CN105954315A - 一种测定双组份脂质体相转变温度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定双组份脂质体相转变温度的方法,利用动态光散射法测定双组份脂质体的散射光强对温度的变化,进而计算脂质体的相转变温度的方法;测定某种脂质体的散射光强与温度的关系曲线,所得曲线中斜率最大时所对应的温度即为脂质体的相转变温度。本发明利用动态光散射法测定双组份脂质体的散射光强对温度的变化,进而计算脂质体的相转变温度的方法,拓展了粒度分析仪在测定脂质体相转变温度上的应用;用动态光散射法测定某种脂质体的散射光强与温度的关系曲线,所得曲线中斜率最大时所对应的温度即为脂质体的相转变温度,能够准确地测定脂质体的相转变温度,并具有灵敏度高、耗样量低、无扰检测和操作方便的优点。
Description
技术领域
本发明属于脂质体分析技术领域,尤其涉及一种测定双组份脂质体相转变温度的方法。
背景技术
脂质体具有类似于细胞膜的双层磷脂分子结构,能够方便地包封亲水或者疏水药物,因此是一类具有良好生物相容性的抗癌药物载体。目前市场上已经有多种商品化脂质体制剂应用于癌症治疗,如(Ben Venue Laboratories,Inc Bedford,OH)和(Celsion Corporation,Lawrenceville,NJ)等。而温度敏感型脂质体(TSL)利用肿瘤组织的温度比正常组织高的特点,能够降低抗肿瘤药物对正常组织的毒副作用,有效杀死肿瘤组织。TSL的响应温度与其相转变温度密切相关。性能优异的TSL应当在其相转变温度以下时内容物泄露较慢较少,而在相转变温度以上时内容物泄露较快较多。TSL的相转变温度一般由其组成决定,与其中所含脂质分子的主转变温度以及脂质分子之间的相对比例有关。尽管常见的脂质分子的转变温度已知,但是用作药物载体的TSL,其脂质成分通常不少于两种,因此脂质体的相转变温度需要用仪器进行准确测定。
目前测量脂质体相转变温度的主流方法是高灵敏度差示扫描量热法(Micro-DSC)。Micro-DSC通过测定相转变时的焓变来确定相转变温度。尽管Micro-DSC具有高灵敏度,但脂质体的相转变的焓变值非常小,因此一般要求样品的量不少于1μmol(浓度不小于2mM,体积不小于0.5mL)。而且Micro-DSC的价格较为昂贵,只有少数高校和科研院所具备Micro-DSC。因此发展一种更加经济的、方便的、准确的测定脂质体相转变温度的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定双组份脂质体相转变温度的方法,旨在解决目前测量脂质体相转变温度方法存在脂质体的相转变焓变值非常小,成本较高的问题。
本发明是这样实现的,一种测定双组份脂质体相转变温度的方法,所述测定双组份脂质体相转变温度的方法利用动态光散射法测定双组份脂质体的散射光强对温度的变化,进而计算脂质体的相转变温度的方法;利用动态光散射法测定某种脂质体的散射光强与温度的关系曲线,所得曲线中斜率最大时所对应的温度即为脂质体的相转变温度。
进一步,所述测定双组份脂质体相转变温度的方法包括以下步骤:
步骤一,对待测的脂质体样品在某一温度以上进行退火热处理,得到处于热力学稳定相态的脂质体;
步骤二,根据脂质体样品内脂质成分的相转变温度,选定所述脂质体的相转变温度范围;
步骤三,根据上述相转变温度范围,详细测定脂质体的散射光强I,用sigmoid四参数方程对测得的散射光强-温度曲线进行拟合,并对所得曲线进行求导,得到导数方程,并绘制测量温度范围内的导数曲线;测量温度范围内,二阶导数为0的温度即为所述脂质体的相转变温度;散射光强-温度曲线中光强下降时对应的温度范围为相转变温度范围。
进一步,所述步骤一中进行退火热处理的温度优选高于脂质体内转变温度最高的脂质成分的转变温度。
进一步,所述步骤二中,温度范围为转变温度最低的脂质成分的固有转变温度以下5℃到转变温度最高的脂质成分的固有转变温度以上5℃。
进一步,所述步骤三中使用sigmoid方程进行拟合:
其中,T为温度,I0、T0、a和b为拟合参数。
本发明提供的动态光散射(DLS)测定双组份脂质体相转变温度的方法,与传统的差示量热扫描法(DSC)相比,具有操作方便和灵敏度高的优点,适合推广使用。DLS测量样品相变温度的原理主要基于脂质体内的脂质分子在相变温度附近从凝胶相进入液晶相,磷脂排列变得松散,导致光强下降,从而可以根据光强的降低计算样品的相变温度。而DSC测量样品相变温度的原理是基于脂质体在相变温度附近发生焓变,通过测定焓变推算脂质体的相变温度。由于脂质体相变时焓变值比较低,需用灵敏度高的micro-DSC测量。从操作上看,DLS只需用一次性样品池测定固定样品溶液的光强随温度的变化,而micro-DSC需用密封性非常好的重复利用的专用样品池,该样品池需要仔细清洁,载入样品后样品池需要严格密封,其样品池中残留杂质以及样品池的非密闭性会严重影响测试结果。同时,由于DLS测试的是样品的散射光强,对样品不造成影响,样品池是一次性的,不会造成污染,因此样品可以重复利用。但是micro-DSC测试后的样品容易被样品池污染,因此样品一般不可以重复利用。从灵敏度上看,在DLS中,样品的散射光强只需达到100kcps以上,结果即可以准确测定,此时检测的样品量只有0.1mg(0.1mg/ml*1ml),而micro-DSC中最低能检测的样品量是0.5mg(样品体积500μl,样品浓度至少1mg/mL)。因此DLS法具有操作简便、无扰检测和灵敏度高的优点。本发明提供一种用动态光散射法测定双组份脂质体的散射光强对温度的变化,进而计算脂质体的相转变温度的方法,进一步地拓展了粒度分析仪在测定脂质体相转变温度上的应用;用动态光散射法测定某种脂质体的散射光强与温度的关系曲线,所得曲线中斜率最大时所对应的温度即为脂质体的相转变温度,能够准确地测定脂质体的相转变温度,并具有灵敏度高、耗样量低、无扰检测和操作方便的优点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的测定双组份脂质体相转变温度的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的实施例1脂质体DPPC/DSPC 1/3的光强随温度变化的曲线:42-57℃内的脂质体的散射光强随温度变化的曲线。
图3是本发明实施例提供的实施例2脂质体DPPC/DSPC 1/1的散射光强随温度变化的曲线:(A)41-53℃内的脂质体的散射光强随温度变化的曲线。
图4是本发明实施例提供的实施例3所得的脂质体DPPC/DSPC 3/1的散射光强随温度变化的曲线:(A)40-50℃内的脂质体的散射光强随温度变化的曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示,本发明实施例的测定双组份脂质体相转变温度的方法包括以下步骤:
S101:对待测的脂质体样品在某一温度以上进行退火热处理,得到处于热力学稳定相态的脂质体;
S102:根据脂质体样品内脂质成分的相转变温度,选定所述脂质体的相转变温度范围;
S103:根据上述相转变温度范围,详细测定脂质体的散射光强I,对测得的散射光强-温度曲线进行拟合,并对所得曲线进行求导,得到导数方程。二阶导数为0的温度即为所述脂质体的相转变温度。光强下降时对应的温度范围为相转变温度范围。
在步骤S101中,进行退火热处理的温度优选高于脂质体内转变温度最高的脂质成分的转变温度。
在步骤S102中,优选的温度范围为转变温度最低的脂质成分以下5℃到转变温度最高的脂质成分的转变温度以上5℃。
在步骤S103中,优选使用sigmoid方程(下式(1))进行拟合:
其中,T为温度,I0、T0、a和b为拟合参数。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述
实施例1
