CN105928921A - 一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法，首先对细胞进行BCECF‑AM染色，分别获取458nm和488nm下的荧光染色图片；配制pH值位于5.0‑7.0的至少五种不同的荧光液泡处理液，分别对不同pH的荧光液泡处理液直接进行荧光拍照，选取同一pH值的两种激发波长下的两张照片中相同的点，计算488nm/458nm的荧光比值；结合不同的pH值，做成荧光标准曲线；在matlab软件程序界面执行程序操作，得到488nm/458nm数字化图片，图片上的每一个点的颜色都指示一个pH值，根据颜色标尺，读出相对应的细胞pH值。通过此种方法，获得488nm/458nm数字化图片，可快速、直观、全面系统地分析胞内pH值，而且，大大节约了成本，可以方便广大生物学研究人员使用，具有较大的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其是涉及一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法。
背景技术
细胞内pH是细胞生理活动的重要调节因素，胞内pH值不仅能调节酶活性和一些重要的代谢过程，细胞内许多生理活动如ATP合成、DNA复制、RNA和蛋白质合成以及细胞生长等也都受胞内pH值的调节。一般来说，大多数植物的细胞质中pH值接近中性，液泡内pH值维持在5.0-6.5范围内。植物细胞适时地进行胞内pH值调控是所有生活细胞的一个重要特征，胞内pH值是目前研究细胞功能的重要参数。因此，快速、准确、动态、无损伤地观测胞内pH值对于深入研究细胞代谢与胞内pH值关系以及相关作用机制有重要意义。
细胞荧光染色，是生物学中最常见的方法，也是解析生物学功能的最常用手段。pH值荧光染料有多种，以荧光染料BCECF为例，此方法的原理是：非荧光、亲脂性的BCECF—AM分子能自由跨膜扩散进入细胞，在细胞内酯酶作用下，AM基团水解，形成亲水、能发荧光的BCECF分子，其荧光强度依赖于细胞内pH值。BCECF的荧光强度可采用特定的仪器(激光共聚焦显微镜或流式细胞仪)检测，再根据离体或活体校准曲线，即可得出所测细胞胞内的pH值。
这种方法操作相对简单，能够实时监测细胞内pH值变化，不受细胞浓度的限制，重复性好，可以同时测定细胞内多个位点的pH值。但是，在此过程中，对于荧光图像的分析，常常决定数据结果的准确性。特别地，由于一些荧光染料的性质，直接的激发荧光不能体现出其指示功能，而在两种激光的激发下的荧光比值，才能反映功能。如细胞内pH荧光染料BCECF，它只有在488nm激发波长下的荧光与458nm激发波长下的荧光比值才与pH有线性关系。目前，可以用激光共聚焦显微镜来获取488nm和458nm的荧光图片；但是，如何获取两个荧光的比值，目前只能购买国外昂贵的软件来完成，过程繁琐，且成本太高。
发明内容
本发明的目的是针对目前利用荧光染料法测定胞内pH值过程繁琐且成本高的现状提供一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法。
本发明涉及的一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法，包括以下步骤：
步骤一、细胞荧光染色图片的获取
取待测叶片，剪成块状，浸泡在BCECF-AM染色液中1h，制备玻片标本；将玻片标本置于激光共聚焦显微镜下观察，获取激发波长分别为458nm和488nm的荧光染色图片；
步骤二、荧光标准曲线的制作
配制pH位于5.0-7.0的至少五种不同的荧光液泡处理液，在488nm和458nm激发波长下分别对不同pH的荧光液泡处理液直接进行拍照；利用imageJ软件，选取同一pH的488nm和458nm激发波长下的两张照片中相同的点，计算488nm/458nm的荧光比值；结合不同的pH值，做成荧光标准曲线；
步骤三、荧光图片的数字化
在matlab软件程序界面用计算机语言执行以下操作：
（1）读入488nm和458nm激发下的荧光图像，分别定义为image1和image2；
（2）在matlab图像界面上，建立2行2列的图像位置布局；
（3）将image1和image2分别显示为第1个和第2个子图；
（4）将image1和image2转换为灰度图，分别显示为第3个和第4个子图；
（5）获取image1和image2的像素长和宽，将像素图形成数字化图片；
（6）利用标曲，获取image1和image2的亮度值比值并进行修正得到image3，image3即为image1和image2亮度比值的矩阵；
（7）X坐标和Y坐标分别为图片的长和宽，以image3的值为Z坐标用surf函数进行三维表面图绘制；
（8）在界面上为image3添加颜色控制条；
（9）调用hsv系统色图绘制image3的三维着色表面图，对image 3上面每一个像素点赋予数字化颜色，并根据image3的比值调整Z坐标到区间[5,8.5]；显示颜色标尺；
