CN105779411B

CN105779411B - 一种发酵产脂肪酶的方法

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Publication number: CN105779411B
Application number: CN201410822387.9A
Authority: CN
Inventors: 石兴利; 关惠琴; 吴清杭; 杨倚铭; 辛本荣
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN105779411A

Abstract

本发明提供一种发酵产脂肪酶的方法，该方法在发酵过程中添加发酵液初始体积0.6‑1.2％的有机硅类消泡剂；或，在发酵过程中添加发酵液总体积0.4‑0.8％的有机硅类消泡剂。本发明的方法很好的提升了发酵产脂肪酶的产量，并提高了所获得的脂肪酶的活力及其固定化酶活力、固定化酶稳定性。

Description

一种发酵产脂肪酶的方法

技术领域

本发明涉及一种生物发酵领域，具体的，涉及脂肪酶的发酵生产。

背景技术

脂肪酶TLL(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶)主要用于油脂的水解、三甘油酯的改性以及单甘脂和二甘油酯的生产。目前国内外文献报道重组毕赤酵母表达人工合成的TLL质粒发酵方面的文献及专利几乎没有，主要都是集中在成品Lipozyme TL IM和Lipozyme TL100L应用方面的研究。如江南大学用Lipozyme TL 100L生物合成蔗糖-6-乙酸酯。华南理工大学用Lipozyme TL IM催化甲醇分解生成生物柴油等。

有关消泡剂对于提高重组毕赤酵母表达人工合成的TLL质粒酶活力及蛋白活力方面的文献及专利研究也没有发现。有报道消泡剂在L-氨基酸生产中对其产量有提高的作用。

消泡剂在发酵应用中可有效的抑制发酵液的溢流，减少物料的损失，并能有效的降低溢流导致的染菌风险。常规发酵中大多采用聚醚类消泡剂，且消泡剂的用量一般都是发酵液体积的0.1-0.5‰，使用量过多会使菌体代谢发生紊乱，产生中毒现象。

目前，发酵行业生产过程中加入的消泡剂主要是聚醚类消泡剂和有机硅类消泡剂，由于聚醚类消泡剂只含有C、N、O、H几种元素，且具有抑泡时间长，活力好，消泡速度快特点。为发酵行业中首选的消泡剂。而有机硅类消泡剂在高温下宜发生分层，应用消泡活力不稳定，由于有机硅类消泡剂中含有硅元素，在应用中加入到发酵液中，对发酵有影响，使发酵的转化率降低，同时很难从发酵液中分离出去。如谢举文，发酵行业消泡剂的应用报道的。

本发明中意外的发现，采用与传统技术相反的策略，即不仅不减少消泡剂的用量，反而大幅度提高消泡剂的用量，并使用有机硅类消泡剂，毕赤酵母发酵产脂肪酶中的目标酶的固定化的活力、产量、酶活稳定性都有显著提高。

发明内容

本发明的第一方面在于，提供一种发酵产脂肪酶的方法，所述方法在发酵过程中添加发酵液初始体积0.6％-1.2％的有机硅类消泡剂。

在本发明的一个实施方案中，在发酵过程中添加发酵液总体积0.4％-0.8％的有机硅类消泡剂。

在本发明的一个实施方案中，所述脂肪酶为疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。

在本发明的一个实施方案中，所述方法为重组毕赤酵母发酵产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。

在本发明的一个实施方案中，所述有机硅类消泡剂为乳化硅油。

在本发明的一个实施方案中，所述发酵于25-35℃下进行。

在本发明的一个实施方案中，所述发酵时间为80-120h。

本发明的第二方面在于，提供一种提高发酵产脂肪酶产量方法，所述方法在发酵过程中添加发酵液初始体积0.6％-1.2％的有机硅类消泡剂。

在本发明的一个实施方案中，所述发酵为重组毕赤酵母发酵产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。

