CN105813639B - 铜-半胱胺及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种新的铜‑半胱胺(Cu‑Cy)晶体材料的结构和发光特性。该Cu‑Cy的晶体结构由单晶X射线衍射测定。已经发现所述化合物结晶为单斜空间群C2/c，且晶胞参数为 β＝104.798(3)°。本发明的新的Cu‑Cy晶体材料还可用于治疗癌症。

Description

铜-半胱胺及其使用方法
相关申请的互相参引
本申请要求于2013年7月29日提交的美国临时申请序列号 61/859,460以及于2014年1月27日提交的美国临时申请序列号 61/932,112的优先权，其全部公开内容以引用的方式全部纳入本说明书。
技术领域
本申请公开了新的铜-半胱胺(Cu-Cy)络合物及其特性。本申请还公开了含有所述Cu-Cy络合物的组合物和材料。本申请还公开了使用所述Cu-Cy络合物的方法，尤其是用作治疗癌症方法和用作检测辐射源的手段。本申请还公开了制备多种形态的所公开的Cu-Cy络合物的方法。
附图说明
以下附图通过举例但非限制的方式进行举例说明。为了简明扼要，给定结构的各个特征并不总是标示在该结构出现的各个附图中。
图1A-1F描述了所公开的Cu-Cy晶体的SEM(图1A、图1B及图1C)和HRTEM(图1D、图1E及图1F)图像。图1D中的插图为晶体的电子衍射图。
图2A-2E描述了未经搅拌而获得的所公开的Cu-Cy晶体的SEM 图像(图2A、图2B及图2C)。高分辨率SEM图像(图2D)和(图 2E)示出了图像(图2C)中的大晶体的边缘区域。
图3描述了本发明的Cu-Cy晶体的XRD图。
图4的右侧描述了在360nm下激发后，Cu-Cy晶体的光致发光发射光谱。激发光谱示于左侧。607nm的发射具有实线的激发，而633 nm的发射具有由虚线表示的激发光谱。
图5描述了Cu-Cy晶体的寿命谱。绘出直线作为比较来示出2μs 后的衰减曲线部分的近线性特性。
图6描述了本发明的Cu-Cy晶体的X射线发光光谱。
图7描述了本发明的Cu-Cy晶体的XPS特征。峰指认如下-峰 A Cu(3p)、峰B Cu(3s)、峰C S(2p)、峰D Cl(2p)、峰E S(2p)、峰F Cl(1s)、峰G Ag(3d)、峰H N(1s)、峰I O(1s)、峰J Ag(3p3/2)、峰K Ag(3p1/2)、峰L Cu(Auger)、峰M Ag(3s)、峰N Cu(2p3/2)、峰OCu(2p1/2)以及峰P O(Auger)。
图8描述了对在水中的所公开的Cu-Cy晶体的量子产率的测量 (通过使用罗丹明B作为标准(■))。直线为罗丹明B的线性拟合，而在水中的Cu-Cy的线性拟合几乎完全与所描述的值(▼)吻合。
图9描述了在不同浓度的所公开的Cu-Cy晶体下MCF-7细胞的存活率(viability)。
图10A-10D描述了用所公开的Cu-Cy晶体孵育了24小时的 MCF-7细胞的图像。将细胞用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。图10A：明视场图像，图10B：由405nm激发的荧光图像，图10C：由360nm激发的荧光图像，图10D：图10B和图10C的图像结合。比例尺均为50μm。
图11A-11D描述了在无Cu-Cy晶体(上排，图11A和11B)和有 Cu-Cy晶体(下排，图11C和11D)时UV光(350nm)对人类肝癌肝细胞(human hepatocellular liver cell,HEPT)破坏的比较。仅在 Cu-Cy晶体和UV辐照的情况下观察到显著的细胞死亡。比例尺均为 100μm。
图12A-12D描述了在无Cu-Cy晶体(上排，图12A和12B)和有 Cu-Cy晶体(下排，图12C和12D)时UV光(350nm)对人类乳腺癌细胞(MCF-7)破坏的比较。仅在Cu-Cy晶体和UV辐照的情况下观察到显著的细胞死亡。比例尺均为100μm。
图13A-13D描述了在无Cu-Cy晶体(上排，图14A和14B)和有 Cu-Cy晶体(下排，图14C和14D)时X射线(2Gy)对人类乳腺癌 (MCF-7)细胞破坏的比较。仅在Cu-Cy晶体和X射线辐照的存在下观察到显著的细胞死亡。比例尺均为100μm。
图14A-14D描述了在无Cu-Cy晶体(上排，图14A和14B)和有 Cu-Cy晶体(下排，图14C和14D)时X射线(2Gy)对人类前列腺癌(PC3)细胞破坏的比较。仅在Cu-Cy晶体和X射线辐照的情况下观察到显著的细胞死亡。比例尺均为100μm。
图15描述了分别在两种浓度的(a)Cu-Cy晶体、(b)UV光处理的Cu-Cy晶体以及(c)X射线处理的Cu-Cy晶体存在下的细胞 (PC-3)的存活率。
图16描述了所公开的Cu-Cy与CdTe量子点的X射线发光。测量均在水中于0.02M的浓度下进行。
图17描述了聚乙烯基甲苯/2,5-二苯基恶唑(PVT/PPO)聚合物和 Cu-Cy/PVT/PPO复合物的X射线发光。PVT中Cu-Cy的体积仅为1％。
图18A和图18B描述了当用X射线激发时PPIX(▲)、ZnO(●) 和所公开的Cu-Cy(▼)以及对照(■)中单线态氧的产生(图18A)；以及使用UV光(365nm)时PPIX(●)和Cu-Cy(▲)以及对照(■) 中单线态氧的产生(图18B)。
图19描述了本发明的Cu-Cy的单晶，其尺寸为约60μm x 60μm x 450μm。左侧为由UV灯激发而发射红色荧光的晶体；右侧为由光学显微镜成像的一个晶体(右上)和在350nm处激发的显微镜荧光图像(右下)。
