CN105963291B - 异补骨脂二氢黄酮及其类似物的医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种活性成分的用途，所述活性成分为具有式(I)结构的化合物，或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前药：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自下组：氢、CH2‑CH＝C(CH3)2、OC(CHOH)4CH2OH、ORa、OCOORa、OCONRaRb、OSO2Ra和OSO3Ra；所述的Ra和Rb各自独立地选自下组：氢、取代或未取代的C1‑C12烷基、取代的或未取代的C2‑C12烯基、取代的或未取代的C2‑C12炔基、取代或未取代的C6‑C30芳基，和取代或未取代的C1‑C30杂芳基；所述活性成分用于制备Src激酶和/或Fyn激酶的活性抑制剂。

Description

异补骨脂二氢黄酮及其类似物的医药用途
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种异补骨脂二氢黄酮及其类似物的医药用途。
背景技术
Src家族激酶(Src family kinases，SFKs)包括c-Src、Lyn、Fyn、Lck、Hck、Fgr、Blk、Yes和Yrk。根据氨基酸序列，SFKs可分为2个亚族：一族为c-Src、Fyn、Yes和Fgr，在不同组织中广泛表达；另一族为Lck、Blk、Lyn和Hck，与造血细胞密切相关。目前认为，SFKs是不同细胞多样信号传输和整合的关键点。Src激酶是目前研究最为深入同时也是与人类疾病联系最为密切的SFKs成员，其通过信号转导调控细胞生长、分化和存活，影响细胞黏附、迁移和侵袭，同时还参与突触传递的调节。研究表明，脑缺血再灌注的发生与Src激酶的调节有关。
所有SFKs成员都由几个特殊结构域组成，从N-末端至C-末端依次为SH4、SH3、SH2和SH1结构域。SH4结构域含有豆蔻酰化位点，在某些情况下也发生棕榈酰化，这2种脂类修饰为Src激酶靶向细胞内膜并与其结合所必需。在SH4与SH3结构域之间存在1个特殊结构域，其在不同SFK成员之间存在差异性并可能有着特殊的功能。SH3结构域由约60个氨基酸残基组成，在靶蛋白2型聚脯氨酸(polyproline typeⅡ，PPⅡ)中成螺旋序列，可与富含脯氨酸的多肽位点结合，因此在蛋白质-蛋白质相互作用中起着非常重要的作用。SH2结构域由约100个氨基酸残基组成，可在短期内使靶蛋白中的特定氨基酸序列酪氨酸磷酸化。SH1为催化结构域，其与ATP和底物肽结合并介导磷酸化。C-末端是1个含有酪氨酸残基(人：Tyr530)或酪氨酸残基(小鼠：Tyr527)的负性调控区域，当C-末端Src激酶(C-terminal Srckinase，Csk)磷酸化时可与SH2结构域相互作用。
Src激酶活性调节是通过一系列复杂的限制ATP亲和性和激酶结构域活性位点分子之间的相互作用引起的。Src激酶的激活通常发生于细胞膜，通过Csk诱导分子内SH2结构域与C-末端Tyr530结合并发生磷酸化，使分子呈头尾卷曲状态，将酶活性中心遮盖，使Src激酶活性处于抑制状态。Tyr419去磷酸化可促进Src激酶活化。SH3结构域结合SH2再与激酶结构域的连接器连接，两者的相互作用保证激酶无论是在关闭、失活和破坏时足以引起激酶的激活。例如，SH2末端尾部的释放促进SH2结构域与其他酪氨酸磷酸化蛋白如黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)之间的相互作用可使Src激酶激活。
现有的研究已经发现，Src激酶与多种疾病相关，并有可能成为其潜在的治疗靶点：
1.与心脑血管疾病的关系
Src家族激酶与高血压及肺动脉高压密切相关。有研究报道[Qin B,Zhou J.PLoSOne.2015；10(5):e0127891.]。Src家族激酶(SFKs)抑制剂SU6656在体内及体外实验都可以降低Ang II诱导的肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化和血管收缩。另外，Src激酶的磷酸化水平在肺动脉高压中表达增加。而Src激酶抑制剂达沙替尼可以通过抑制Src激酶的磷酸化进而抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。达沙替尼在体内还可以逆转肺血管重构。c-Src还与骨形态蛋白受体II(BMPR-II)相互结合，而BMPR-II的突变可以导致Src活性的增加以及细胞生长。因此，Src可以作为肺动脉高压的作用靶点，为治疗肺动脉高压提供新思路[PullamsettiSS,et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2012Jun；32(6):1354-65.；Wong WK,KnowlesJA,Morse JH.Am J Respir Cell Mol Biol.2005Nov；33(5):438-46.]。
Src家族激酶还与心肌梗塞和心脏肥大的形成密切相关。研究发现[Weis S,Shintani S,Weber A et al.J Clin Invest.2004Mar；113(6):885-94.]，阻断Src激酶可以阻止内皮细胞的功能障碍，抑制血管渗透性以及梗死体积，提高心肌功能和存活。而阻断Src激酶对心肌梗塞的改善是通过稳定Flk/cadherin复合物实现的。另有研究发现[Rutledge CA,et al.J Am Coll Cardiol.2014Mar 11；63(9):928-34.]，c-Src激酶的抑制还可以促进结合蛋白43(Cx43)的表达，降低可诱发性心律不齐，可以作为治疗心肌梗死的新方法。Src家族激酶与心脏肥大也有密切关联。长期压力导致的心肌肥大中Src激酶的活性是增加的[Takeishi Y,et al.J Mol Cell Cardiol.2001Sep；33(9):1637-48；]。Src激酶可能是通过内皮素依赖性的方式调控心肌肥大的[Kovacic B,et al.J BiolChem.1998Dec 25；273(52):35185-93.]。在2001年Paul等人发现阻断Src激酶活性或Src缺失能够保护小鼠脑中风引起的脑损伤；而后，另一研究小组运用Src激酶阻断剂SKI-606或SKS-927，在缺血再灌注小鼠模型中能够有效地保护脑血管内皮和脑组织的损伤[Paul R,et al.Nat Med.2001Feb；7(2):222-7.Liang S,et al.J Pharmacol Exp Ther.2009Dec；331(3):827-35.]。