（10）调整image3图片的边框和大小，并存储到硬盘中；
（11）在界面上显示最终形成的重合对比数字化图片；
执行上述操作，得到488nm/458nm数字化图片，根据颜色标尺，读出相对应的细胞pH值。
进一步的，步骤一所述的待测叶片被剪成5 mm × 5 mm的块状。
进一步的，步骤一所述的BCECF-AM染色液中含20µmol/L BCECF-AM，50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和 50mmol/L 醋酸铵，余量为水。
进一步的，步骤二所述的荧光液泡处理液中含20µmol/L BCECF，50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和 50mmol/L 醋酸铵，余量为水；pH为5.7、5.8、6.1、6.3、6.5、6.7、6.9和7.0。
作为一种优选，所述的待测叶片为烟草叶片。
有益效果：本发明是基于激光共聚焦显微镜和matlab软件的使用，利用BCECF-AM对细胞进行染色，获取488nm和458nm的荧光染色图片，采用本发明所述的程序步骤进行操作，将荧光图片数字化，从而进行细胞pH值的计算。通过这种方法，可快速、全面系统地分析胞内pH值；BCECF与matlab程序的结合，相比于用付费软件获取两个荧光比值的方法，此方法更为直观、简单、方便，而且，大大节约了成本，可以方便广大生物学研究人员使用，具有较大的实用性。
附图说明
图1 是 pH 6.4时烟草叶片细胞的荧光结果图；从左到右依次为458nm、488nm及488nm/458nm数字化的荧光结果，最右侧为pH值为6.0-6.5的颜色标尺，其中，箭头所指为液泡；
图2是pH 6.8时烟草叶片细胞的荧光结果图；从左到右依次为458nm、488nm及488nm/458nm数字化的荧光结果，最右侧为pH值为6.5-7.0的颜色标尺，其中，箭头所指为液泡。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法进行说明。
实施例1：通过细胞荧光染色图片数字化对目标pH值的烟草细胞进行pH测定，包括以下步骤：
步骤一、获取目标pH值的烟草细胞
配制目标pH值的细胞BCECF-AM染色液：20µmol/L BCECF-AM，50mmol/L HEPES和50mmol/L 醋酸铵，pH值为6.4。取烟草叶片，剪成5 mm × 5 mm的区段，浸泡在BCECF-AM染色液中1h，通过醋酸铵的渗透作用，完成液泡内pH的置换，形成目标pH的烟草细胞。
步骤二、获取目标pH烟草细胞的荧光染色图片
将经BCECF-AM染色的细胞pH为6.4的烟草叶片进行制片，利用激光共聚焦显微镜，激发波长分别为458nm和488nm，物镜调至40倍时进行荧光观察和拍照，获取荧光染色图片，将458nm波长下的荧光图片命名为458.jpg，将488nm波长下的荧光图片命名为488.jpg，。
其中，BCECF-AM，化学式是C26H22O6，即2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein,acetoxymethyl ester，BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被留在细胞内，BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光；
其中，HEPES，即 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，对细胞无毒性作用；
步骤三、荧光标准曲线的制作
配制pH分别为5.7、5.8、6.1、6.3、6.5、6.7、6.9和7.0的荧光液泡处理液，在488nm和458nm激发波长下分别对溶液进行荧光拍照；利用imageJ软件，选取同一pH的488nm和458nm激发波长下两张照片中相同的点，计算488nm/458nm的荧光比值，结合不同的pH值，做成荧光标准曲线。
所述的荧光液泡处理液中含20µmol/L BCECF，50mmol/L HEPES 和 50mmol/L 醋酸铵，余量为水；
步骤四、荧光图片的数字化
在matlab软件程序界面输入下述语言：
image1=imread('488.jpg'); % 读入图像（将488nm激发下的图像命名为488.jpg）
image2=imread('458.jpg'); % 读入图像（将458nm激发下的图像命名为458.jpg）
figure(1);
subplot(2,2,1);
imshow(image1),title('(a) 原图1');
subplot(2,2,2)
imshow(image2),title('(b) 原图2');
subplot(2,2,3)
image1=rgb2gray(image1);imshow(image1),title('灰色图1');
subplot(2,2,4)