图20描述了所公开的络合物的特定晶形的结构。所选的距离和角度为Cu(1)-S(1)，Cu(2)-S(1)，Cu(2)-Cl(1)，
图21A描述了所公开的Cu-Cy晶体的13C CP-MAS光谱，而图21B 描述了半胱胺的13CCP-MAS光谱。
图22描述了Cu-Cy的光致发光发射光谱(黑色，λex＝360nm) 和X射线发光。
图23示出了使用本发明Cu-Cy颗粒时X射线(2Gy)对MCF-7 细胞的破坏的比较。该图像示出了MCF-7活细胞(绿色，钙黄绿素-AM 染色)与死细胞(红色，EthD-1染色)。比例尺为100μm。
图24示出了具有不同尺寸MCF-7肿瘤的小鼠在治疗后第1、3、 5、9、13天时的时间依赖的体内图像。
图25描述了在携带MCF-7肿瘤的小鼠于治疗的第13天被处死之后收集的乳腺肿瘤。
具体实施方式
通过参考以下对本公开主题的特定方面的详细描述和其中包括的实施例，可更容易理解本说明书描述的材料、化合物、组合物、制品与方法。
在公开并描述本发明的材料、化合物、组合物与方法前，应理解下文描述的方面并不限于特定合成方法或特定试剂，因为这些当然是可变的。还应理解本说明书中所使用的术语的目的仅仅为描述特定方面而非意在限制。
此外，在本说明书通篇中，引用了多种出版物。这些出版物的公开内容全部通过引用的方式纳入本申请，以更完整地描述本公开主题所从属的领域的状况。所公开的参考文献中所含的材料也独立地和具体地通过引证的方式纳入本说明书，所述材料在所述参考文献所依据的句子中讨论。
一般定义
在本说明书和其后的权利要求中，将引用多个术语，其应被定义为具有以下含义：
除非另有规定，本说明书中所有的百分比、比率和比例均按重量计。除非另有规定，所有的温度均以摄氏度(℃)表示。
除非本公开内容明确另有要求，术语“一”(a)和“一个”(an) 定义为一个或多个。
在本说明书中范围可表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表述此范围时，另一方面包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”来将值表述为近似值时，应理解为特定值形成另一方面。还应理解，各个范围的端点在与另一端点有关时以及独立于另一端点时均有意义。
表述为“大于”的值不包括最低值。例如，当“变量x”定义为“大于零”(表述为“0<x”)时，则x的值为大于零的任何数值、分数或其他。
类似地，表述为“小于”的值不包括最高值。例如，当“变量x”定义为“小于2”(表述为“x<2”)时，则x的值为小于2的任何数值、分数或其他。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可发生或可不发生，且该描述包括了其中事件或情况发生的情形以及其中事件或情况不发生的情形。
术语“包含(comprise)”(以及任何形式的包含，如“comprises”和“comprising”)、“具有(have)”(以及任何形式的具有，如“has”和“having”)、“包括(include)”(以及任何形式的包括，如“includes”和“including”)和“含有(contain)”(以及任何形式的含有，如“contains”和“containing”)为开放式联系动词。因此，“包含”、“具有”、“包括”和“含有”一个或多个元件的装置具有所述一个或多个元件，但不限于仅具有所述元件。同样地，“包含”、“具有”、“包括”和“含有”一个或多个步骤的方法具有所述一个或多个步骤，但不限于仅具有所述一个或多个步骤。
任何装置、系统和方法的任何实施方案均可由或基本由(而非包含/包括/含有/具有)任何所描述的步骤、元件和/或特征组成。因此，在任何权利要求中，术语“由…组成”或“基本由…组成”可替代上文所列举的任何开放式联系动词，从而改变给定权利要求的范围以区别于原本使用开放式联系动词的权利要求的范围。
除非明确被本公开内容或实施方案的性质禁止，否则即使未描述或说明，一种实施方案的特征仍可适用于其他实施方案。
任何装置、系统和方法的任何实施方案均可由或基本由(而非包含/包括/含有/具有)任何所描述的步骤、元件和/或特征组成。因此，在任何权利要求中，术语“由…组成”或“基本由…组成”可替代上文所列举的任何开放式联系动词，从而改变给定权利要求的范围以区别于原本使用开放式联系动词的权利要求的范围。
除非明确被本公开内容或实施方案的性质禁止，否则即使未描述或说明，一种实施方案的特征仍可适用于其他实施方案。
与上文和其他处所描述的实施方案相关的细节记载于在下文中。
化合物
本说明书中公开了具有下式的铜-半胱胺(Cu-Cy)：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2。术语“铜-半胱胺”、“Cu-Cy材料”、“Cu-Cy络合物”、“Cu-Cy”、“所公开的材料”、“所公开的络合物”、“所公开的化合物”等在本公开内容通篇中可互换使用以表示上文鉴别的化学化合物。如附图中所描述，根据制剂人员所采用的制备方法，化合物可具有多种形式。本公开内容不排除任何形态、晶型等。
所公开的络合物在607nm和633nm处显示出发射峰，且在 633nm处显示出X射线发光。Cu-Cy材料在水溶液中以及在其他常用溶剂中是稳定的。
所公开的Cu-Cy材料可形成微米尺寸或毫米尺寸的晶体。除微米尺寸的晶体外，还已经制备了几十到几百纳米的更小的晶体。产生铜络合物材料的方法可在无惰性气氛提供的保护(例如氮气或氩气覆盖) 或无需危险的有机溶剂的情况下完成。将铜和有机反应物在水中简单地混合和加热后，所述Cu-Cy晶体形成并以沉淀的方式从水溶液中分离。然后可如实施例中更具体描述的方式将产物用水和乙醇清洗。超声有助于清洗产物，但易使晶体破碎为小碎片。