2.与癌症的关系
原癌基因c-src的表达在时空上的紊乱使其蛋白产物发生质和量的改变,是肿瘤发生的重要原因。
研究发现，Src激酶在癌症中扮演重要角色。Src激酶可以通过调控细胞生长及甲状旁腺激素相关蛋白的表达进而调控乳腺癌细胞的转移[Myoui A,et al.CancerRes.2003Aug 15；63(16):5028-33.]。而Src激酶的抑制可以降低癌细胞的转移，降低乳腺癌的发生，增加小鼠的存活[Rucci N,et al.J Pharmacol Exp Ther.2006Jul；318(1):161-72.]。Src激酶抑制剂塞卡替尼(AZD0530)可以通过调控LRRC19和IGFBP2的表达进而抑制胰腺癌的生长[Rajeshkumar NV,et al.Clin Cancer Res.2009Jun 15；15(12):4138-46.]。Src激酶抑制还能抑制胰腺癌的侵袭[Ito H,et al.Surgery.2003Aug；134(2):221-6.]。而Src激酶抑制剂AZD0530和达沙替尼还可以抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭[NamHJ,et al.Mol Cancer Ther.2013Jan；12(1):16-26.；Okamoto W,et al.Mol CancerTher.2010May；9(5):1188-97.]。
Src激酶的激活可以通过PI3K/Akt信号通路诱导上皮间质转化，进而促进鼻咽癌的转移[Ke L,et al.Oncotarget.2016Apr 7.doi:10.18632/oncotarget.8634.]。有报道表明[Chen J,et al.Clin Colorectal Cancer.2014Mar；13(1):5-13.；Mao W,etal.Oncogene.1997Dec 18；15(25):3083-90.]，Src激酶的过表达可以加速结肠癌的转移，对化学疗法药物产生抵制作用。而Src激酶的抑制可以降低免疫反应，进而消除癌细胞。神经肽可以通过激活Pyk2和Src激酶进而促进肺癌细胞的增殖和存活[Roelle S,etal.Oncogene.2008Mar 13；27(12):1737-48]。而Src激酶的小分子抑制剂可以抑制肺癌细胞的生长，迁移[Lee D,et al.Clin Lung Cancer.2006May；7(6):381-4.]。Src激酶还可以作为前列腺癌的靶点[Paronetto MP,et al.Am J Pathol.2004Apr；164(4):1243-51.]。另有研究发现，Src激酶的抑制剂PP2,SU6656和达沙替尼可以降低Src激酶的活性，抑制甲状腺癌细胞的生长，其中达沙替尼又可以抑制甲状腺肿瘤在体内的生长[Henderson YC,etal.Head Neck.2014Mar；36(3):375-84.]。Src和p-Src的表达水平在骨肉瘤中表达增加[HuC,et al.Med Sci Monit.2015Feb 28；21:638-45.]。而Src激酶的抑制剂SI-83可以作为潜在的治疗骨肉瘤的药物[Bernardini G,et al.Mol Biosyst.2014Jun；10(6):1305-12.]。
3.与炎症的关系
Src激酶的活性在溃疡性结肠炎中表达显著增加，为后期结肠癌的发生和发展提出警示[Cartwright CA,et al.J Clin Invest.1994Feb；93(2):509-15.]。另有研究发现[Nuche-Berenguer B,et al.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2016Mar31:ajpgi.00349.2015.]。Src家族激酶的激活在急性胰腺炎中也扮演重要角色，抑制凋亡，促进坏死及细胞因子释放。因此可以作为急性胰腺炎的潜在作用靶点。
4.与血液性疾病及细胞增殖性病症的关系
研究表明，Src激酶可以引起血小板减少症和慢性骨髓白血病等血液性疾病。研究发现[Turro E,et al.Sci Transl Med.2016Mar 2；8(328):328ra30.]，Src激酶可以引起血小板减少症、出血等疾病。而Src激酶抑制剂可以作为治疗该类疾病的有效手段。另外，Src激酶抑制剂SKI-606和达沙替尼都可以有效治疗慢性骨髓白血病(Konig H,etal.Blood.2008Feb 15；111(4):2329-38.；Quintás-Cardama A,et al.FutureOncol.2006Dec；2(6):655-65.)。
Src激酶的活性可以促进B细胞淋巴瘤的存活和生长[Ke J,et al.MolCancer.2009Dec 31；8:132.]，而其抑制剂达沙替尼对弥漫性B细胞淋巴瘤具有抑制效果[Hollmann CA,et al.Leuk Res.2010May；34(5):585-93.]。而Src家族激酶的另一成员Fyn与霍奇金淋巴瘤之间存在相关性，为霍奇金淋巴瘤的治疗提供新靶点[Martín P,etal.Leuk Lymphoma.2011Nov；52(11):2162-8.]。
5.与骨骼及脏器纤维化疾病的关系
siRNA沉默Src可以抑制由VEGF诱导的血管渗透性及破骨细胞的活性，进而修复骨坏死[Cao HJ,et al.Bone.2015May；74:58-68.]。Src的沉默还可以阻止与皮质类固醇相关的骨质疏松以及骨坏死[Zheng LZ,et al.Bone.2016；83:190-6.；Zheng LZ，et al.J BoneMiner Res.2015；30(11):2044-57.]。所以Src的抑制剂可以作为治疗骨质疏松和骨坏死的有效药物。