image2=rgb2gray(image2);imshow(image2),title('灰色图2');
[width1,height1,color1]=size(image1);
[width2,height2,color2]=size(image2);
image3=(double(image1./image2)+ double(0*ones(width1,height1)))/1.175 （标曲为pH（即image3）= （1/1.175）*（比值（488nm/458nm）+t（截距，本案为0））
mean2(image3)
x=1:height1;y=1:width1;[X,Y]=meshgrid(x,y);% surf(X,Y,double(image3));colorbar('YTickLabel',{'Freezing','Cold','Cool','Neutral','Warm','Hot','Burning','Nuclear'}) % t 数据为之前所load的数据
figure;%surf(X,Y,double(image3));
image3=pcolor(X,Y,image3);
%colormap('autumn');
%colorbar
mm=[0/255,0/255,0/255
251/255,241/255,129/255
19/255,237/255,65/255
0/255,0/255,255/255
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255/255,0/255,0/255
255/255,255/255,255/255];
colormap(colormap(hsv))
%contourf(AA(:,:,i));
axis([min(x(:)) max(x(:)) min(y(:)) max(y(:))]);
% axis off
caxis([5 8.5]); %caxis manual
map=colormap;
colorbar;
%xlabel('x');ylabel('y');zlabel('image4');az = 0;el =- 90;view(az, el);%el=-90意味着从z轴负方向往其正方向看
shading interp;
%set(gcf,'color','none');%使边框为空
%set(gcf,'paperpositionmode','auto');%保存图片时，matlab会调整图片大小，设置为auto，matlab就不会自动调整图片大小了。
%axis([0 1024 0 1024])
%set(gca,'position',[0 0 1 1]);%去掉周围的边框
%B=imresize(gca, [500 500]);
saveas(gcf,'image4.jpg','jpg');
%print(gcf,'-djpeg','-r1024','c:/1.jpg')
%imwrite(B,'filename.GIF');
%image5=imread('epx.GIF'); % 读入图像
%figure;
%imshow(image5),title('重合图');
%hold on;
%image4=imread('3.jpg'); % 读入图像
%figure;
%imshow(image4),title('重合图');
所述的语言程序中，针对不同事件，两个激发波长下照片的名字，以及标准曲线的输入，是需要更改的参数，其余的都不需要变动。
步骤五、数字化荧光染色图片的结果与分析
通过执行步骤四所述的程序对pH为6.4的烟草细胞荧光染色图片进行数字化，得到488nm/458nm数字化后的图片，如图1所示，图中从左到右依次为458nm、488nm及488nm/458nm数字化的荧光结果，最右侧为pH值为6.0-6.5的颜色标尺，由图中可以看出，经数字化后，每一个点的颜色都指示一个pH值。箭头所指为液泡，结合颜色标尺可以看出，液泡区域的pH值约为6.4。由此可知，采用本发明方法对用pH 6.4荧光处理液处理一个小时后的烟草叶片进行细胞pH值计算，pH值测定结果约为6.4，计算结果准确。
实施例2：通过细胞荧光染色图片数字化对目标pH值的烟草细胞进行pH测定，包括以下步骤：
步骤一、获取目标pH值的烟草细胞
配制目标pH值的BCECF-AM染色液：20µmol/L BCECF-AM，50mmol/L HEPES和 50mmol/L醋酸铵，pH值为6.8。取烟草叶片，剪成5 mm × 5 mm的区段，浸泡在BCECF-AM染色液中1h，通过醋酸铵的渗透作用，完成液泡内pH的置换，形成目标pH的烟草细胞。
步骤二、获取目标pH烟草细胞的荧光染色图片
将经BCECF-AM染色的细胞pH为6.8的烟草叶片进行制片，利用激光共聚焦显微镜，激发波长分别为458nm和488nm，物镜调至40倍时进行荧光观察和拍照，获取荧光染色图片，将458nm波长下的荧光图片命名为458.jpg，将488nm波长下的荧光图片命名为488.jpg，。
步骤三、荧光标准曲线的制作