实施例1
所公开的Cu-Cy化合物的制备
二水合氯化铜(II)(99.99％)、2-巯基乙胺盐酸盐(半胱胺盐酸盐或Cys，98％)以及氢氧化钠(98％)购自Sigma(USA)。所有化学品均以收到的形式使用。用未经进一步纯化的去离子(DI)水作为反应溶剂。
将CuCl2.2H2O(0.460g，2.698mmol)溶解于DI水中，随后加入半胱胺(0.636g，8.244mmol)。使用过量的半胱胺，Cu2+(Cu(II)) 被完全还原为Cu+(Cu(I))，表示为2HSR+Cu(II)＝Cu(I)-SR+1/2 RSSR+2H+。通过加入2.5M NaOH溶液将pH值调节至8后，将所述溶液在室温下搅拌约2小时，直至溶液由于氧化变为深紫色。不希望囿于理论，由Cu(I)和Cu(II)组成的中间产物被认为是紫色的成因，且其具有所提出的化学式Cu(II)2(SR)2OCu(I)4(SR)4。
然后将溶液加热至其沸腾温度，保持30分钟。Cu3Cl(SR)2晶体从溶液中沉淀出来，并将其他反应产物与上清液一起移除。将所得的 Cu3Cl(SR)2晶体进一步离心并用DI水和乙醇(v/v＝5:4)的混合物清洗三次。最后，将晶体在真空炉中于室温下完全干燥过夜。较大的单晶是通过更长时间的不搅拌获得。不希望囿于理论，制备所需的铜- 半胱胺络合物的总反应如下：
6CuCl2+12HSR+12NaOH→2Cu3Cl(SR)2+3RSSR+2Na(SR) +10NaCl+12H2O
其中R为-CH2CH2NH2。
X射线光电子光谱法(XPS)
将Cu-Cy晶体粉末分散于乙醇中，并沉积在镀银硅片表面上。将样品在真空炉中于40℃下干燥整夜后，通过使用Perkin-Elmer PHI 560高性能分光光度计进行XPS测量和定量报告。
发光衰减寿命
使用以10Hz重复频率运行的且在440至1800nm之间可调协的纳秒光学参量振荡器/放大器(Spectra-Physics MOPO-730)来收集发光寿命。MOPO系统的输出在KFP晶体中频率加倍并指向颗粒上。在激发光的直角方向收集发射，并集中于配备有标准光电倍增管的1/8 米单色仪中。
光致发光测量
光致发光光谱通过将0.1mg Cu-Cy颗粒分散于3mL DI水中进行测量，并通过Shimadzu RF-5301PC荧光分光光度计(Kyoto,Japan) 记录。
X射线发光测量
X射线发光光谱是在配备有连接至外部检测器(QE65000分光光度计，OceanOptics Inc.，Dunedin，FL)的光纤的不透光X射线箱中进行测量。使用Faxitron RX-650(Faxitron X-ray Corp，IL，USA) (源-目标距离为12英寸mm以及光纤至目标距离为5mm)在90kV 下于135°下进行X射线辐照。发光光谱是使用QE65000分光光度计 (Ocean OpticsInc.，Dunedin，FL)来记录，其用芯直径为0.6mm 的光纤(P600-2-UV-V is,Ocean OpticsInc,Dunedin,FL)连接至X射线室，其具有伸入X射线室中并置于45°处且距样品表面5mm的探头。
量子产率(QY)测量。
量子产率测量是通过使用10mm荧光比色杯(cuvette)和 Shimadzu UV-2450紫外可见分光分光光度计和RF-5301PC荧光分光光度计进行。将溶于水中的罗丹明B(量子产率0.31)选作标准。对于每个罗丹明B和Cu络合物水溶液，分别记录五个不同的浓度和其对应的所测量的积分发光强度(integrated luminescence intensity) (λexc＝368nm)，并绘制于图9。然后在每种情况下应用线性拟合(红线)，且溶于水中的Cu-Cy晶体的量子产率是根据φ＝0.31*斜率X/ 斜率ST来计算，其中下标“X”和“ST”分别指Cu-Cy和罗丹明B。为使再吸收效应最小化，使10mm荧光比色杯中的吸光度始终保持在 0.1以下。
固态NMR光谱法
13C CP-MAS光谱是分别通过Varian/Chemagnetics Infinityplus 9.4T WB分光光度计和21.1T Bruker Avance II分光光度计获得。所有的13C CP-MAS光谱均是在室温下以1ms的接触时间和5s的脉冲延迟而获得。对于(1)和半胱胺盐酸盐，样品旋转速率分别为8和10kHz。13C化学位移的外标是金刚烷中的亚甲基碳的共振(38.55 ppm，相对于TMS)。
单晶X射线衍射分析。
为测定其结构，使用晶种生长方法获得适于单晶X射线衍射的本发明的晶体。将具有近似尺寸为0.10x 0.03x 0.03mm的本发明的浅棕色棒状晶体(C4H12CI1Cu 3N2S2)(涂覆有油(Paratone 8277，Exxon)) 收集至固定(mounted)的MicroLoop ETM的狭长孔中(孔直径：100 微米；MiTeGen-Micro-technologies for Structural Genomics；USA)。
然后将晶体固定于测角仪头上，并迅速将测角仪头转移至Oxford 低温喷枪(cryo-jet)的冷流中。固定的MicroLoopTM事先已连接可重复使用的测角仪基座，其由不锈钢磁性基座和自不锈钢基座向上延伸的铜柱组成。将MicroLoopTM握住并牢固地固定在可重复使用的测角仪基座中(不使用环氧树脂)。