Src激酶与脏器纤维化之间同样存在密切联系。研究发现[Yan Y,et al.KidneyInt.2015Oct 7.doi:10.1038/ki.2015.293.]，Src激酶的抑制可以抑制TGF-β1信号通路，激活表皮生长因子受体和STAT3信号通路，进而抑制肾纤维细胞的增殖，最终改善肾脏纤维化。另有研究发现[Hu M,et al.J Pharmacol Exp Ther.2014Oct；351(1):87-95.]，Src激酶的抑制剂塞卡替尼可以阻断由TGF-β1诱导的Src激酶的激活，降低α-SMA的表达，对治疗肺纤维化提供新的靶点。Src激酶的抑制还能阻断皮肤纤维化的发生。因此，Src激酶又可以作为治疗皮肤纤维化的靶点[Skhirtladze C,et al.Arthritis Rheum.2008May；58(5):1475-84.]。另外，Src激酶还参与囊性纤维化跨膜调控子(CFTR)和MUC1的连接，与囊性纤维化密切相关[González-Guerrico AM,et al.J Biol Chem.2002May 10；277(19):17239-47.]。
中药补骨脂是一种常见的补肾中药，有补肾壮阳、固精速尿、温脾止泻、纳气平喘之效。异补骨脂二氢黄酮(Isobavachin)是从中药补骨脂(Psoralea Corylifolia L.)中提取分离出的一种异戊烯基黄酮类单体。
发明内容
本发明的目的旨在提供异补骨脂二氢黄酮及其类似物的新用途。
本发明的第一方面提供了一种活性成分的用途，所述活性成分为具有式(I)结构的化合物，或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前药：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自下组：氢、CH2-CH＝C(CH3)2、OC(CHOH)4CH2OH、ORa、OCOORa、OCONRaRb、OSO2Ra和OSO3Ra；所述的Ra和Rb各自独立地选自下组：氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代的或未取代的C2-C12烯基、取代的或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取代或未取代的C1-C30杂芳基；
所述活性成分用于制备Src激酶和/或Fyn激酶的活性抑制剂。
在一优选例中，所述R1选自氢、羟基或烷氧基，所述R2选自氢或CH2-CH＝C(CH3)2，R3选自羟基、烷氧基或OC(CHOH)4CH2OH，R4为氢，R5选自氢或羟基，R6选自氢或CH2-CH＝C(CH3)2，R7选自氢或羟基，R8选自氢或CH2-CH＝C(CH3)2，R9选自氢、羟基或烷氧基，且R10选自氢或羟基。
在另一优选例中，所述活性成分选自下列化合物：
或
在另一优选例中，所述Src激酶和/或Fyn激酶的活性抑制剂可用于防治下列疾病：心肌梗塞、高血压、肺动脉高血压、脑卒中、心肌肥大、溃疡性结肠炎、急性胰腺炎、血小板减少症、慢性骨髓白血病、肿瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、骨质疏松症和骨坏死、肾纤维化、肺纤维化、皮肤纤维化或囊性纤维化。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明：
图1体现了异补骨脂二氢黄酮对体外血管内皮细胞Src家族激酶蛋白Fyn磷酸化的抑制作用；图1A显示免疫印迹代表性结果；图1B显示磷酸化Fyn统计结果(N＝3)，与对照组比较，##P<0.01；与血管紧张素II(AngⅡ)组比较，**P<0.01或*P<0.05；
图2体现了异补骨脂二氢黄酮对重组蛋白Src激酶的酶活性直接抑制效果；图2A显示测得的发光信号单位(RLU)；图2B为异补骨脂二氢黄酮不同浓度对SRC激酶活性的影响(％)；与对照组比较，**P<0.01。
图3体现了异补骨脂二氢黄酮不同给药剂量对大鼠MCAO模型脑梗死体积的影响；图3A显示TTC染色结果；图3B是对梗死体积的统计。与手术模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图4体现了异补骨脂二氢黄酮对MCAO模型大鼠脑内血管内皮细胞Fyn和Src磷酸化的抑制作用(Western Blot法)；图4A、4C显示免疫印迹代表性结果；图4B显示磷酸化Fyn统计结果；图4D显示磷酸化Src统计结果；与假手术组组比，##P＜0.01；与手术模型组相比，**P＜0.01。
图5体现了异补骨脂二氢黄酮对MCAO模型大鼠脑内组织切片中Fyn和Src磷酸化的影响(免疫组化和免疫荧光法)；图5A显示运用免疫组化检测脑组织的Fyn磷酸化；图5B显示免疫荧光法检测脑内脑组织的Src磷酸化，DAPI染细胞核。A图显示，与假手术组相比，模型组在再灌后6h时，染成棕褐色的细胞数最多；而与模型组相比，异补骨脂二氢黄酮组在再灌后6h时被染成棕褐色的细胞数降低，表明在再灌后6h时异补骨脂二氢黄酮降低Fyn磷酸化表达水平；B图显示，与假手术组相比，模型组的绿色荧光强度最强；与模型组相比，异补骨脂二氢黄酮给药组的绿色荧光量降低，且DAPI荧光量在各组间没有明显变化，表明在再灌后6h，异补骨脂二氢黄酮降低Src磷酸化水平；图6体现了异补骨脂二氢黄酮及类似物对Fyn和Src蛋白磷酸化的影响；图6A、6C显示免疫印迹代表性结果；图6B显示磷酸化Fyn统计结果；图6D显示磷酸化Src统计结果(N＝3)。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，异补骨脂二氢黄酮能够有效地调节Src和Fyn激酶的活性，从而调控Src和Fyn激酶的信号传递。基于上述发现，本发明人完成了本发明。
如本发明所用，下列术语具有如下含义：
术语“Isobavachin”、“异补骨脂二氢黄酮”可互换使用，具体指如下化合物：
术语“C1-C12烷基”是指具有1-12个碳原子的直链或支链烷基或环烷基，例如：甲基、亚甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基，或类似基团。
术语“C2-C12烯基”是指具有2-6个碳原子的、具有一个或多个双键的直链或支链的烯基或环烯基，例如：乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、环己烯基、环庚烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、或类似基团。
术语“C2-C12炔基”是指具有2-12个碳原子的、具有一个或多个三键的直链或支链的炔基，例如：乙炔基、丙炔基、或类似基团。
术语“C6～C30芳基”是指具有6～30个碳原子的芳基，包括单环或二环芳基，例如：苯基、萘基、或类似基团。
