CN106011239A - 用于人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒。本发明所述试剂盒的组份设置及其结果判读方案使得检测过程简便，可操作性强。检测结果可靠、特异性好，同时利用实时荧光PCR技术，通过计算ΔCt值对乳腺癌组织标本中的HER2基因扩增水平进行检测，可用于通过血液ctDNA检测进行乳腺癌辅助诊断，临床以及预后等多个研究领域。

Description

用于人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体设及一种人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增的检测试剂盒。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。在欧美国家，乳腺癌占女性恶性肿瘤的25％-30％。20世纪末的统计资料表明全世界每年约有130万人诊断为乳腺癌，而有40万人死于该病。在我国许多大城市，乳腺癌发病率已经上升为女性恶性肿瘤的第一或第二位，死亡率占第四位或第五位，成为妇女健康的最大威胁。
表皮生长因子受体-2(Epidermal growth factor receptor-2,HER2),是一种位于乳腺和乳腺癌细胞表面的受体，能够控制癌细胞的生长、浸润和癌细胞的转移，大约20％的乳腺癌病例中存在HER2基因和/或蛋白水平增加，它是乳腺癌的独立预后因子，在乳腺癌的靶向治疗和预后判断中的作用已经得到了全世界临床医生的认可。HER2阳性的肿瘤是一种高危肿瘤，HER2癌基因的扩增预示病情进展迅速，局部复发的危险性高，化疗缓解期短，无病生存期(DFS)和总生存期(OS)缩短，对某些常规的化疗和激素治疗反应性差。目前最为常用并经FDA批准的适用于治疗HER2过度表达或HER2基因扩增的乳腺癌的药物是曲妥珠单抗(赫赛汀)，由于这种药物只有针对HER2基因扩增和蛋白过度表达的病人才有效，因此准确评价HER2基因和蛋白水平至关重要。
鉴于HER2基因在乳腺癌诊断和治疗上的指导意义，采用灵敏、有效的方法对它进行检测显得极其重要。目前，检测HER2的方法主要有ELISA、IHC、FISH、CISH、RT-PCR等，其中临床最常用的是IHC法和FISH法，而IHC法是检测HER2的蛋白表达水平，FISH法是检测HER2的基因扩增水平。国内大部分医院已经开展了HER2IHC检测,该方法简便易行、价格低廉、但易受多种因素的影响。国外探针试剂盒及靶向药物(赫赛汀)较昂贵，FISH技术要求较高，而国内各医疗单位乳腺癌HER2检测的准确性、可重复性和完整性尚不尽人意。
外周血循环肿瘤核酸中可检测到与乳腺癌细胞一致的基因突变。这些基因突变的检测可以为乳腺癌的分期及药物的治疗和预后提供丰富的信息。因此，外周血循环肿瘤DNA的Her2基因扩增检测为乳腺癌的早期诊断和治疗提供的很好的研究方向。
发明内容
鉴于上述问题，提出了本发明，以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的用于外周血循环肿瘤核酸DNA中Her2基因扩增的检测试剂盒。
在第一方面，本发明提供了一种人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒，所述试剂盒包括：靶向Her2基因目的位点的特异引物、Her2基因特异性水解探针、内参基因的引物和内参基因的水解探针。
在本发明的一些实施方案中，所述Her2基因目的位点为Her2基因共济失调毛细血管扩张突变ATM区。
在本发明的一些实施方案中，所述内参基因为GAPDH、β-actin、B2M、SDHA、HPRT1中的一种或者多种。
在本发明的一些实施方案中，所述Her2基因目的位点的特异引物分别为：
正向引物：5’-ggctccagagcccacaggc-3’SEQ ID NO:1；
反向引物：5’-tttgttgagccaaacaaagttctctgt-3’SEQ ID NO:2。
在本发明的一些实施方案中，所述Her2基因特异性水解探针为5’-ccctcactga tcttgccttc cttgctctcc acccctgacc-3’SEQ ID NO:3。
在本发明的一些实施方案中，所述内参基因的引物选自以下引物对：
5’-ttggatttggatatttttattgtaaaa-3’SEQ ID NO:4和5’-aattcggcaaaacacccaaacaccca-3’SEQ ID NO:5；
5’-taatttgtgtgtgtgtttattggtttg-3’SEQ ID NO:6和5’-cctccacccaattcaaagaacaccaa-3’SEQ ID NO:7；
5’-tttatattattataatggaaagtatg-3’SEQ ID NO:8和5’-atttcaataagtaaaaaacaaaaaaac-3’SEQ ID NO:9；
