CN105753933A - 采用模拟移动床色谱纯化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及采用模拟移动床色谱纯化抗体。本发明涉及用于抗体(例如单克隆抗体)的色谱纯化的组合物和方法，其采用改进的模拟移动床分离策略以及在某些实施方案中采用拉曼光谱。

Description

采用模拟移动床色谱纯化抗体
本申请是国际申请日为2011年9月16日的国际申请PCT/US2011/051874进入中国、申请号为201180055293.8的题为“采用模拟移动床色谱纯化抗体”的发明专利申请的分案申请。本申请要求2011年9月20日提交的美国专利申请第61/384,620号的申请日的权益，其内容在此整体引入作为参考。
1.技术领域
本发明涉及用于抗体(例如单克隆抗体(“mAbs”))的色谱纯化的组合物和方法，其采用改进的模拟移动床(“SMB”)分离策略以及在某些实施方案中采用拉曼光谱。
2.背景技术
蛋白质纯化策略通常采用一个或多个色谱分离步骤以将宿主细胞蛋白(“HCPs”)从最终纯化的蛋白制剂中排除。此色谱分离步骤通常以“批处理方式”来进行，其中将填充有特定的色谱固定相的单柱连续进行平衡、装载、洗涤、洗脱，并随后再生。由于批处理方式色谱法只依赖于装载的柱的动态容量，而不是装载的柱的饱和容量，因此装载和分离的每个循环仅使用该柱实际结合容量的30%至50%。因此，批处理方式分离需要使用具有当这些柱子在其饱和容量下运行时所需要的两至三倍以上体积的柱子。仅利用了30%-50%的柱的实际结合容量，批处理方式色谱法因此涉及使用明显更高的色谱分离固定相的量，且延长完成装载和分离的每个循环所需要的时间，其大幅度地增加了蛋白质纯化相关的成本。此外，如果在饱和时进行分离，使用具有两到三倍体积的柱子将是必要的，这导致单个分离循环中所使用的平衡、洗涤和洗脱缓冲液的量显著增加，造成额外的成本和时间的低效。
鉴于上述情况，本领域中需要改进的方法以更有效地纯化蛋白质，包括治疗性抗体。本发明通过将改进的模拟移动床分离策略纳入蛋白质的纯化中解决了这一需求。
3.发明内容
在某些实施方案中，本发明涉及从含靶蛋白和至少一种HCP的样品混合物制备宿主细胞蛋白(HCP)降低的靶蛋白制剂的方法。在某些实施方案中，本发明的方法包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂和选自亲和色谱树脂、离子交换色谱树脂和疏水相互作用色谱树脂的色谱树脂。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂并且所述靶蛋白选自：酶；肽类激素；多克隆抗体；人单克隆抗体；人源化单克隆抗体；嵌合单克隆抗体；单链抗体；Fab抗体片段；F(ab')2抗体片段；Fd抗体片段；Fv抗体片段；分离的CDRs；双抗体；DVDs和免疫粘附素。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且将色谱树脂充填入一系列被流体导管分隔的流体连接柱，其中流体连接柱的数量选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个单柱。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且将色谱树脂充填入一系列被流体导管分隔的至少2个流体连接柱，其中所述柱子被流体导管分隔以允许引入缓冲液，如平衡、洗涤和洗脱缓冲液，以及洗脱液的移出。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且样品混合物与色谱树脂接触以获得选自约0.5至约12分钟范围的保留时间，在一个实施方案中，其可以选自高达约0.5分钟、高达约1分钟、高达约2分钟、高达约3分钟、高达约4分钟、高达约5分钟、高达约6分钟、高达约7分钟、高达约8分钟、高达约9分钟、高达约10分钟、高达约11分钟和高达约12分钟。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且所述方法进一步包括在接触样品混合物前平衡色谱树脂和接触样品混合物后洗涤色谱树脂的步骤，其中平衡和洗涤缓冲液为相同缓冲液。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且所述方法进一步包括色谱树脂的洗涤和再生步骤，其中此步骤可被计算和编排，以维持样品接触色谱树脂的步骤为该过程的时间的约20%至约80%，在一个特定的实施方案中，其为约50%。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