术语“C1～C30杂芳基”是指具有1～30个碳原子的杂芳基，例如：吡咯基、吡啶基、呋喃基、或类似基团。
术语“取代”是指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、卤素、羟基、羧基(-COOH)、C1～C10醛基、C2～C10酰基、C2～C10酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述的取代基选自卤素、C1-C10烷基、氰基、OH、硝基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基或氨基。
术语“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
术语“药学上可接受的盐”是指所述化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸所形成的盐，所述的无机酸包括：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1,5)、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸。
术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体，例如：烯醇与相应的酮。
术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。
术语“前药”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。
本发明的异补骨脂二氢黄酮(Isobavachin)是属蔷薇目豆科补骨脂(又名：破故纸、婆固脂、胡韭子)的主要活性成分。其分子式：C20H20O4；分子量：324.37，化学结构式为：
如本发明所用，本发明优选的异补骨脂二氢黄酮的类似物包括但不限于下列化合物：
1.光甘草宁(Glabranin)，分子式：C20H20O4；分子量：324.37
2.8-异戊烯基柚皮素(8-Prenylnaringenin)，分子式：C20H20O5；分子量：340.4
3.Leachianone G，分子式：C20H20O6；分子量：356.4
4.Isoxanthohumol，分子式：C21H22O5；分子量：354.4
5.Euchrestaflavanone B，分子式：C25H28O6；分子量：424.5
6.Maackiaflavanone，分子式：C26H30O6；分子量：436.5
7.5-Hydroxysophoranone，分子式：C30H36O5；分子量：476.5
8.Kushenol L，分子式：C25H28O7；分子量：440.5
9.Flavaprin，分子式：C26H30O10；分子量：502.6
10.Phellamurin，分子式：C26H30O11；分子量：518.6
本发明的异补骨脂二氢黄酮及其类似物可通过本领域的常规方法从中药补骨脂等植物中提取获得，亦可通过商业途径购买或者利用市售原料，通过现有技术中传统的化合物合成方法合成获得。本领域的普通技术人员根据现有公知技术可以合成本发明的化合物。合成的化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。
合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的，并且是现有技术中的公知的技术，如R.Larock,Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis,3rd Ed.,John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser andM.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley andSons(1994)；and L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)中都有公开。
经本发明人研究证实，本发明的异补骨脂二氢黄酮及其类似物可用于制备Src激酶和/或Fyn激酶的活性抑制剂，进而防治相关疾病。
AngⅡ刺激内皮细胞、血管平滑肌细胞产生过量的自由基，导致细胞损伤，引发炎症反应和功能障碍。而细胞损伤、功能障碍也是缺血性脑血管病发生发展的关键因素。在心脑血管系统中，AngⅡ主要通过调控NADPH氧化酶系统产生ROS，进一步激活Src家族激酶的活性。因此，在体外实验中，本发明人主要运用AngⅡ造氧化应激模型，进而促进Src家族激酶的活性。
运用免疫印迹方法，可以发现：异补骨脂二氢黄酮对Fyn磷酸化水平的抑制具有浓度依赖性(图1)。激酶活性实验(Kinase Assay)的结果显示，在体外异补骨脂二氢黄酮可直接抑制Src激酶的活性，并呈现浓度依赖性，其IC50值为17.286μM(表1和图2)。这些结果说明，异补骨脂二氢黄酮是一个很好的Src家族激酶的抑制剂。
动物实验表明，不同给药剂量的异补骨脂二氢黄酮可以有效改善MCAO模型大鼠的脑梗死体积(表2和图3)。另外，异补骨脂二氢黄酮可以有效降低MCAO模型中Src家族激酶Fyn和Src的活性(图4和图5)。
另外研究发现，异补骨脂二氢黄酮及其类似物还可以有效抑制Src及Fyn激酶的磷酸化水平(图6)。
本发明的异补骨脂二氢黄酮及其类似物在组合物或药物制剂中的含量例如0.0001-50wt％；较佳的0.001-30wt％；更加的0.01-20wt％。
治疗有效量的本发明的组合物的用量介于0.001-500mg/kg体重/天之间，任何介于上述范围之内的用量皆为本发明的有效量。优选的，本发明的组合物的用量介于0.005-300mg/kg体重/天之间；更优选的，本发明的组合物的用量介于0.01-100mg/kg体重/天之间。所述的“治疗有效量”可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗。本领域的专业人员能够理解，在实际给药时的用量可高于或低于上述剂量范围。针对某一对象(如哺乳动物—人)的“治疗有效量”和具体治疗方案可受诸多因素的影响，包括所用化合物或其前药的药效活性、给药对象的年龄、体重、一般情况、性别、饮食、给药时间、疾病易感性、疾病进程以及治疗医师的判断等。所述“治疗”指的是给予机体(患有疾病、具有疾病的症状、或者具有疾病的前兆)本发明的异补骨脂二氢黄酮及其类似物，以治疗、减轻、减缓、改变、治愈、影响、改善其疾病、疾病的症状或疾病的前兆。