本发明的第三方面在于，提供一种脂肪酶固定化酶，所述固定化酶使用本发明方法获得的脂肪酶制备。

本发明的第四方面在于，提供一种提高脂肪酶固定化活力的方法，所述方法使用本发明方法获得的脂肪酶制备固定化酶。

本发明的第五方面在于，提供一种提高脂肪酶比酶活的方法，所述方法在发酵产脂肪酶过程中添加发酵液初始体积0.015％-0.06％的聚醚类消泡剂。

在本发明的一个实施方案中，所述方法在发酵过程中添加发酵液总体积0.01％-0.04％的聚醚类消泡剂。

在本发明的一个实施方案中，所述聚醚类消泡剂为GPE。

本发明在发酵产脂肪酶过程中，采用与传统技术相反的策略，即不仅不减少消泡剂的用量，反而大幅度提高乳化硅油的用量，将其提高到常规10-50倍的用量，其中整个过程中乳化硅油的用量为发酵初始体积的0.6％-1.2％，总发酵液体积的0.4％-0.8％。即有效的预防了逃液，又将固定化酶的活力提高了60％以上，并且连续反应五个批次后固定化酶依然保持较高的活力，和聚醚类消泡剂原始固定化酶活力相当。并且在发酵过程中目标酶的酶活力也提高了1.5倍以上，总蛋白提高了2.2倍以上，并且目的蛋白的稳定性变得更好。

附图说明

图1是发酵中不同消泡剂对毕赤酵母产脂肪酶活力的影响结果。

图2是发酵中不同消泡剂对毕赤酵母产脂肪酶总蛋白的影响结果。

图3是发酵中不同消泡剂对毕赤酵母产脂肪酶固定化后酯交换活力的影响结果。

具体实施方式

在本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。

在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。

在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。

如果没有特别指出，本发明所述的百分数的基准都是所述组合物的总重量。

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。

在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。

在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。

在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明的第提供一种发酵产脂肪酶的方法，所述方法在发酵过程中添加发酵液初始体积0.6％-1.2％的有机硅类消泡剂。

在本发明的一个实施方案中，所述发酵于25-35℃下进行。

在本发明的一个实施方案中，所述发酵时间为80-120h。

本发明提供一种提高发酵产脂肪酶产量方法，所述方法在发酵过程中添加发酵液初始体积0.6％-1.2％的有机硅类消泡剂。

本发明提供一种脂肪酶固定化酶，所述固定化酶使用本发明方法获得的脂肪酶制备。

本发明提供一种提高脂肪酶固定化活力的方法，所述方法使用本发明方法获得的脂肪酶制备固定化酶。

本发明提供一种提高脂肪酶比酶活的方法，所述方法在发酵产脂肪酶过程中添加发酵液初始体积0.015％-0.06％的聚醚类消泡剂。

在本发明的一个实施方案中，所述聚醚类消泡剂为GPE。

本发明使用的试剂及材料：

表达疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的重组菌：该重组的毕赤酵母构建方法按照《毕赤酵母表达操作手册》(Invitrogen)操作完成。宿主菌：毕赤酵母GS115菌株，购自invitrogen公司；疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因：根据NCBI公开序列GenBank Accession：O59952(来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus，TL))，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

脂肪酶水解活力分析方法：滴定法检测脂肪酶活力

量取4％PVA溶液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机8000rpm乳化3min，暂停1min后再乳化3min，制备底物溶液。

具体步骤如下：

取两个干净的小三角瓶，每一个三角瓶各加底物溶液4ml+3ml蒸馏水+2ml Tris-HCL缓冲液，放入40℃恒温水域摇床震荡预热5min，样品瓶中加入1ml发酵上清液，空白瓶不加，两个三角瓶继续在40℃恒温水域摇床震荡反应15min，样品瓶和空白瓶各加入95％乙醇10ml终止反应，空白瓶中补加1ml发酵上清液摇匀，两个瓶中各加2滴酚酞指示剂，用0.1m的氢氧化钠滴定至酚酞变微红为终点，记录消耗氢氧化钠溶液的体积。