配制pH分别为5.7、5.8、6.1、6.3、6.5、6.7、6.9和7.0的荧光液泡处理液，在488nm和458nm激发波长下分别对溶液进行荧光拍照；利用imageJ软件，选取同一pH的488nm和458nm激发波长下两张照片中相同的点，计算488nm/458nm的荧光比值，结合不同的pH值，做成荧光标准曲线。
所述的荧光液泡处理液中含20µmol/L BCECF，50mmol/L HEPES 和 50mmol/L 醋酸铵，余量为水；
步骤四、荧光图片的数字化
在matlab软件程序界面输入下述语言。
image1=imread('488.jpg'); % 读入图像（将488nm激发下的图像命名为488.jpg）
image2=imread('458.jpg'); % 读入图像（将458nm激发下的图像命名为458.jpg）
figure(1);
subplot(2,2,1);
imshow(image1),title('(a) 原图1');
subplot(2,2,2)
imshow(image2),title('(b) 原图2');
subplot(2,2,3)
image1=rgb2gray(image1);imshow(image1),title('灰色图1');
subplot(2,2,4)
image2=rgb2gray(image2);imshow(image2),title('灰色图2');
[width1,height1,color1]=size(image1);
[width2,height2,color2]=size(image2);
image3=(double(image1./image2)+ double(0*ones(width1,height1)))/1.175 （标曲为pH（即image3）= （1/1.175）*（比值（488nm/458nm）+t（截距，本案为0））
mean2(image3)
x=1:height1;y=1:width1;[X,Y]=meshgrid(x,y);% surf(X,Y,double(image3));colorbar('YTickLabel',{'Freezing','Cold','Cool','Neutral','Warm','Hot','Burning','Nuclear'}) % t 数据为之前所load的数据
figure;%surf(X,Y,double(image3));
image3=pcolor(X,Y,image3);
%colormap('autumn');
%colorbar
mm=[0/255,0/255,0/255
251/255,241/255,129/255
19/255,237/255,65/255
0/255,0/255,255/255
255/255,0/255,255/255
255/255,0/255,0/255
255/255 , 255/255 , 255/255];
colormap(colormap(hsv))
%contourf(AA(:,:,i));
axis([min(x(:)) max(x(:)) min(y(:)) max(y(:))]);
% axis off
caxis([5 8.5]); % caxis manual
map=colormap;
colorbar;
%xlabel('x');ylabel('y');zlabel('image4');az = 0;el =- 90;view(az, el);%el=-90意味着从z轴负方向往其正方向看
shading interp;
%set(gcf,'color','none');%使边框为空
%set(gcf,'paperpositionmode','auto');%保存图片时，matlab会调整图片大小，设置为auto，matlab就不会自动调整图片大小了。
%axis([0 1024 0 1024])
%set(gca,'position',[0 0 1 1]);%去掉周围的边框
%B=imresize(gca, [500 500]);
saveas(gcf,'image4.jpg','jpg');
%print(gcf,'-djpeg','-r1024','c:/1.jpg')
%imwrite(B,'filename.GIF');
%image5=imread('epx.GIF'); % 读入图像
%figure;
%imshow(image5),title('重合图');
%hold on;
%image4=imread('3.jpg'); % 读入图像
%figure;
%imshow(image4),title('重合图');
所述的语言程序中，针对不同事件，两个激发波长下照片的名字，以及标准曲线的输入，是需要更改的参数，其余的都不需要变动。
步骤五、数字化荧光染色图片的结果与分析