全部测量均是在Nonius KappaCCD 4-Circle Kappa FR540C衍射仪上在-100℃下使用单色化的Mo Kα辐射进行。初始取向矩阵和晶胞是用φ扫描由10帧来测定，且数据是由ω扫描来测量。总共收集2662次反射。晶胞参数是使用COLLECT软件初始检索，以使用数据收集中的1355次1.00°<θ<30.03°(镶嵌度：0.428(3) °)的所观察到的反射的HKL DENZO和SCALEPACK软件精化，并且对应至单斜晶胞。数据缩减是用HKL DENZO和SCALEPACK软件进行，所述软件校正了束不均匀性、可能的晶体衰变、洛仑兹 (Lorentz)和极化效应。应用多次扫描吸收校正(SCALEPACK)。晶体结构是使用重原子法(Patterson)解析，并用SHELXL-2012通过F2的全矩阵最小二乘法精化。非氢原子是各向异性地精化。氢原子被包括在几何理想位置，且未精化。将这些氢原子的各向同性热参数分别固定在前述碳原子或氮原子的1.2或1.5倍。非氢原子的中性原子散射因子以及反常色散系数被包含于SHELXL-2012程序中。晶体结构测定的其他细节在支持信息中给出。分子热椭球图是使用Windows 的OLEX-2生成。
所得的Cu-Cy晶体描述于图1A-1F中，其使用了扫描电子显微镜 (SEM，Hitachi S-5000H系统)和透射电子显微镜(TEM，Hitachi 9500)。晶体大体为矩形，且为微米尺寸(图1A-1B)。小的不规则碎片可从较大晶体上断裂出。在更高放大倍数下(图1C)，可观察到纳米尺寸颗粒的聚集。
较小的晶体是通过TEM进行观察(图1D)。其电子衍射图(图 1D的插图)显示这些小晶体为单晶。此外，其高分辨率TEM图像显示出清晰均匀的晶格条纹(图1E-1F)。HRTEM图像证实了这些小晶体是高度结晶的且尺寸为约70nm至200nm。
所公开的化合物的微晶生长可通过调节多种因素来控制，所述因素例如，溶液的选择、pH、温度等。在不搅拌的情况下，所公开的 Cu-Cy晶体可以几十微米的尺寸获得。图2A-2E提供了补充的SEM 图像。
图3表示Cu-Cy晶体粉末的XRD图。Cu-Cy晶体显示出非常尖锐和强的峰。由高分辨率TEM图像中测量的晶格间距为d＝0.347nm (图1E)和d＝0.227nm(图1F)，其符合分别由25.70°(d＝0.346nm) 和39.94°(d＝0.226nm)处的XRD峰计算出的d值。
用于单晶XRD的晶体示于图19中。晶体尺寸近似为60μm x 60μm x 450μm，且这些晶体的发光光谱(图6)与粉末样品的发光光谱相同。Cu-Cy的晶体结构(图20)是通过单晶X射线衍射进行测定。该化合物结晶为单斜空间群C2/c，且晶胞参数为 β＝104.798(3)°。其经验式为Cu3Cl(SR)2，式量为378.38g/mol。新结构包含两种不同Cu原子：Cu(1)和Cu (2)，其分别连接4个和3个其他原子。价计算显示其均为Cu+离子。在配位结构的多个实例中，硫醇盐的硫原子通常连接少于4个金属原子。在所公开的Cu-Cy晶体中，硫原子同时桥连4个Cu原子。
为进一步探究Cu-Cy中Cu的氧化态，获得了Cu-Cy和配体前体 (半胱胺盐酸盐)的13C CP-MAS光谱(图21A-21B)。对于配体前体(HS-C(1)H2-C(2)H2-NH2·HC1)，碳原子C(1)和C(2)的各向同性化学位移分别为24.3和43.8ppm。在所公开的化合物形成时，这两个峰向低场方向移动，且出现在38.0和49.4ppm处。碳原子C(1) 显示出明显更大的位移的观察结果表明铜原子结合到了硫原子上。在配位时所观察到的配体前体位移很小(小于15ppm)的事实以及在用于本发明的晶体的相对较低的旋转速率下未观察到旋转边带的事实显示Cu离子为反磁性物质(即Cu+)。如果Cu的氧化态为2+，则由于对各向同性位移的顺磁贡献而会观察到更大的位移，特别是对于碳原子C(1)。此外，预期存在由较大顺磁位移各向异性(PSA)产生的大量旋转边带，其常在顺磁中心附近的碳原子上观察到。例如，在含有Cu2+的金属-有机体系(HKUST-1)内，苯三甲酸酯配体中的羧基碳的共振显示出非常大的256.8ppm的高场顺磁位移，其是从自由配体(苯三甲酸)的170.8ppm至HKUST-1的-86ppm。另一方面，芳香碳原子经历98-92ppm的顺磁位移，但是向相反方向(即位移为低场)[1,2]。此外，在10kHz(与在此研究中所用旋转速率相当的旋转速率)时观察到由PSA产生的大量强边带。因此，NMR数据与单晶XRD结果一致，即本发明晶体中的铜的氧化态为+1，而不是+2。
本发明的铜络合物材料在其重复单位晶胞中具有的原子少于先前报道的Cu-Cy晶体Cu13Cl13(SR')6和Cu8Cl8(SR')6(其中R'＝ CH2CH2NH3)。所公开的铜络合物的结构更简单。如图20中所见，SR 的两端(硫醇基和氨基)均键至Cu(1)，硫醇基与Cu(1)形成共价键，同时氨基的电子对与同一原子形成配位键。但在先前的Cu-Cy 结构中，仅硫醇基与Cu原子键合。在本发明中，螯合作用可能是使结构稳定的原因。
当由紫外光或X射线电磁辐射激发时(即光致发光和X射线发光)，所公开的Cu-Cy发射可见光。此发光可在约5至约14的pH范围内观察到。图4示出所公开的Cu-Cy晶体在水中的光致发光的发射光谱和激发光谱。从在水中的Cu-Cy晶体中观察到在607nm和633nm 处的两个红色发射峰，其表示两个发光发射中心。
Cu-Cy颗粒的寿命谱以log(强度)-时间的形式作图，如图5所示。在对数标度图中，衰减曲线显示出非线性特性(特别是在2μs前的部分)，这意味着强度随时间的衰减并不是简单的指数函数。当其被X射线激发时，所公开的Cu-Cy晶体以633nm处为中心显示出强发光(图6)。