酶活定义及计算公式

脂肪酶酶活力单位定义为：每分钟催化底物释放出1μmol脂肪酸的酶量为1个脂肪酶活力单位(U)。

酶活计算公式：

式中：V：滴定样液所消耗的NaOH溶液体积(ml)

V₀：滴定空白样所消耗的NaOH溶液体积(ml)

t：反应时间(min)

n：酶液体积(ml)

M：滴定用的NaOH溶液的浓度(mmol/L)

脂肪酶总蛋白含量分析方法：考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝燃料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要与蛋白质中的碱性氨基氮(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度与蛋白质浓度成正比。

实验步骤：

考马斯亮蓝G-250染料试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95％的乙醇后，再加入120ml85％的磷酸，用水稀释至1升。过滤后标定。

标准曲线的绘制：

用标准蛋白(1mg/ml BSA牛血清蛋白)质量(mg)为横坐标，用吸光度值为纵坐标，作图，即得到一条标准曲线。以此标准曲线可查出未知样品的吸光度值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

样品测试：

5ml考马斯亮蓝染色液+0.1ml发酵上清液，室温静置5min,在595nm处测吸光值，根据标准曲线算蛋白含量。

固定化脂肪酶活力检测的方法

采用精炼大豆油和极度氢化大豆油(嘉里食品工业有限公司生产)为底物(w/w73:37)，酶和底物质量比为1:20，在70℃反应30min，反应毕后取出产物测其40℃SFC含量。每次取出产物把酶留在反应器内，再加入底物进行反应，重复5次。40℃SFC含量方法：将装有样品的固脂管分别放入100℃烘箱中15min，60℃水浴5min，0℃水浴60min，40℃水浴30min，然后用核磁共振仪(布鲁克公司型号MQ20)测其固脂含量。酯交换活力(IUN)的公式为(SFCBlank-SFC样品)/30*1260。

种子培养基(YPD-甘油)：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨,20g/L甘油。121℃,灭菌20min。

发酵初始培养基：50g/L甘油，0.9g/L CaSO₄，14.67g/L K₂SO₄，9g/L(NH₄)₂SO₄，5.69g/L无水MgSO₄，83.5ml 300g/L六偏磷酸钠溶液，4ml/L PTM微量元素溶液，接种前用浓氨水调节初始pH为5.5。

PTM微量元素浓缩溶液：5.99g/L CuSO₄·5H₂O,8ml/L 1％NaI，3.0g/L MnSO4 H2O,0.2g/L Na₂Mo₄·(H₂O)₂，0.5g/L CoCL₂·(H₂O)₆，20.04g/L ZnCL₂·(H₂O)₅，65.05g/LFeSO₄·(H₂O)₇，800μL/L 2.5％H₃BO₃，19.2ml/L浓硫酸，0.4g/L生物素。0.2μm膜过滤后灭菌。

甘油补料培养基：甘油50％，12ml/L PTM微量元素溶液。

甲醇补料培养基：甲醇100％，12ml/L PTM微量元素溶液。

乳化硅油,购自南京华兴消泡剂有限公司。

GPE(泡敌)，购自苏州百斯顿化工有限公司。

硫酸钙：购自上海国药集团有限公司；硫酸镁：购自上海国药集团有限公司；硫酸铵：购自上海国药集团有限公司；硫酸钾：购自上海国药集团有限公司；硫酸钙：购自上海国药集团有限公司；六偏磷酸钠：购自上海国药集团有限公司；甲醇：购自上海凌峰化学试剂有限公司；氨水：购自上海凌峰化学试剂有限公司。

实施例1

种子的制备，从保藏在甘油管中的表达疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的毕赤酵母重组菌悬液中挑取一环在YPD-甘油平板上划线，在28℃的培养箱中培养3d，挑取平板上单一较大的菌落接种到已灭菌的含30ml种子培养基的250ml带挡板的大口三角瓶中，于28℃，200rpm下培养18h，即得发酵种子液。