5’-gtggttagagttaatattatatagtatg-3’SEQ ID NO:10和5’-aaatatactattaacaataaccaccat-3’SEQ ID NO:11；以及
5’-gattatagataggggtgagagaaaga-3’SEQ ID NO:12和5’-cttatagataggggtgagagaaaga-3’SEQ ID NO:13。
在本发明的一些实施方案中，所述内参基因的水解探针选自5’-ctaacctttaaaatcaaat-3’SEQ ID NO 14、5’-aaatacacacaaacgttca-3’SEQ ID NO:15、5’-aacatttactagaaataat-3'SEQ ID NO:16、5’-taatattacacataaccac-3’SEQ IDNO:17、5,-accacaaataatacacatcc-3'SEQ ID NO:18中的任一个。
在本发明的一些实施方案中，所述Her2基因的探针和内参基因的探针5'端报告荧光基团分别选自FAM、TET、HEX、TAMRA、Texas Red、Rox和Cy5中的一种。
在本发明的一些实施方案中，所述Her2基因的探针和内参基因的探针3'端的淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、TAMRA和DABCYL中的一种。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒中还包含阴性质控品、阳性质控品和无模板对照。
在本发明的一些实施方案中，所述阳性质控品为乳腺癌Her2阳性基因组DNA、所述阴性质控品为健康人全基因组DNA。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒中，PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10XPCR缓冲液、0.1～ImM dNTPs、0.01～0.lOU/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。
在第二方面，本发明提供如第一方面所述的试剂盒在制备用于扩增人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因的药物中的用途。
有益效果：
1、本发明通过Her2基因与内参基因PCR扩增结果的计算，来对检测结果给出判定，提高了检测结果的敏感性和可靠性。Her2基因与内参基因PCR扩增结果指其Ct值，即Her2基因与内参基因的巧光信号到达设定的阔值时所经历的循环数。通过Her2基因与内参基因PCR扩增结果的计算来对检测结果给出判定的方式是：Her2基因Ct《32,判定结果：阳性；Her2基因Ct>32,Her2基因Ct-内参基因Ct《8,判定结果：阳性；Ct>32，Her2基因Ct-内参基因Ct>8,判定结果：阴性。
2、本发明利用循环肿瘤DN的Her2基因模板非特异性扩增，提高了其灵敏度，可W在循环肿瘤DNA中检测Her2基因状况，操作简单。通过目的基因与内参基因PCR扩增结果的计算，来对检测结果给出判定，提高了检测结果的敏感性和可靠性。
3、本申请与直接测序法的不同之处在于此申请所用方法为直接通过PCR(聚合酶链式反应)得到的巧光信号直接判断Her2基因状态；而直接测序法需要通过PCR对目标区域扩增后进行测序反应方能得到Her2基因的状态。
4、本发明所述试剂盒的组份设置及其结果判读方案使得检测过程简便，可操作性强。检测结果可靠、特异性好。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
材料：待检血浆样本、阳性质控品、阴性质控品。所述阳性质控品为乳腺癌患者基因组DNA，所述阴性质控品为正常人类基因组DNA。
所用引物和探针：Her2基因目的位点引物：SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2；Her2基因特异的水解探针SEQ ID NO:3；内参基因的引物SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5；内参基因的水解探针SEQ ID NO:14，其中Her2基因目的位点引物和探针都是根据Her2基因共济失调毛细血管扩张突变ATM区SEQ ID NO:19设计并筛选的。所有引物和探针纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为long/μ1备用。
仪器：Lightcycler 480、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。
试剂：循环肿瘤DNA提取试剂盒(上海医脉赛科)、DNA聚合酶(罗氏公司)、10XPCR Buffer(罗氏公司)、MgC12(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。