图22一起描述了Cu-Cy的光致发光发射光谱(360nm)和X射线发光。
本发明的Cu-Cy晶体的XPS特征示于图7。不希望囿于理论，所标记的峰指认如下：峰A Cu(3p)、峰B Cu(3s)、峰C S(2p)、峰D Cl(2p)、峰E S(2p)、峰F Cl(1s)、峰G Ag(3d)、峰H N(1s)、峰I O(1s)、峰J Ag(3p3/2)、峰K Ag(3p1/2)、峰L Cu(Auger)、峰M Ag(3s)、峰N Cu(2p3/2)、峰O Cu(2p1/2)以及峰P O(Auger)。观察到Ag信号是由于 Ag薄膜在XPS样品制备中被用于涂覆在小硅片表面上。XPS中显示的O信号是由于被样品表面上的O所吸收。
方法
光动力疗法
在本说明书中公开了将所公开的络合物用作癌症治疗剂的方法。所述方法和用途涉及所公开的Cu-Cy络合物作为光动力疗法的有效试剂的能力。光动力疗法(PDT)作为有前景的治疗癌症的方式已经引起了日益增长的关注。但是，由于光的组织穿透性差，PDT很少被用于深层肿瘤。如果光敏剂被能够深入穿透到组织中的X射线所激发，则所述问题可得以解决。由于传统PDT光敏剂不能被X射线有效激发，先前使用X射线激发光敏剂的尝试不是很成功。光动力疗法(PDT) 和光热疗法(PTT)为两种主要的使用电磁辐射的癌症治疗方法。在PDT中细胞被产生的单线态氧杀死，而在PTT中则利用了高温度。
因此，所公开的Cu-Cy络合物可用于治疗多种哺乳动物肿瘤。如在本说明书中所用的，术语“治疗”指的是：(i)预防在易患疾病、障碍和/或病症但尚未被诊断具有其的哺乳动物、动物或人中出现所述疾病、障碍或病症；(ii)抑制疾病、障碍或病症，即阻止其发展；和/或(iii)缓解疾病、障碍或病症，即引起疾病、障碍或病症的消退。例如，对于癌症，可使用例如肿瘤尺寸的减小、转移速率的下降、和/ 或肿瘤生长的减缓、和/或在特定时间段内无疾病恶化或者与疾病相关的其他症状或者与癌症病理相关的临床指征来定量或定性地测量治疗以确定疾病的存在/不存在、或其进展或消退。
如上文所提及的，所公开的Cu-Cy络合物和方法可用于目标组织或肿瘤的成像，以治疗任何数量的癌症或肿瘤或其两者。所公开的 Cu-Cy络合物特别合适于深层组织肿瘤的成像和/或治疗，例如乳腺癌、卵巢癌、脑癌、肺癌、肝癌等。可使用所公开的Cu-Cy络合物及方法来治疗的哺乳动物肿瘤的类型包括但不限于所有的实体瘤、皮肤肿瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、结肠直肠癌、结肠癌、晚期结肠直肠癌的肝转移、淋巴瘤(包括腺淋巴瘤)、恶性淋巴瘤、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、前列腺癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、肠系膜癌、胃癌(gastric cancer)、直肠癌、胃癌(stomach cancer)、膀胱癌、白血病(包括毛细胞白血病和慢性髓细胞性白血病)、乳腺癌、实体乳腺肿瘤生长、非黑色素瘤皮肤癌(包括鳞状细胞癌和基底细胞癌)、血管瘤多发性骨髓瘤以及神经胶质瘤。在一个实施方案中，所述癌症为脑癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌，或其转移。此外，本发明的实施方案可通过使用所公开的Cu-Cy络合物的全身PDT治疗而适合于非实体瘤，包括白血病或淋巴瘤。
一方面，该方法包括全身或局部给药所公开的Cu-Cy络合物。可用的任何合适的给药途径，包括例如局部、静脉、口腔、皮下、局部 (例如眼部)或通过使用植入物。有利地，所公开的Cu-Cy络合物的较小尺寸、胶体稳定性、非聚集特性以及提高的半衰期使其特别合适于静脉给药。其他给药途径为常规或方便形式的皮下、肌肉或腹膜内注射。对于局部给药，所公开的Cu-Cy络合物可为包括洗剂、悬液或糊剂的标准局部制剂和组合物。例如，所公开的Cu-Cy络合物的ICG 包囊可通过各种方式给药，但优选通过静脉注射。
包裹光敏剂的纳米颗粒的剂量可由本领域技术人员根据以下因素进行优化：例如但不限于，所选的光敏剂、治疗方案的性质、个体受试者以及熟练技术人员的判断。包裹光敏剂的纳米颗粒的优选量为在所用的治疗方法中临床或治疗上有效的量。该量在本说明书中称为“有效量”。
根据受试者的需要或所用治疗方法的限制，可需要更小或更大剂量的所公开的Cu-Cy络合物。所述剂量可为单次给药或包括随时间的多次剂量。
将所公开的Cu-Cy络合物给予受试者，并将受试者中的肿瘤或组织暴露于光激活量的光下足够的时间量，所述光的波长足够激活所公开的Cu-Cy络合物以获得所需的响应。在一些情况下，所需的响应为以下能力：生物成像或检测目标组织或肿瘤、或使用所述方法和所公开的Cu-Cy络合物实施光动力疗法足够的时间段以有效抑制或减少肿瘤生长或肿瘤尺寸。如果需要，可将所需的响应与对照比较。
总体而言，本申请公开了治疗受试者中的肿瘤或使受试者中的目标组织成像的方法，包括：
a)向受试者给予有效量的具有下式的化合物：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2(所公开的Cu-Cy络合物)；以及
b)将所述肿瘤或目标组织暴露于光激活量的具有激活所述化合物的波长的电磁辐射下。