实施例2

重组菌发酵，具体发酵方法如下：

德国NBS 7.5L发酵罐：加入3L发酵培养基，溶氧、PH电极校正无误后包扎完好，在121℃灭菌20分钟。冷却后，接入30ml实施例1中所获得的种子液，于30℃,500r/min，通气量2vvm发酵培养。

发酵过程中经过三个阶段控制：

1.甘油分批发酵过程：初始OD600约为0.1左右，初始甘油为5％；过程中调转数，通风，罐压使DO％>20％；发酵25h后进入第二阶段)；

2.甘油限制性流加过程：温度由初始30℃降为28℃，pH由原来5.5降为5，以恒定速率(70ml/h)流加50％浓度的无菌甘油使DO控制在20％左右；过程中取样测湿重，湿重在200～220g/L时该阶段结束；

3.甲醇限制性流加过程：甲醇适应阶段采用每2小时调整一次流速，适应6个小时后，恒定甲醇流速。甲醇开始诱导的前六个小时流加策略为：0-2h,调节甲醇流速为10ml/h，DO控制在60-70％；2-4h,调节甲醇流速15ml/h，DO控制在40-50％；4-6h,调节甲醇流速25ml/h，DO控制在30-40％；适应6h后甲醇浓度控制在35ml/h，DO控制在20％左右；发酵过程中总共用的发酵液总体积为4.5L。

在整个发酵过程中流加乳化硅油，其用量为18ml。发酵120h发酵结束。发酵过程中及发酵结束后，测定发酵产物脂肪酶的酶活及其含量。结果见表1及图1、图2。

实施例3

方法同实施例2，改变发酵过程中流加的乳化硅油的量，为36ml。发酵过程中及发酵结束后，测定发酵产物脂肪酶的酶活及其含量。结果见表1及图1、图2。

实施例4

方法同实施例2，改变发酵过程中流加的乳化硅油的量，为27ml。发酵结束后，测定发酵产物脂肪酶的酶活及其含量。结果见表1及图1、图2。

实施例5

方法同实施例2，改变发酵过程中流加的乳化硅油的量，为1.8ml。发酵过程中及发酵结束后，测定发酵产物脂肪酶的酶活及其含量。结果见表1及图1、图2。

实施例6

方法同实施例2，改变发酵过程中流加的消泡剂，改为流加的GPE(泡敌)，其用量为1.8ml。发酵过程中及发酵结束后，测定发酵产物T脂肪酶的酶活及其含量。结果见表1及图1、图2。

实施例7

上海国强500L发酵罐：加入200L发酵培养基，溶氧、PH电极校正无误后包扎完好，在121℃灭菌20分钟。冷却后，接入实施例1中所获得的2L种子液，于30℃,180r/min，通气量167vvm发酵培养。

发酵过程中经过三个阶段控制：

2.甘油限制性流加过程：温度由初始30℃降为28℃，pH由原来5.5降为5，以恒定速率(4.5L/h)流加50％浓度的无菌甘油使DO控制在20％左右；过程中取样测湿重，湿重在200～220g/L时该阶段结束；

3.甲醇限制性流加过程：甲醇适应阶段采用每2小时调整一次流速，适应6个小时后，恒定甲醇流速。甲醇开始诱导的前六个小时流加策略为：0-2h,调节甲醇流速为0.5L/h，DO控制在60-70％；2-4h,调节甲醇流速1L/h，DO控制在40-50％；4-6h,调节甲醇流速1.3L/h，DO控制在30-40％；适应6h后甲醇浓度控制在1.8L/h，DO控制在20％左右；发酵过程中总共用的发酵液总体积为350L。