通过执行步骤四所述的程序对pH为6.8的烟草细胞荧光染色图片进行数字化，得到488nm/458nm数字化后的图片，如图2所示，图中从左到右依次为458nm、488nm及488nm/458nm数字化的荧光结果，最右侧为pH值为6.5-7.0的颜色标尺，由图中可以看出，经数字化后，每一个点的颜色都指示一个pH值。箭头所指为液泡，结合颜色标尺可以看出，液泡区域的pH值约为6.8。由此可知，采用本发明方法对用pH 6.8荧光处理液处理一个小时后的烟草叶片进行细胞pH值计算，pH值测定结果约为6.8，计算结果准确。
因此，通过本发明的基于matlab软件平台开发的程序，可以自由的对照片上的每个点的像素、灰度进行加减乘除，形成数字化图片，结合颜色标尺，准确、快速、直观地读出目标细胞的pH值。
所述的BCECF-acetoxymethyl (AM) 购自sigma。
所述的激光共聚焦显微镜为ZEIZZ激光共聚焦显微镜 (LSM 510 META)。
所述的imageJ软件可在NCBI上免费下载，网址为http://rsb.info.nih.gov/ij/。
所述的matlab试用版本，可通过其官方网站免费获取，不用花钱购买，可以满足本专利使用。免费软件申请地址：https://cn.mathworks.com/programs/trials/trial_request.html?eventid=629055461&s_iid=hp_trial_hpg_cta2。
以上所述的具体的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、细胞荧光染色图片的获取
取待测叶片，剪成块状，浸泡在BCECF-AM染色液中1h，制备玻片标本；将玻片标本置于激光共聚焦显微镜下观察，获取激发波长分别为488nm和458nm的荧光染色图片；
步骤二、荧光标准曲线的制作
配制pH值位于5.0-7.0的至少五种不同的荧光液泡处理液，在488nm和458nm激发波长下分别对不同pH值的荧光液泡处理液直接进行拍照；利用imageJ软件，选取同一pH值的488nm和 458nm激发波长下的两张照片中相同的点，计算488nm/458nm的荧光比值；结合不同的pH值，做成荧光标准曲线；
步骤三、荧光图片的数字化
在matlab软件程序界面用计算机语言执行以下操作：
（1）读入488nm和458nm激发下的荧光图像，分别定义为image1和image2；
（2）在matlab图像界面上，建立2行2列的图像位置布局；
（3）将image1和image2分别显示为第1个和第2个子图；
（4）将image1和image2转换为灰度图，分别显示为第3个和第4个子图；
（5）获取image1和image2的像素长和宽，将像素图形成数字化图片；
（6）利用标准曲线，获取image1和image2的亮度值比值并进行修正得到image3，image3即为image1和image2亮度比值的矩阵；
（7）X坐标和Y坐标分别为图片的长和宽，以image3的值为Z坐标用surf函数进行三维表面图绘制；
（8）在界面上为image3添加颜色控制条；
（9）调用hsv系统色图绘制image3的三维着色表面图，对image 3上面每一个像素点赋予数字化颜色，并根据image3的比值调整Z坐标到区间[5,8.5]；显示颜色标尺；
（10）调整image3图片的边框和大小，并存储到硬盘中；
（11）在界面上显示最终形成的重合对比数字化图片；
执行上述操作，得到488nm/458nm数字化图片，根据颜色标尺，读出相对应的细胞pH值。
2.如权利要求1所述的一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法，其特征在于：步骤一所述的待测叶片被剪成5 mm × 5 mm的块状。
3.如权利要求1所述的一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法，其特征在于：步骤一所述的BCECF-AM染色液中含20µmol/L BCECF-AM，50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和 50mmol/L 醋酸铵，余量为水。
4.如权利要求1所述的一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法，其特征在于：步骤二所述的荧光液泡处理液中含20µmol/L BCECF，50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和 50mmol/L 醋酸铵，余量为水。
5.如权利要求1-4其中一种所述的一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法，其特征在于：配制pH分别为5.7、5.8、6.1、6.3、6.5、6.7、6.9和7.0的荧光液泡处理液。
6.如权利要求1-4其中一种所述的一种通过荧光染色图片数字化进行细胞pH值计算的方法，其特征在于：所述的待测叶片为烟草叶片。
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