本发明的异补骨脂二氢黄酮及其类似物或其组合物或其药物制剂可以通过口服、静脉内、肌肉内、皮下、鼻腔内、直肠内等途径给药。固体载体如：淀粉、乳糖、磷酸二醇、微晶纤维素、黑糖和白陶土，而液态载体如：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需要的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，如，调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
本发明的异补骨脂二氢黄酮及其类似物也可胃肠外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物的生长。
适用于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物如细菌和真菌的污染和影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇、它们的适当混合物和植物油。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载的内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本文所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1.异补骨脂二氢黄酮抑制Src家族激酶蛋白Fyn磷酸化
1.1目的：观察异补骨脂二氢黄酮能否抑制Src家族激酶蛋白Fyn磷酸化，考察药物的活性
1.2实验材料：
1.2.1实验试剂
1.2.1.1细胞株：HUVEC细胞株购自美国ATCC公司(HUVEC,CRL-1730)。
1.2.1.2抗体：HRP-conjugated Monoclonal Mouse Anti-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease(GAPDH,KC-5G5)购自上海康成生物有限公司；Goat anti-rabbitIgG-HRP(sc-2004)购自SANTA CRUZ公司；Anti-Fyn antibody[FYN-01](ab1881)、Anti-Fyn(phospho Y530)antibody(ab182661)购自abcam公司。
1.2.1.3试剂：RIPA裂解液(弱，P0013D)；苯甲基磺酰氟PMSF(100mM，ST506)均购自碧云天生物技术研究所；十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、β-巯基乙醇、甘氨酸(Glycine)、Tris碱、丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、过硫酸胺(ammonium persulfate，APS)、四甲基乙二胺(tetramethylenediamine，TEMED)、牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)、Tween-20均购自Sigma公司；ECL Immobilon Western ChemiluminescentHRP Substrate(WBKLS0500)购自Millipore公司；蛋白质转印膜(硝酸纤维素膜，NC膜)购自美国Pall公司；细胞培养基DMEM低糖，FCS，0.25％胰蛋白酶均购自美国GIBCO；氨苄青霉素(A6140)、AngⅡ、DMSO购自Sigma；EDTA购自上海生物工程；异补骨脂二氢黄酮购自上海源叶生物有限公司。
1.2.2实验仪器
CO2细胞培养箱(HEPA CLASS 100，美国Thermo公司)，生物安全柜(Delta series,美国Labconco)，细胞培养皿，倒置相差显微镜(IX71，日本Olympus)，蛋白质电泳及转印系统(美国BIORAD公司)，QL-901Vortex、LX-100手掌型离心机、LX-200迷你离心机、TS-1型脱色摇床、TS-8转移脱色摇床、TS-8Transference Decoloring Shaker均为江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产，塑料薄膜封口机(FS-200型，温州正雄机械有限公司)，JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，2600C自动X线胶片洗片机，incubator shaker恒温摇床(ZHWY-211B、ZHWY-100B，上海智诚)。
1.3实验方法
1.3.1细胞培养
HUVEC用含有10％FCS的L-DMEM(低糖)在10cm培养皿中培养，含5％CO2细胞培养箱37℃恒温培养，隔日半量换液，待细胞密度达到80％-90％时进行细胞传代，PBS洗2遍，每皿加入1mL0.25％胰酶消化3min，加入5mL含有血清的L-DMEM培养基终止消化，收集细胞，室温1000rpm，离心5min，弃上清，加入含有10％FCS的培养基1:3传代培养。取8-14代细胞用于实验。
细胞冻存液含60％完全培养基、30％FCS、10％DMSO。
1.3.2蛋白免疫印迹分析
1.3.2.1总蛋白的提取
对于贴壁细胞，去除培养液，10-7mol/L AngⅡ刺激细胞7min，用4℃预冷的PBS洗两遍，弃PBS，尽量吸干净，依照60mm皿加入100μL裂解液的比例加入裂解液。将细胞用刮刀刮下，收集细胞，放于灭菌的1.5mL的离心管中。细胞超声破碎仪破碎细胞。离心(4℃、12000rpm，15min)，取上清，转移上清液至新的离心管中。
1.3.2.2考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度：
1)配制考马斯工作液：根据样品数量，按体积比纯水：考马斯溶液＝4:1的比例将考马斯稀释成适量工作液，充分混匀。完全溶解蛋白标准品，用PBS稀释至0.5mg/mL的浓度；
2)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，PBS补足到20μL。
3)将蛋白样品以20倍稀释后取20μL到96孔板孔中。