在整个发酵过程中流加GPE(泡敌)，其用量为30ml。发酵102h发酵结束。发酵过程中及发酵结束后，测定发酵产物脂肪酶的酶活及其含量。结果见表1及图1、图2。

发酵过程中，测定各组实验发酵产物脂肪酶的酶活及其含量，脂肪酶酶活结果如图1所示，脂肪酶含量结果见图2。发酵结束后，测定各组发酵产物脂肪酶的酶活及其含量。实验设计及结果如表1所示。

表1

表1结果表明，添加发酵液初始体积的0.6-1.2％(发酵液总体积0.4％-0.8％)的乳化硅油可显著提高发酵获得脂肪酶的酶活及其产量。在发酵产脂肪酶过程中添加发酵液初始体积0.015％-0.06％(发酵液总体积0.01％-0.04％)的聚醚类消泡剂可显著提高脂肪酶比酶活。

实施例8

向实施例2中发酵获得的TL脂肪酶液100mL(酶活66667U/mL，蛋白浓度12.1mg/ml)中加入50g吸附树脂Amberlite XAD 7HP(罗门哈斯公司生产)，气浴摇床120rpm，25℃吸附固定6h，抽滤收集固体，将固体放到通风良好的环境进行自然风干，干燥后得固定化酶A。

向实施例6中发酵获得的发酵的TL脂肪酶液230mL(45000U/mL，蛋白浓度5.04mg/ml)中加入50g吸附树脂Amberlite XAD 7HP，气浴摇床120rpm，25℃吸附固定6h，抽滤收集固体，将固体放到通风良好的地方进行自然风干，干燥后得固定化酶B。

采用精炼大豆油和极度氢化大豆油(嘉里食品工业有限公司生产)为底物(w/w73:37)，酶和底物质量比为1:20，在70℃反应30min，反应毕后取出产物测其40℃SFC含量。每次取出产物把酶留在反应器内，再加入底物进行反应，重复5次。

40℃SFC含量方法测定酯交换活力：将装有样品的固脂管分别放入100℃烘箱中15min，60℃水浴5min，0℃水浴60min，40℃水浴30min，然后用核磁共振仪(布鲁克公司型号MQ20)测其固脂含量。酯交换活力(IUN)的公式为(SFC Blank-SFC样品)/30*1260.

分别测定固定化酶A和固定化酶B的酶活，结果如表2及图3所示。

表2

反应次数	1	2	3	4	5
						固定化酶A(U/ml)	543.4	473.9	402.5	375.7	330.9
固定化酶B(U/ml)	338.6	309.2	257.4	231.6	173.4

如表2及图3所示，固定化酶A酶活更高且稳定性更好。

按实施例8中固定化酶A的方法，分别将实施例3和4获得的TL脂肪酶液进行固定化，并检测其酶活，结果显示，与固定化酶B相比，实施例3和4获得的固定化酶的酶活更高且稳定性更好。

上述结果显示，说明本发明方法获得的脂肪酶具备更好的固定化活力及稳定性。

实施例结果表明，本发明在发酵过程中添加发酵液初始体积的0.6-1.2％(发酵液总体积0.4％-0.8％)，很好的提升了发酵产脂肪酶的产量，并提高了所获得的脂肪酶的活力及其固定化酶活力、固定化酶稳定性。

Claims

1.一种发酵产脂肪酶的方法，其特征在于，在发酵过程中添加发酵液初始体积0.6％-1.2％的有机硅类消泡剂；或，在发酵过程中添加发酵液总体积0.4％-0.8％的有机硅类消泡剂，所述有机硅类消泡剂为乳化硅油，所述方法为重组毕赤酵母发酵产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵于25-35℃下进行。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵为发酵80-120h。

4.一种提高发酵产脂肪酶产量方法，其特征在于，在发酵过程中添加发酵液初始体积0.6％-1.2％的有机硅类消泡剂；或，在发酵过程中添加发酵液总体积0.4％-0.8％的有机硅类消泡剂；所述脂肪酶为疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶；所述发酵为重组毕赤酵母发酵产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，所述有机硅类消泡剂为乳化硅油。