其研究和应用的问题。并且可应用于海洋性微型藻类的实验室培养和压舱水处理效果检测和其它应用。
附图说明
图1为本发明实施例中所设置的培养方案。图中共设置四个组:A、对照组(0g细沙)；B、0.01g细沙组；C、0.02g细沙组；D、0.04g细沙组，每一竖排的三个培养孔为一组，即每组有三个平行。
图2为本发明在锥状斯式藻(Scrippsiella trochoidea)中实施后根据统计的孢囊数绘制的变化曲线图。
图3为本发明在短沟别什莱藻(Biecheleria brevisulcata)中实施后根据统计的孢囊数绘制的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下的实施例内容。
本发明方法在锥状斯式藻和短沟别什莱藻中进行了实施应用。
实施例1
方法：
a：采集天然细沙；沙选取天然海水浴场的细沙，经100μm网筛筛选(镜检下筛孔尺寸在75-95微米之间)，筛选得到的细沙为表面粗糙、具有不规则的形状。
筛选后的细沙经蒸馏水反复冲洗以去除可能存在的底泥；经冲洗后用精密天平分别称取不同质量(如0.01g/cm2等)，外层用锡箔纸包好，121℃高压蒸汽灭菌30min，烘干备用。
b：将细沙与纯培养的某藻种混合；
培养板选用多孔细胞培养板(Corning 3513，NY)，该培养板为聚苯乙烯材质，培养板平底、透明、表面平滑、无菌、无热原。每个孔直径22.1mm，高15mm，生长面积3.8cm2，最大体积约为5.7cm3。实施例中培养所用体积小于5.0cm3。
培养板内各成分添加顺序依次为对应重量的细沙、4ml f/2培养基、3％的青链霉素混合液(Solarbio)(即0.12ml)、藻液。实验共设置四个组:A、对照组(0g细沙)；B、0.01g细沙组；C、0.02g细沙组；D、0.04g细沙组，每一竖排的三个培养孔为一组，即每组有三个平行(参见图1)。
接种的藻类均为接种在100ml锥形瓶内培养约一周，分布在上层的处于对数生长期的中早期藻液。加入的藻液体积根据最终每孔中藻细胞密度而定，因而在加入原藻液前需取出适量藻液，经2％体积的Lugol试剂固定后，在显微镜下用细胞计数框计数三次，取平均值并将其换算到12孔培养板中每个孔的细胞密度(即为实验的起始细胞密度)，以此来确认需加入藻液的体积；即400-2000个细胞/ml最为适宜。
f/2培养基为以天然海水(盐度32左右)为基础介质的f/2培养基。
实验所用培养液为国际上实验室内通用的甲藻培养液，其配制方法：将天然海水用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，121℃、0.1MPa高温高压灭菌30min，室温冷却后按照f/2培养基配制方法(Guillard,1975)添加除硅酸钠以外的四种成分，所用培养液具体组分信息见表1、2、3。
表1 f/2培养基培养基配方
表2 f/2微量元素溶液配方
| 成分 | 储存液浓度 | 需要量 | 终浓度 |
| FeCl<sub>3</sub>·6H<sub>2</sub>O | --- | 3.15g | 1.17×10<sup>-5</sup>M |
| Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O | --- | 4.36g | 1.17×10<sup>-5</sup>M |
| CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 9.8g/L dH<sub>2</sub>O | 1mL | 3.93×10<sup>-8</sup>M |
| Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 6.3g/L dH<sub>2</sub>O | 1mL | 2.60×10<sup>-8</sup>M |
| ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 22.0g/L dH<sub>2</sub>O | 1mL | 7.65×10<sup>-8</sup>M |
| CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 10.0g/L dH<sub>2</sub>O | 1mL | 4.20×10<sup>-8</sup>M |
| MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O | 180.0g/L dH<sub>2</sub>O | 1mL | 9.10×10<sup>-7</sup>M |
表3 f/2维生素溶液配方
c.置于光照培养箱内培养一段时间，收集孢囊。
将上述体系于室内光照培养箱(CXZ智能型光照培养箱，宁波江南仪器厂)，培养温度均为21±0.5℃，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光暗比为12L：12D的条件培养，而后对生长的孢囊计数
计数方法是在倒置显微镜(OLMPUS，1I73型)的十倍物镜下进行，计数视野采取从上到下、以“S”形对每个孔内形态完整的孢囊进行计数统计并拍照。每组的孢囊数为三个平行孔内孢囊的平均值。实施例2
实验藻种：锥状斯式藻(Scrippsiella trochoidea)
初始细胞密度：764个/ml
培养初始阶段每天对板内情况进行观察，发现孢囊后每隔一天进行一次统计计数，计数情况见表4及图2。
表4锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)各组别孢囊计数结果(单位：个)
实施例3
实验藻种：短沟别什莱藻(Biecheleria brevisulcata)
初始细胞密度：2159个/ml
培养初始阶段每天对板内情况进行观察，发现孢囊后每隔一天进行一次统计计数，计数情况见表5及图3。
表5短沟别什莱藻(Biecheleria brevisulcata)各组别孢囊计数结果(单位：个)
通过连续29天对平板底层的锥状斯式藻的孢囊进行观察、计数，从表4和图2中发现，对照组中孢囊数量呈现先迅速增长后基本保持稳定的状态；加入细沙的平板中，0.01g组孢囊数量先呈现迅速增长后缓慢增长的趋势，0.02g和0.04g组孢囊数量则基本保持指数增长的状态，且随细沙量的增多，孢囊数量增长趋势越明显。
在对短沟别什莱藻连续20天的观察、计数后，通过表5和图3可以发现，未加细沙的对照组中一直未有孢囊出现；而加入细沙的平板中均有孢囊出现，且数量均呈现出前期迅速增加而后缓慢减少的趋势(可能是因为后期平板内细菌增多等原因孢囊破裂)。随细沙数量的增多，孢囊在形成速度、数量上都有明显增长的趋势。
从两个实施例中可以明显看出本发明的实际有效性。通过本发明产生的藻类孢囊，后续可以通过沉降原理或多聚钨酸钠(Sodium polytungstate)试剂从细沙中收集孢囊。
另外，其它生活史中能够产生休眠孢囊的甲藻，如亚力山大藻、链状裸甲藻、哈曼褐多沟藻等也适用本发明的培养方法。
本发明主要通过添加天然的物理介质与藻类共培养，达到加快孢囊形成、有效增加孢囊产量和稳定性的目的。本发明解决了因孢囊量少且形成时间缓慢甚至难以在实验室产生从而无法开展其亚细胞水平、分子水平上的研究等问题,同时为应用微藻孢囊评价压舱水处理效果增加了实验材料的易得性。
Claims (2)
1.一种快速提高藻类孢囊产量的方法，其特征在于：将处于对数生长期中早期的藻种培养至细沙与培养基混合的体系中，光照培养到平台期后期，即可获得大量孢囊；
所述细沙为经100μm网筛筛选天然海水细沙；
所述培养基为以天然海水为基础介质的f/2培养基；
所述藻种为锥状斯式藻和短沟别什莱藻；
将处于对数生长期中早期的藻种培养至细沙与培养基混合的体系中，每毫升体系中培养400-2000个藻种细胞，体系中细沙与培养基的体积比为1：160-1：620，进而在21℃±0.5℃的恒温光照，光暗比为12L:12D，光照强度为100μmol • m-2• s-1的条件下培养，使孢囊在平台期后期以接近指数的增长速率增长，即可以获得大量孢囊。
2.按权利要求1所述的快速提高藻类孢囊产量的方法，其特征在于：所述快速提高藻类孢囊产量的方法应用于海洋性微型藻类的实验室培养或压舱水处理效果检测中。
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