4)各孔加入200μL考马斯工作液，于恒温微孔板震荡仪上反应(37℃，5min)。
5)酶标仪测定：测定595nm处的吸光值，根据标准曲线计算蛋白浓度。
1.3.2.3制备SDS-PAGE凝胶电泳蛋白样品
根据蛋白浓度，用PBS调整上样体积、上样总量一致，用4×的loading buffer按照4：1体积加入上样缓冲液，混匀。恒温水浴锅中95℃，5min变性，进行后续SDS-PAGE凝胶电泳分离或储存于-80℃冰箱。
1.3.2.4Western Blot
1)制胶：SDS-PAGE凝胶根据目的蛋白的分子量制备10％的聚丙烯酰胺分离胶，将配制好的凝胶液体注入玻璃板，无水乙醇200μL封胶，待分离胶凝固后配制并注入4％的浓缩胶，插入1.5mm厚度的10孔梳子。
2)电泳：装好凝胶板，加入1×电泳缓冲液，在凝胶泳道中加入蛋白预染Marker和各组样品，用BIORAD迷你型蛋白质电泳转印系统分离蛋白，从80V开始电泳，40min后转为120V继续电泳至溴酚蓝染料接近凝胶底部，停止电泳。
3)转膜：湿转法：把NC膜和4张滤纸及4张纤维垫浸泡在存有转移缓冲液(甲醇20％)的盘中，由下至上按照“2张纤维垫-2层滤纸-凝胶-NC膜-2层滤纸-2层纤维垫”的顺序做好三明治，注意排除气泡，置于转膜槽中，一侧加冰，将整个转膜槽埋于冰盆中，恒流300mA，2h转膜。
4)封闭：将膜浸在含5％脱脂奶粉或5％BSA的封闭液(用TBS-Tween缓冲液溶解)，室温慢摇1h。
5)蛋白质免疫检测：将膜封闭于含有一抗(GAPDH抗体稀释比例为1:5000；Src抗体稀释比例为1:200；Fyn抗体稀释比例为1:1000；P-Src抗体稀释比例为1:1000；P-Fyn抗体稀释比例为1:1000；Occulidin抗体稀释比例为1:1000；VE-Cadherin抗体稀释比例为1:1000)的孵育盒中，置于洗脱摇床上，4℃孵育过夜，然后用TBS-T缓冲液快速洗膜5min×3次；再将膜封入HRP偶联的二抗(稀释比例均为1:5000)孵育盒中，室温慢摇1h；用TBS-T缓冲液快速洗膜5min×4次。
6)底物化学发光及显影：用纸吸干膜上的水分，平放于保鲜膜上，加ECL(A:B＝1:1配制)反应2min，用纸吸去多余的ECL，蛋白面向上，电脑不同时间曝光，并保存图片。
7)结果与分析：用凝胶分析软件Quantity One计算各条带光密度值，进行统计分析。
1.4实验结果
运用免疫印迹法实验发现，异补骨脂二氢黄酮能够浓度依赖性地抑制Src家族激酶Fyn蛋白的磷酸化(见图1)。
1.5小结：结果说明补骨脂二氢黄酮对Src激酶家族Fyn蛋白的磷酸化有浓度依赖性的抑制作用。
实施例2.异补骨脂二氢黄酮直接抑制Src激酶活性
2.1目的：观察异补骨脂二氢黄酮能否直接抑制Src激酶家族Src激酶酶活性。
2.2实验材料
2.2.1实验试剂
2.2.1.1试剂盒：Src Kinase Enzyme System(美国Promega V2921)；ADP-GloKinase Assay(美国Promega V9101)；异补骨脂二氢黄酮购自上海源叶生物有限公司。
2.2.2实验仪器
96孔细胞培养板(美国Corning公司)，全波长扫描式多功能读数仪(VarioskanFlash，Thermo scientific，美国)。
2.3实验方法
2.3.1Src激酶活性测试
Src激酶活性直接测定参照ADP-GloTM Kinase Assay+Src Kinase Enzyme System(美国Promega V9741)说明书。
1)分别用缓冲液稀释酶(Src 100ng/μL、底物(Poly(Glu4,Tyr1)0.2μg/μL)、ATP(10μM)，并且加入IBA(0.016，0.08，0.4，2，10，50，250μM)。
2)向96孔板中每孔加入5μL药物(对照组加入5μL溶剂)、10μL酶、10μL底物/ATP混合物。
3)室温孵育60分钟。
4)加入25μLADP-GloTM Reagent。
5)室温孵育40分钟。
6)加入50μLKinase Detection Reagent。
7)室温孵育30分钟。
8)在全波长扫描式多功能读数仪(Varioskan Flash，美国Thermo scientific)上每间隔1秒检测其化学发光信号值。
2.4实验结果
在激酶的酶活性测定中，异补骨脂二氢黄酮使用浓度为16nM～250μM。如表1所示,异补骨脂二氢黄酮浓度依赖性地抑制Src激酶的活性，其IC50值为17.286μM(又见图2)。
表1异补骨脂二氢黄酮对重组蛋白Src激酶的酶活性抑制效果结果统计
2.5小结：异补骨脂二氢黄酮在体外对重组Src激酶有直接抑制作用。
实施例3.异补骨脂二氢黄酮抑制大鼠MCAO脑缺血模型脑梗塞损伤
3.1目的 观察异补骨脂二氢黄酮在体内药物效果
3.2实验材料
3.2.1实验试剂
戊巴比妥钠、多聚甲醛、DMSO：国药集团化学试剂有限公司；生理盐水：0.9％氯化钠注射液；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)：Sigma；MCAO栓线(北京西浓科技有限公司)；手术器械(上海医疗器械有限公司)。
3.3实验方法
3.3.1实验动物分组与给药
雄性SD大鼠120只，SPF级，体重260-270g，按照随机区组分为6组，每组20只。分为假手术组、模型组、异补骨脂二氢黄酮(IBA)高剂量组(100μg/kg)、异补骨脂二氢黄酮中剂量组(50μg/kg)、异补骨脂二氢黄酮低剂量组(25μg/kg)、Src阻断剂PP2组(30μg/kg)。
3.3.2大鼠MCAO模型的制备
所有实验动物在动物房饲养一周，适应环境，室内温度25℃±2℃，湿度50±10％，自由饮食，昼夜交替，避免不良刺激。实验前禁食不禁水。采用Zea-Longa改良线栓法制备大鼠左侧MCAO模型。3％戊巴比妥钠(39mg/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠固定在鼠板上，剪去颈部绒毛，在旁正中切口处切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露左侧颈总动脉(CCA)，并在左颈外动脉(ECA)远端1cm处进行分离、结扎ECA分支，在近CCA分叉处结扎ECA，于CCA近心端夹一动脉夹，将丝线在ECA近分叉处打结，勿收紧线结，将线栓轻轻插入，收紧线结，松开动脉夹，将线栓顺ECA经ICA送入颅内，直到感到有轻微抵抗为止，收紧丝线，缝合大鼠切口。缺血1h后，轻轻将线栓退出至有阻力感，使其头端回到CCA分叉处，即可使大脑中动脉恢复血供，实现再灌注，至此左侧MCAO模型制备完成。假手术组只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管，也不插入线栓。术后大鼠保温，自由饮食。注意观察大鼠呼吸状况。