(1)循环肿瘤DNA的提取
采用上海医脉赛科技有限公司的循环肿瘤DNA提取试剂盒提取病人循环肿瘤DNA,具体步骤如下：
A、血浆样品至2ml离屯、管中，加入蛋白消化液A、蛋白酶K、37℃恒溫解30min。B、加入核酸结合液、DNA提取磁珠，混合后加入Solutio址R，置于旋转混和仪，温和和混匀25min。
C、用磁分离架吸附磁珠Imin，弃上清。
D、加入洗涂液I洗涂磁珠两次。
E、加入洗涂液II洗涂磁珠两次。
F、吸附磁珠，弃上清后静置3-6min。
G、加入洗脱液，置于室溫，混和均匀洗脱5min。
H、磁场吸附磁珠，回收含基因组DM的洗脱液。
I、通过微量DNA定量对样品中获得的DNA含量进行定量测定。
J、将上述获得的循环肿瘤DNA作为模板。
(2)PCR反应的体系和反应条件
所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10XPCR缓冲液、0.1～ImMdNTPs、0.1～luM Her2基因引物、0.1～luM内参基因引物0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～luM Her2Taqman水解探针、0.1～luM内参基因Taqman水解探针、0.01～0.lOU/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。
所述检测基因为Her基因、所述内参基因为GAPDH。所述Her2基因的探针和内参基因的探针5′端报告荧光基团为FAM；所述Her2基因的探针和内参基因的探针3′端的淬灭基团为BHQ1。
所述dNTPs中包括10mM dATPUOmM dCTP、10mM dTTP和10mMdGTP，所述PCR体系中包含Tris·Cl、氯化钟、硫酸镁和氯化镁。
所述PCR扩增反应的具体过程为：92～97℃预变性5～35分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，并进行35～55个循环。
(3)PCR反应的加样布局(见表1)
待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔检测，PCR仪96孔板加样布局见下表。表中PC代表阳性质控品(PositiveControl)，NC代表阴性质控品(Negative Control)，NTC代表无模板对照(Notemplate control)，S代表检测样本(sample)。
表1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A PC PC PC S7 S7 S7
B NC NC NC S8 S8 S8
C S1 S1 S1 S9 S9 S9
D S2 S2 S2 S... S... S...
E S3 S3 S3 NTC NTC NTC
F S4 S4 S4
G S5 S5 S5
H S6 S6 S6
实验结束以后，按以下步骤进行检测结果的分析、判定：
进行无模板对照(NTC)的扩增曲线分析，Her2基因和内参基因(最优选：ACTB)此时应无扩增曲线明显扩增信号，说明实验无污染，可以继续分析。
质控品的内参基因(ACTB)应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，质控品内参基因(ACTB)的CP值应符合下表中参数范围；阴性质控品的Her2基因应无明显扩增曲线变化，阳性控品Her2的CP值应符合下表中质控品的参数范围。质控品检测满足以上条件时，证明实验有效，可继续分析。
样本的内参基因(ACTB)应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，样本单个PCR检测结果应按照表2样本检测-单个PCR结果判读。
表2
若不符合表2中的1、2项要求，则建议重新检测。
在以上实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如按照分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件或制造厂商所建议的条件进行操作。
临床实施例：
a)样本选择依据
样本为经病理学检查确诊为浸润性乳腺癌患者的石蜡包埋组织切片。
b)入选标准
1.临床上已确诊的浸润性乳腺癌患者；
2.可获得足够病理标本；
3.有免疫组化法(IHC)测定结果
c)排除标准和剔除标准
1.FISH杂交片不可读；
2.相邻组织切片HE染色光镜下见浸润性乳腺癌细胞数量少；
3.内对照组呈现非预想结果；
4.FISH信号不均一(一致性<75％)；
5.出现背景弥散信号(>10％信号位于细胞浆)；
6.酶消化过度(核分辨不清、持续性自发荧光)；
7.细胞核轮廓不清或有重叠；
8.未按照说明书中的标准方法进行操作，比如未用中性缓冲甲醛固定、固定少于6h或多于48h；
d)、样本采集、保存、运输方法等