取1mL 1mM多层脂质体DPPC/DSPC 1/3(摩尔比),用恒温水浴加热样品至60℃,保持20min,关闭加热,缓慢冷却至室温,得到处于热力学稳定相态的脂质体。因为多层脂质体内存在的灰尘及微米级颗粒对测定样品的光强存在干扰,对脂质体溶液进行离心12000rpm 12min,取上清液进行测试。测定其从36℃升温至60℃的平均散射光强,每隔1℃测定一次。在每个温度点至少平衡5min才开始测量。绘制脂质体DPPC/DSPC 1/3的平均散射光强I和温度T的关系曲线,如图2。用sigmoid方程对图2中从42-57℃的数据点进行拟合。得到拟合的参数:a=19.59,b=-0.9275,T0=49.82,I0=71.63,据此求出二阶导为零时的T值,为49.8℃,即为DPPC/DSPC 1/3的转变温度。同时可直接从图1中读出光强下降的温度范围,为48-52℃。在关于脂质体的相转变温度的文献中(Shimshick et al.,Biochemistry 1973,12(12),2351-2360)提到DPPC/DSPC 1/3的转变温度范围为47-52℃。
实施例2
取1mL 1mM多层脂质体DPPC/DSPC 1/1(摩尔比),用恒温水浴加热样品至60℃,保持20min,关闭加热,缓慢冷却至室温,得到处于热力学稳定相态的脂质体。因为多层脂质体内存在的灰尘及微米级颗粒对测定样品的光强存在干扰,对脂质体溶液进行离心12000rpm 12min,取上清液进行测试。测定其从36℃升温至60℃的平均散射光强,每隔1℃测定一次。在每个温度点至少平衡5min才开始测量。绘制脂质体DPPC/DSPC 1/1的平均散射光强I和温度T的关系曲线,如图3。用sigmoid方程对图2中从42-57℃的数据点进行拟合。得到拟合的参数:a=9.828,b=-0.9631,T0=45.29,I0=53.33,据此求出二阶导为零时的T值,为45.3℃,即为DPPC/DSPC 1/1的转变温度。同时可直接从图2中读出光强下降的温度范围,为44-48℃。在关于脂质体的相转变温度的文献中(Shimshick et al.,Biochemistry 1973,12(12),2351-2360)提到DPPC/DSPC 1/3的转变温度范围为44-48℃。
实施例3
取1mL 1mM多层脂质体DPPC/DSPC 3/1(摩尔比),用恒温水浴加热样品至60℃,保持20min,关闭加热,缓慢冷却至室温,得到处于热力学稳定相态的脂质体。因为多层脂质体内存在的灰尘及微米级颗粒对测定样品的光强存在干扰,对脂质体溶液进行离心12000rpm 12min,取上清液进行测试。测定其从36℃升温至60℃的平均散射光强,每隔1℃测定一次。在每个温度点至少平衡5min才开始测量。绘制脂质体DPPC/DSPC 3/1的平均散射光强I和温度T的关系曲线,如图4。用sigmoid方程对图2中从40-50℃的数据点进行拟合。得到拟合的参数:a=20.61,b=-1.152,T0=43.19,I0=63.39,据此求出二阶导为零时的T值,为43.2℃,即为DPPC/DSPC 3/1的转变温度。从图4中读出光强下降的温度范围为40-48℃。此温度范围比文献值(42-44℃,Shimshick et al.,Biochemistry 1973,12(12),2351-2360)宽,可能是由于脂质体在此温度范围内发生了预转变。总
本发明提供一种对脂质体的相转变温度进行测定的方法。对于本发明所涉及的脂质体,并无特别限制,可使用由马尔文公司以Zetasizer nano商品名销售的Zetasizer nano 9S、Zetasizer nano S、Zetasizer nano ZS、Zetasizer nano ZSP等型号的粒径仪或者布鲁克海文公司以ZetaPALS商品名销售的粒径仪。本发明所使用的术语“热力学稳定相态”是指在相态形成过程中的过渡态或者中间体(生成物质),其能量(化学位)是较低的,没有自发的继续转变为其它相态的趋势。处于热力学稳定相态的脂质体具有稳定的相态性质,便于进行相转变温度的测试;为获得热力学稳定相态,需进行退火热处理。退火热处理是本领域技术人员熟知的操作,其作用为消除脂质体存在的热力学不稳定的相态。在本发明中,退火热处理可采用如下条件进行:用恒温水浴将脂质体加热到相转变温度最高的脂质成分的相转变温度以上5℃,保持20分钟。