一方面，所述电磁辐射可来自X射线源或来自紫外光源。所述肿瘤或目标组织通常被辐照足够的时间以获得所需的响应。但制剂人员可使用任何辐射源，例如选自以下的辐射源：X射线源、伽玛射线源、贝塔射线源、质子发射源、电子发射源或中子发射源。所需的响应由制剂人员或使用者决定。
一方面，本申请公开了治疗癌症的方法，包括：
a)将癌细胞与有效量的所公开的Cu-Cy络合物接触；以及
b)辐照所述Cu-Cy络合物。
另一方面，所公开的方法包括：
a)将肿瘤与有效量的所公开的Cu-Cy络合物接触；以及
b)用X射线源辐照所述Cu-Cy络合物以产生单线态氧。
所述治疗可以由制剂人员所选的任何方式实施。例如，可通过注射器或任何其他合适的递送方式将所述络合物注射至肿瘤位点。辐射源可通过任何与肿瘤位置相容的方便的方式施用。所述方法可在手术(例如切除或不切除肿瘤的情况下)过程中施行。在此方面的一次重复中，可将所述络合物局部给药至皮肤癌症。
本公开内容的另一方面涉及治疗受试者中的肿瘤的方法，包括：
a)共同给予癌细胞具有下式的化合物和放射性同位素：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2；以及
b)任选地用电磁辐射源辐照所述癌细胞。
在本公开内容的一个实施方案中，将锝的亚稳态同位素Tc-99m 与Cu-Cy共同给药。Cu-Cy和放射性同位素的混合物可被进一步辐照。所述进一步辐照可使用选自以下的辐射源完成：X射线源、伽玛射线源、贝塔射线源、质子发射源、电子发射源或中子发射源。
另一方面涉及所公开的Cu-Cy络合物用于制备治疗癌症的药剂的用途。在另一方面，本说明书中公开了所公开的Cu-Cy络合物用作癌症治疗剂的用途。
不希望囿于理论，所公开的Cu-Cy络合物的颗粒可由X射线有效激活以产生单线态氧，即作为提供光动力疗法(PDT)的手段。PDT 使用多个不同的机理消灭肿瘤。光敏剂可直接靶向肿瘤细胞，诱导坏死或细胞凋亡。或者，通过靶向肿瘤脉管系统，可使肿瘤无法获得携带氧气的血液。
由于其涉及所公开的Cu-Cy络合物用于癌症治疗的用途，所述 Cu-Cy光敏剂具有多个独特特性：
(i)Cu-Cy颗粒自身为可直接被X射线激活的光敏剂。因此，不需要使用其他敏化剂或纳米颗粒；
(ii)Cu-Cy颗粒发光，使其可用作诊断成像剂；
(iii)Cu-Cy颗粒可被制备为纳米尺度以增加水溶性和细胞摄取；
(iv)纳米颗粒形式的Cu-Cy络合物还可以用官能团标记以用于靶向递送；
(v)Cu-Cy络合物具有低的细胞毒性；以及
(vi)Cu-Cy络合物易于合成且不昂贵。
所公开的Cu-Cy颗粒可用于深层癌症，因此超越了常规PDT(目前限制于治疗表层肿瘤(superficial tumor))的限制。
X射线诱导的Cu-Cy光敏剂为PDT提供了新的概念。此外，由于 Cu-Cy颗粒具有强的光致发光和X射线激发的发光，所以这些Cu-Cy 颗粒可用于在癌症治疗过程中的细胞成像。总体而言，本发明的Cu-Cy 光敏剂将对深层癌症的治疗具有显著影响。
Cu-Cy晶体在MCF-7细胞中的毒性是使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)测定法进行评估。将2mg Cu-Cy 晶体充分研磨并超声，然后将其溶于1mLDI水(对照)中以用于测量。如图9中所见，当Cu-Cy浓度由0.1μg/ml增加至200μg/ml时，细胞存活率由约95％逐渐降低至约70％。
图10A为MCR-7乳腺癌细胞在用所公开的Cu-Cy络合物培养后的明视场图像。为评估Cu-Cy晶体的细胞摄取，本发明人将人的乳腺癌(MCF-7)细胞与所述晶体孵育24小时。然后将细胞用4',6-二脒基 -2-苯基吲哚(DAPI)染色，在使用405nm的激发并将红色波长滤出时其细胞核清晰可见(图10B)。图10C中示出的红色发射是由360nm 处激发的Cu-Cy晶体产生。图10D为图10B和10C的图像结合。
人类肝癌肝细胞
图11A-11D描述了Cu-Cy材料在用UV光或X射线辐照时引起细胞死亡的有效性。例如，在图11A-11D中，人类肝癌肝细胞的荧光图像是在UV光暴露(350nm，2分钟，来自OLYMPUS1X71显微镜) 之前和之后拍摄。钙黄绿素和乙啡啶同质二聚体(EthD-1)分别用作显示细胞存活(绿色)和死亡(红色)的染剂。
每个图像均是在染色后立刻拍摄，而无进一步的肝细胞培养。如图11A-11B中所见，单独的UV光在引起细胞死亡方面无效。单独存在Cu-Cy晶体(图11C)并不会导致显著的细胞死亡；但是当使用 UV源辐照时，则存在着显著的细胞死亡，如图11D中所证明的。
MCF-7乳腺癌细胞
然后将光诱导毒性施用于癌细胞。图12A-12D显示出相似的荧光成像研究，但使用乳腺癌(MCF-7)细胞。如在癌细胞的情况下，当将暴露于所公开的Cu-Cy络合物的细胞用UV光源辐照时，则发生显著的细胞死亡。
如本说明书中上文所述，所公开的Cu-Cy化合物还吸收X射线并发射发光光谱。图13A-13D通过有和无Cu-Cy晶体及有和无X射线辐射的荧光图像描述了MCF-7细胞存活率。与用UV辐射一样，对用所公开的Cu-Cy络合物孵育的细胞的X射线辐照也是引起细胞死亡的有效方法。
图14A-D描述了在1Gy X射线暴露之前和之后的OLYMPUS 1X71显微镜的MCF-7细胞的荧光图像。钙黄绿素和乙啡啶同质二聚体(EthD-1)分别用作显示细胞存活(绿色)和死亡(红色)的染剂。每个图像均是在染色后立刻拍摄，而无进一步的细胞培养。如所示，无Cu-Cy颗粒的情况下，仅施用X射线剂量未杀死所述细胞(图13A 和图13B)。在仅存在Cu-Cy颗粒时几乎没有细胞死亡(图13C)。当将Cu-Cy和X射线治疗结合时，则导致显著的细胞破坏(图13D)。