3.3.3测定脑梗死体积
大鼠神经功能缺陷评分完成后，每组实验随机取6只大鼠。20％乌拉坦(350mg/kg)腹腔注射麻醉取脑，-80℃速冻7min，切除额极和枕极，取冠状面将整脑均匀切成6张薄片，每张约2mm厚，置于事先配置好的1％TTC溶液中，37℃避光孵育16min，显色后置于4％多聚甲醛固定24h。然后用数码相机(Olympus，日本)照相，图像输入计算机，采用图像处理软件(Image Pro Plus,IPP 6.0)计算脑梗死面积(正常脑组织为粉红色，梗死区为白色)，根据公式v＝t(A1+A2+A3+A4+A5+A6)计算脑梗死体积，其中t为脑片厚度，A为梗死面积。
本研究采用梗死体积占全脑体积百分值(v％)表示。
V％＝梗死体积/全脑体积x100％。
3.4实验结果
如表2所显示，异补骨脂二氢黄酮在体内在不同给药水平均抑制大鼠MCAO脑缺血模型脑梗塞损伤体积(每组n＝20)。Src激酶阻断剂PP2(30μg/kg)显示了相似的抑制效果(又见图3)。
表2异补骨脂二氢黄酮不同给药剂量对大鼠MCAO模型脑梗死体积的结果统计
3.5小结：与Src激酶阻断剂PP2相似，异补骨脂二氢黄酮也具有抑制大鼠MCAO脑缺血模型脑梗塞损伤体积。
实施例4.异补骨脂二氢黄酮抑制MCAO脑缺血模型脑内血管内皮细胞Fyn和Src激酶的磷酸化
4.1目的:观察在体内异补骨脂二氢黄酮能否具有抑制Fyn和Src激酶的磷酸化的能力
4.1.1实验材料
4.1.1.1实验试剂
4.1.1.1.1抗体：Anti-Src antibody(ab7950)、Anti-Fyn antibody[FYN-01](ab1881)、Anti-Src(phospho Y529)antibody[Y232](ab32078)、Anti-Fyn(phospho Y530)antibody(ab182661)购自abcam公司、HRP-conjugated Monoclonal Mouse Anti-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease(GAPDH，KC-5G5)购自上海康成生物有限公司；Goat anti-rabbit IgG-HRP(sc-2004)、Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)均购自SANTA CRUZ公司。
4.1.1.1.2试剂：戊巴比妥钠、多聚甲醛、DMSO：国药集团化学试剂有限公司；生理盐水：0.9％氯化钠注射液；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)：Sigma；MCAO栓线(北京西浓科技有限公司)；手术器械(上海医疗器械有限公司)；RIPA裂解液(弱，P0013D)、Triton X-100/曲拉通X-100(ST795)、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所，十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、β-巯基乙醇、甘氨酸(Glycine)、Tris碱、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺(ammonium persulfate，APS)、四甲基乙二胺(tetramethylenediamine，TEMED)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、Tween-20均购自Sigma公司；PageRulerTM Prestained Protein Ladder(#SM0671)购自Fermentas公司；ECL Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(WBKLS0500)购自Millipore公司；蛋白质转印膜(硝酸纤维素膜，NC膜)购自美国Pall公司。
4.2实验方法
4.2.1实验动物分组与给药
雄性SD大鼠30只，SPF级，体重260-270g，随机区组分为3组，每组10只。组别分别是假手术组、模型组、异补骨脂二氢黄酮50μg/kg组。
4.2.2大鼠MCAO模型的制备方法同实施例3.3.2节。
4.2.3大鼠MCAO模型脑内血脑屏障微血管内皮细胞的富集
1)大鼠脱颈椎处死，打开颅腔取出全脑，放于D-Hanks液中，去除小脑、间脑(包括海马)，用D-Hanks液漂洗3次，于15ml离心管，150g，3min。
2)每侧皮质加入2m1BBB分离液(分离液:蛋白酶抑制剂:PMSF＝100:4:1)，冰上轻缓匀浆，上下10次即可，切记不可用力研磨，以免血管碎裂破坏。
3)匀浆倒入10ml离心管中，再用2m1BBB裂解液冲洗匀浆器。
4)所有匀浆4度离心，5600g/10min。
5)沉淀加入2ml 26％葡聚糖，振荡1min,5600g/10min离心。
6)剪去离心管上层脂质，留下红色血管层沉淀。
7)用1ml BBB裂解液冲洗沉淀，吸取时注意枪头上吸附的血管。
8)5600g/10min离心，下层沉淀加入200ul BBB裂解液，振荡混匀后-20度裂解1小时。
9)超声裂解，将样本超声2min，离心14000rpm/min，15min。
10)吸取上清，蛋白定量备用。
4.2.4蛋白免疫印迹分析同实施例1.3.2节。
4.3实验结果
运用免疫印迹法显示，异补骨脂二氢黄酮能够抑制MCAO脑缺血模型脑内血管内皮细胞的Fyn和Src激酶的磷酸化(见图4)。
4.4小结异补骨脂二氢黄酮能够在体内抑制Src激酶家族Fyn和Src激酶的磷酸化。
实施例5.异补骨脂二氢黄酮抑制脑组织的Fyn和Src激酶的磷酸化
5.1目的：观察异补骨脂二氢黄酮在体内是否能够抑制脑组织的Fyn和Src激酶的磷酸化
5.2实验材料
5.2.1实验试剂同实施例4.1
5.2.2实验动物分组与给药同实施例4.2
5.3实验方法
5.3.1免疫组织化学染色
5.3.1.1石蜡切片制作
1)固定：处理大鼠脑组织，用PBS冲洗，放入4％多聚甲醛内固定24h。