停止加热水浴,让脂质体在水浴中逐渐降温到室温,降温过程大约需要1个小时。为了得到准确的光强测定数据,需要对保证脂质体尽量无尘以及不存在微米级颗粒。因此在本发明中,对合成的多层脂质体溶液进行离心12000rpm 12min,取上清液进行测试。同时,除去多层脂质体内的灰尘和微米级颗粒也可通过超声法结合离心法或者挤出法进行。光散射现象常被用于对粒子尺寸的性质进行测量,然而发明人发现,脂质体在相转变温度处会发生散射光强骤降的现象,这一现象可能是由于脂质体内脂质组分的分子排列发生了变化。在脂质体发生相转变时,脂质体从固体相(solid phase)转为流动相(fluid phase),脂质分子的排列变得松散,从而使得脂质体的比折射率(dn/dc)降低,而dn/dc的平方与散射光强成正比,因此脂质体发生相转变时,光强会随之降低。可通过本领域技术人员熟知的方式进行光散射测试。通常,散射光强可以在粒度分析仪上进行。粒度分析仪在各高校和研究所已经得到普遍的应用,对样品测试后可以得到样品的尺寸、尺寸分布和散射光强等信息,但大多数研究人员只关注尺寸和尺寸分布的信息,不重视样品的散射光强的信息。散射光强还可通过激光光散射仪、凝胶渗透色谱(GPC)所配置的激光光散射检测器等仪器进行。
在本发明中,通过使用粒度分析仪获得散射光强度信息,并对这一数据进行拟合,所述拟合使用专门拟合S形曲线的Sigmoid公式:
(其中I为测量光强,T为测量温度,a、b、T0和I0为拟合参数。应用sigmaplot软件对数据使用上述Sigmoid公式拟合,可以直接得到四个拟合参数。)
在得到拟合公式后,对该公式进行二次求导,二阶导数为零时的T值即为相转变温度。根据散射光强的曲线形状,散射光强急剧下降的温度范围即为脂质体的相转变温度范围。但是,在偏低温度时(低于较低转变温度的脂质体的转变温度时),脂质体的光强可能由于预转变的存在而发生光强降低,此过程不同于经历本发明中所指的相转变的过程。同时,理论上双组份脂质体的相转变温度介于两种脂质成分的相转变温度之间。因此,在偏低温度时发生的光强降低过程不在本发明的研究范围之内,在拟合数据时不应当考虑这部分数据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种测定双组份脂质体相转变温度的方法,其特征在于,所述测定双组份脂质体相转变温度的方法利用动态光散射法测定双组份脂质体的散射光强对温度的变化,进而计算脂质体的相转变温度的方法;利用动态光散射法测定某种脂质体的散射光强与温度的关系曲线,所得曲线中斜率最大时所对应的温度即为脂质体的相转变温度。
2.如权利要求1所述的测定双组份脂质体相转变温度的方法,其特征在于,所述测定双组份脂质体相转变温度的方法包括以下步骤:
步骤一,对待测的脂质体样品在某一温度以上进行退火热处理,得到处于热力学稳定相态的脂质体;
步骤二,根据脂质体样品内脂质成分的相转变温度,选定所述脂质体的相转变温度范围;
步骤三,根据上述相转变温度范围,详细测定脂质体的散射光强I,用sigmoid四参数方程对测得的散射光强-温度曲线进行拟合,并对所得曲线进行求导,得到导数方程,并绘制测量温度范围内的导数曲线;测量温度范围内,二阶导数为0的温度即为所述脂质体的相转变温度;散射光强-温度曲线中光强下降时对应的温度范围为相转变温度范围。
3.如权利要求2所述的测定双组份脂质体相转变温度的方法,其特征在于,所述步骤一中进行退火热处理的温度优选高于脂质体内转变温度最高的脂质成分的转变温度。
4.如权利要求2所述的测定双组份脂质体相转变温度的方法,其特征在于,所述步骤二中,温度范围为转变温度最低的脂质成分的固有转变温度以下5℃到转变温度最高的脂质成分的固有转变温度以上5℃。
5.如权利要求2所述的测定双组份脂质体相转变温度的方法,其特征在于,所述步骤三中使用sigmoid方程进行拟合:
其中,T为温度,I0、T0、a和b为拟合参数。
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