人前列腺癌(PC-3)细胞
图14A-14D示出用所公开的Cu-Cy化合物孵育并用X射线源辐照的人前列腺癌细胞与对照相比的可比较结果。因此，所公开的Cu-Cy 物质和辐射源的组合提供了诱导细胞死亡的有效方法。
在PC-3细胞中，各种浓度的Cu-Cy(S1)、经UV光处理的Cu-Cy (S2)以及经X射线辐照处理的Cu-Cy(S3)的细胞毒性记载于图15 中。
由左至右阅读图15：对照样品、用0.2mg/mL S1孵育的PC-3细胞、用0.02mg/mL S1孵育的PC-3细胞、用0.2mg/mL S2孵育的PC-3 细胞、用0.02mg/mL S2孵育的PC-3细胞、用0.2mg/mL S3孵育的 PC-3细胞，以及用0.02mg/mL S3孵育的PC-3细胞。
单线态氧
为评估Cu-Cy颗粒是否产生了单线态氧而作为通过X射线辐照治疗癌症的方法，使用对亚硝基二甲基苯胺(RNO)-咪唑(ID)法(et al.,"A New Method for theDetection of Singlet Oxygen in Aqueous Solutions,"Photochemistry andPhotobiology,28卷：4-5期,577-581 (1978))来检测使用多种X射线剂量时是否产生了单线态氧。RNO为水溶性分子，其吸收可在ID的存在下被单线态氧不可逆地。图18A 描述在一系列X射线剂量下，氧化锌、原卟啉IX(PPIX)和所公开的Cu-Cy络合物与对照相比的RNO吸光度的降低。通过RNO吸收的损失来测量的由ZnO导致的单线态氧形成的量与对照相比的相对较低。PPIX与ZnO相比显示出适度增加。所公开的Cu-Cy络合物显示出近似线性关系的单线态氧生成的增加，且在8Gy下比PPIX大六倍。图18B描述了省略ZnO的相同试验，但使用紫外光作为放射源。
单线态氧测量
将对亚硝基二甲基苯胺(RNO)(0.225mg)和咪唑(ID)(16.34mg) 加入到30mL DI水中，所述DI水是通过充足的空气鼓泡而被空气饱和的。通过将1mg测试样品(Cu-Cy、PPIX或ZnO)加入到3mL 上述RNO-ID溶液中来制备样品溶液。然后，使用Faxitron RX-650 柜式X射线系统(Faxitron X-ray LLC，USA)将所述RNO-ID溶液和样品溶液暴露在不同X射线剂量下(0至8Gy)。同时，不同溶液的440nm处的RNO吸收峰强度是通过Shimadzu紫外可见光分光光度计监测。
皮下肿瘤模型
将10x 106MCF-7癌细胞系的悬液皮下注射到裸鼠的肩侧和腿侧中。每天监测小鼠的肿瘤生长(图24)。当肿瘤直径达到约3-4mm 时，将小鼠随机分为两组：一组接受X射线辐照而另一组不接受。将盐水(10μL，作为对照，左肩)和浓度为约0.8mg/mL的Cu-Cy(10 μL-右肩，15μL-左腿以及20μL-右腿)进行瘤内注射。注射后一分钟，用2％(v/v)异氟烷麻醉小鼠，并用5Gy的X射线剂量辐照肿瘤。无X射线处理时(上排)，肿瘤随时间进行而生长，且在10、15和 20μL的Cu-Cy剂量之间无明显尺寸差别。同时，无Cu-Cy(仅盐水) 处理的肿瘤比用Cu-Cy处理的肿瘤更大。所述观察结果表明Cu-Cy 表现出轻微的体内毒性，但无论所施用的Cu-Cy剂量如何均未显著减小肿瘤的尺寸或生长。但是，使用X射线辐射时(下排)，在15和 20μLCu-Cy剂量下，肿瘤生长大大降低。在肿瘤生长的第13天，将所述动物通过吸入CO2和断颈来处死。将肿瘤手术切除并示于图25 中。无X射线辐射时(上排)，无Cu-Cy处理的肿瘤生长至与用Cu-Cy 处理的肿瘤相比稍大的体积，其表明了Cu-Cy颗粒本身的轻微毒性。用10、15或20μL Cu-Cy处理的肿瘤的相似尺寸说明高的Cu-Cy剂量并不影响肿瘤生长。但是，当用X射线激活时，较高的Cu-Cy剂量则大大减小了肿瘤体积(下排)。无Cu-Cy时的X射线辐射未导致任何肿瘤尺寸减小。这可通过比较用生理盐水处理的有和无X射线辐射的两个肿瘤来观察到。对于用20μL Cu-Cy颗粒在5Gy剂量下的处理，肿瘤尺寸减小至直径约3mm，而未经处理的肿瘤尺寸为约10mm 的直径。这些观察结果和结论与图24所示研究一致。初步结果证明了Cu-Cy为用于癌症治疗的有前景的光敏剂。
细胞培养与Cu-Cy颗粒的细胞摄取
MCF-7细胞系购自ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection))并且分别在腔室玻片中在RPMI 1640和 Ham's F12K培养基中生长，所述培养基补充有100单位/mL水溶性青霉素G、100μg/mL链霉素以及浓度为在24h内实现70％汇合的10％胎牛血清。在实验当天，将细胞用预热的PBS清洗并在预热的酚红还原OptiMEM培养基中培养30min，然后加入50μg Cu-Cy颗粒。将细胞与Cu-Cy在37℃下孵育24小时，然后用PBS清洗三次，用4％多聚甲醛固定，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚和Alexa-Fluor鬼笔环肽(Phalloidin)复染，装片(mount)，并通过荧光显微镜目视观察。
细胞毒性测试
细胞毒性是使用MTT测定法进行评估。将约2,000细胞/孔的 MCF-7细胞接种至96孔板中，并使其在培养箱(Sanyo，Japan，5％ CO2，37℃，湿润气氛)中生长48小时。实验当天，在移除培养基后，将含有Cu-Cy颗粒的不同体积的培养基加入其各自的孔中，并且在24h的细胞培养后评估细胞毒性。