2)脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗三次，再用50％、70％、80％、95％酒精和无水酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水。
3)透明：无水酒精和二甲苯1:1比例，45min，二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)各30min。
4)包埋：浸入石蜡，包埋组织。
5)切片：包埋后的组织用切片机切成5-7μm。
6)贴片：将组织蜡块在水中展开，载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上。
7)烤片：68℃恒温箱内烤片。
5.3.1.2S-P免疫组化染色
1)石蜡切片置于60℃烤箱烘烤30分钟；2)将切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各脱蜡30分钟；3)切片按顺序浸入100％、100％、95％、95％、90％梯度酒精中水化各1分钟，然后置于超纯水中待用；4)配制柠檬酸盐抗原修复液，将切片放入，使其沸腾，室温下冷却；5)纯水冲洗1次，PBS冲洗3分钟3次；6)3％H2O2处理10分钟，PBS洗3次,3min/次。7)10％正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。弃血清，滴加一抗p-Fyn(1:1000)，37℃孵育1～2小时或4℃过夜；8)PBS洗3次，2min/次；9)滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min；10)PBS洗3次，2min/次；11)滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30min；12)PBS洗3次，2min/次；13)显色剂显色(DAB或AEC)；14)自来水冲洗，复染，脱水透明,用中性树胶封片，显微镜下观察染色效果。对照设计：设计空白对照代替一抗，其他步骤相同。
5.3.2免疫荧光染色
将切好的切片从-80℃冰箱放至-20℃冰箱中约4小时，再放至4℃冰箱泡在PBS中，使大鼠脑处于正常状态下。蔗糖-二甲胂酸盐缓冲液(0.1M二甲胂酸钠，0.1M蔗糖，0.25％戊二醛)固定15分钟。PBS清洗一次。0.5％Triton X-100透化处理5-15min。PBS洗5次，5min/次。滤纸吸干周围液体，免疫组化笔将切片处画圈，滴加封闭液(10％血清)约100μL，湿盒中封闭2小时。用封闭液稀释荧光抗体。封闭完后，弃去封闭液，滴加一抗p-Src(1:1000)，室温孵育2小时或4℃孵育过夜。PBS洗5次，5min/次。加二抗避光孵育1小时。PBS洗5次，5min/次。滴加封片液(甘油：PBS＝9:1)，避光拍照。
5.4实验结果
脑组织切片免疫化学染色和荧光染色显示，在MCAO脑缺血模型中，异补骨脂二氢黄酮能够抑制脑内组织中的Src激酶家族Fyn和Src激酶的磷酸化(见图5)。
5.5小结：同实施例4相同，异补骨脂二氢黄酮能够在体内抑制Src激酶家族Fyn和Src激酶的磷酸化。
实施例6.异补骨脂二氢黄酮及其类似结构化合物具有相似的抑制Src激酶家族Fyn和Src激酶的磷酸化的能力
6.1目的：观察相似结构化合物是否与异补骨脂二氢黄酮相似具有抑制Src激酶家族Fyn和Src激酶的磷酸化的能力。
6.1实验材料
6.1.1实验试剂
6.1.1.1细胞株：HUVEC细胞株购自美国ATCC公司(HUVEC,CRL-1730)。
6.1.1.2抗体：HRP-conjugated Monoclonal Mouse Anti-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease(GAPDH，KC-5G5)购自上海康成生物有限公司；Goat anti-rabbitIgG-HRP(sc-2004)、Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)均购自SANTA CRUZ公司；Anti-Src antibody(ab7950)、Anti-Fyn antibody[FYN-01](ab1881)、Anti-Src(phospho Y529)antibody[Y232](ab32078)、Anti-Fyn(phospho Y530)antibody(ab182661)购自abcam公司。
6.1.1.3试剂：RIPA裂解液(弱，P0013D)；苯甲基磺酰氟PMSF(100mM，ST506)均购自碧云天生物技术研究所；十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、β-巯基乙醇、甘氨酸(Glycine)、Tris碱、丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、过硫酸胺(ammonium persulfate，APS)、四甲基乙二胺(tetramethylenediamine，TEMED)、牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)、Tween-20均购自Sigma公司；ECL Immobilon Western ChemiluminescentHRP Substrate(WBKLS0500)购自Millipore公司；蛋白质转印膜(硝酸纤维素膜，NC膜)购自美国Pall公司；细胞培养基DMEM低糖，FCS，0.25％胰蛋白酶均购自美国GIBCO；氨苄青霉素(A6140)、AngⅡ、DMSO购自Sigma；EDTA购自上海生物工程；异补骨脂二氢黄酮购自上海源叶生物有限公司。
6.1.2实验仪器同实施例1.2
6.2实验方法同实施例1.3
6.3实验结果
运用免疫印迹法测试显示，光甘草宁、异补骨脂二氢黄酮均具有抑制Src激酶家族Src和Fyn激酶蛋白磷酸化的作用(见图6)。
6.4小结：异补骨脂二氢黄酮及其类似物均具有抑制Src激酶家族Fyn和Src激酶的磷酸化的能力。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。

Claims (1)

1.下列化合物或其药学上可接受的盐在制备防治脑梗塞的药物中的用途：
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