样本采集为浸润性乳腺癌患者的石蜡标本，于10％的中性福尔马林固定24-48小时。切片厚度4μm，在室温中至少可以保存一年。运输过程中，不得剧烈震荡，以免影响检测结果。
e)判定标准
每例乳腺癌样本在浸润性癌区域，随机计数30个癌细胞核中的双色信号。以HER-2/CEP17比值作为HER-2的扩增定量标准。HER-2/CEP17>2.2，提示扩增阳性；HER-2/CEP17<1.8，提示扩增阴性；二者比值介于1.8～2.2之间，为可疑结果；此时可选择增加细胞计数至50个或由另外一个分析者重新计数，若仍为临界值则在FISH检测报告中注明或重复进行FISH或IHC检测。
4、15例样本的检测结果显示，本发明检测结果准确度与临床金标检测结果完全一致。
对比例：
探针GEP17/GLP HER2
1、对比例来源
购于美国Creative Diagnostic公司，美国Creative Bioarray公司
2、主要原材料确定依据
(1)质理标准
①生产商提供的技术指标
②适用于本产品的技术要求
性状要求：粉色液体
灵敏度、特异性和准确性均能达到本实验的要求。
(2)试验设计
探针质量是决定FISH实验是否成功的关键因素。探针的灵敏度、特异性和稳定性是选择探针的主要指标。我们通过对不同公司探针(GEP17，GLP HER2)的灵敏度、特异性和稳定性检测，来选择探针来源。
①灵敏度
在阴性参考片中分析50个中期分裂相，应该有至少98条17号染色体着丝粒位置显示绿色荧光；至少98条HER-2/neu基因(17q12)的位置显示红色荧光。
②特异性
阴性参考片N1中期分裂相，要求应无任何染色体位点之间的交叉杂交现象；杂交只出现在2种探针预期的靶区域中。
③准确性
将探针与3张阴性参考片N2～N4、3张阳性参考片P1～P3进行杂交，在显微镜下观察结果。根据结果判读标准，其符合率应为100％。
(3)试验结果
表1不同厂家探针选择试验结果对比
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

1.一种人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒，所述试剂盒包括：靶向Her2基因目的位点的特异引物、Her2基因特异性水解探针、内参基因的引物和内参基因的水解探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述Her2基因目的位点为Her2基因共济失调毛细血管扩张突变ATM区。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述内参基因为GAPDH、β-actin、B2M、SDHA、HPRT1中的一种或者多种。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因目的位点的特异引物分别为：
正向引物：SEQ ID NO:1；
反向引物：SEQ ID NO:2。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因特异性水解探针为SEQ ID NO:3。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述内参基因的引物选自以下引物对：SEQ ID NO:4和5、SEQ ID NO:6和7、SEQ ID NO:8和9、SEQID NO:10和11以及SEQ ID NO:12和13。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述内参基因的水解探针选自SEQ ID NO 14-18中的任一个。
8.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因的探针和内参基因的探针5'端报告荧光基团分别选自FAM、TET、HEX、TAMRA、Texas Red、Rox和Cy5中的一种。
9.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因的探针和内参基因的探针3'端的淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、TAMRA和DABCYL中的一种。
10.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述试剂盒中还包含阴性质控品、阳性质控品和无模板对照。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述阳性质控品为乳腺癌Her2阳性基因组DNA、所述阴性质控品为健康人全基因组DNA。
12.如权利要求1-11中任一项所述的试剂盒在制备用于扩增人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因的药物中的用途。
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