使用荧光成像的体外细胞破坏
将MCF-7细胞以～5,000细胞/孔接种至两个6孔板上(A和B)，并在37℃下于5％v/vCO2的湿润气氛中在黑暗中培养48h。实验当天，将培养基移除并向不同孔中加入5mL含有0和40μg/ml Cu-Cy 颗粒的培养基。再经过24小时的细胞培养后，将孔板A中的细胞用2 Gy X射线辐照，而孔板B中的细胞则不辐照。然后，将细胞与500μL 染料混合物(钙黄绿素和EthD-1)在标准细胞培养条件下于黑暗中孵育30min。将未掺入的染料通过清洗移除，其后将培养孔补充培养基。将所述细胞在OLYMPUS 1X71荧光显微镜下观察。
辐射检测
本说明书中还公开了所公开的Cu-Cy络合物用于检测辐射的用途。所述辐射可来自任何源，尤其是阿尔法、伽马、贝塔、中子、宇宙射线或任何高能粒子。此外，所公开的络合物可用于医疗成像，例如X射线增强剂，用于计算机体层摄影(CT)、正电子发射断层扫描(PET)以及计算机X射线摄影的检测剂。此外，其可用于电子束诱导的阴极发光而用于显示屏例如电视机、计算机或任何与阴极发光或电子束相关的显示器。通过检测由辐射所产生的单线态氧进行的辐射检测方法尤其适用于溶液中(例如水中)的辐射检测。此外，所述材料和方法可用于生物传感和检测，以及用于光检测和传感。
一方面，本公开内容涉及检测辐射的方法，包括使所公开的Cu-Cy 络合物与电磁辐射源接触。
另一方面，本公开内容涉及检测辐射的方法，包括：
a)使所公开的Cu-Cy化合物暴露于辐射源；以及
b)测量所产生的发射光谱。
另一方面，本公开内容涉及检测辐射源或确定是否存在辐射源的方法，包括：
a)将不受辐射影响的基质表面用所公开的Cu-Cy化合物涂覆；
b)将含有所公开的Cu-Cy化合物的表面暴露于被怀疑产生辐射
源的位置或物体；以及
c)确定该表面是否发射光致发光。
光致发光
本说明书中还公开了产生光致发光照明(photoluminescent lighting)的方法，包括用电磁辐射源辐照具有下式的化合物：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2。
其他明显的以及本发明固有的优点对本领域技术人员来说是显而易见的。应理解的是，某些特征和亚组合是有用的，且可以被使用而不必参考其他特征和亚组合。其已被权利要求的范围所考虑到并且在权利要求的范围内。由于可做出很多可能的本发明的实施方案而又不偏离其范围，所以应理解，本文在附图中陈述或示出的所有内容均应解释为举例说明性的而非是限制性的含义。

Claims (20)

1.一种具有下式的化合物：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物结晶为单斜空间群C2/c，且晶胞参数为β＝104.798(3)°。
3.一种具有下式的化合物制备用于治疗受试者中的实体瘤或成像受试者中的目标组织的药物的用途：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2。
4.权利要求3的用途，其中所述实体瘤与选自以下的癌症相关：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、肾癌、头颈癌、肠系膜癌、胃癌、直肠癌、膀胱癌、非黑色素瘤皮肤癌、血管瘤多发性骨髓瘤以及神经胶质瘤。
5.权利要求4的用途，其中所述头颈癌是脑癌。
6.权利要求4的用途，其中所述乳腺癌是实体乳腺肿瘤生长。
7.权利要求4的用途，其中所述黑色素瘤是恶性黑色素瘤。
8.权利要求4的用途，其中所述肾癌是肾细胞癌。
9.权利要求4的用途，其中所述结肠直肠癌是晚期结肠直肠癌的肝转移。
10.一种化合物用于制备杀死实体瘤细胞的药物的用途，所述化合物具有下式：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2。
11.权利要求10的用途，其中所述实体瘤细胞为选自以下的癌症的细胞：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、肾癌、头颈癌、肠系膜癌、胃癌、直肠癌、膀胱癌、非黑色素瘤皮肤癌、血管瘤多发性骨髓瘤以及神经胶质瘤。
12.权利要求11的用途，其中所述头颈癌是脑癌。
13.权利要求11的用途，其中所述乳腺癌是实体乳腺肿瘤生长。
14.权利要求11的用途，其中所述黑色素瘤是恶性黑色素瘤。
15.权利要求11的用途，其中所述肾癌是肾细胞癌。
16.权利要求11的用途，其中所述结肠直肠癌是晚期结肠直肠癌的肝转移。
17.一种产生单线态氧的非治疗用途的方法，包括辐照具有下式的化合物：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2，
所述辐照使用光激活量的具有激活所述化合物的波长的电磁辐射源。
18.权利要求17的方法，其中所述辐射源选自X射线源、紫外光源、伽玛射线源、贝塔射线源、质子发射源、电子发射源或中子发射源。
19.一种产生光致发光照明的非治疗用途的方法，包括辐照具有下式的化合物：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2，
所述辐照使用光激活量的具有激活所述化合物的波长的电磁辐射源。
20.一种化合物用于制备用于治疗实体瘤的光动力疗法的组合物的用途，所述化合物具有下式：
Cu3Cl(SR)2
其中R为-CH2CH2NH2。
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