4.附图说明
图1描述了常规的色谱流程图与模拟移动床色谱流程图。
图2描述了常规的色谱流程图。
图3描述了模拟移动床色谱流程图。
图4描述了反映mAb X模拟移动床色谱个案研究结果的色谱图。
图5描述了mAb X模拟移动床色谱个案研究的产品回收和产品质量分析。
图6描述了反映mAb Y模拟移动床色谱个案研究结果的色谱图。
图7描述了mAb Y模拟移动床色谱个案研究的产品回收和产品质量分析。
图8描述了与mAb X模拟移动床色谱个案研究有关的mAb X %漏出分析。
图9描述了与mAb Y模拟移动床色谱个案研究有关的mAb Y %漏出分析。
图10描述了中试规模的模拟移动床色谱流程图。
图11描述了包括氨基酸、pH缓冲物质和糖的3组分(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)缓冲系统的拉曼光谱。该图表采用Umetrics SIMCA P+ V 12.0.1.0生成。X轴为数据点的数目。每个数据点为拉曼位移波数。其可以用X轴上的拉曼位移波数(cm-1)重新绘制。数据从波数1800(=Num 0)开始至800(=Num 1000)。拉曼光谱的原始数据以强度(与散射光子的数目有关)为单位。该图显示了三个单独的组分(在水中)的平均的中心光谱数据。光谱的平均值为0。其他值与其相对应，可能在与平均值的标准差处。
图12描述了采用随机值比较3组分缓冲系统(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)的实际与预测浓度。该图通过使用现有的模型预测新溶液的浓度来创建。x和y轴为浓度(mM)。
图13描述了通过单一组分比较3组分缓冲系统(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)的实际与预测浓度。
图14描述了4组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温™)的纯组分的原始光谱。y轴为光谱强度，x轴为波数cm-1。
图15描述了4组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温™)的纯组分的原始光谱。y轴为光谱强度，x轴为波数cm-1。图5是图4中所示光谱的更详细的视图，其中“指纹”区已被扩大。
图16描述了4组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温™)的纯组分的SNV/DYDX/均值中心光谱。图6中所示的数据是基于所有预处理：用于强度标准化的标准正态变量(SNV)、用于基线标准化的1阶导数和用于缩放的均值中心化(mean centering)之后，图4-5中所示的相同的数据。
图17描述了采用随机值比较4组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温™)的实际与预测浓度。这通过使用现有的模型产生以预测新溶液的浓度。
图18描述了通过单一组分比较3组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温™)的实际与预测浓度。
图19描述了含蛋白质的3组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/阿达木单抗)的纯组分的原始光谱，原始光谱显示拉曼强度。
图20描述了含蛋白质的3组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/阿达木单抗)的纯组分的原始光谱，并详细示出了指纹区(800-1700 cm-1)。
图21描述了纯组分SNV/DYDX/均值中心-含蛋白质的3组分缓冲系统。图11中所示的数据是基于所有预处理：用于强度标准化的标准正态变量(SNV)、用于基线标准化的1阶导数和用于缩放的均值中心化之后，图9-10所示的相同的数据。
图22描述了通过单一组分比较含蛋白质的3组分缓冲系统的实际与预测浓度。
图23描述了利用拉曼光谱作为处理和/或质量控制的一部分的阿达木单抗的纯化过程。
图24描述了涉及缓冲液、糖和氨基酸(蛋氨酸/甘露醇/组氨酸)的三组分混合物的渗滤过程的在线拉曼浓度预测。
图25描述了涉及缓冲液、糖和氨基酸(蛋氨酸/甘露醇/组氨酸)的三组分混合物的重复渗滤过程。为增加分辨率并入额外的数据点。
图26描述了糖(甘露醇)/蛋白质(阿达木单抗)溶液的拉曼校准。
图27描述了渗滤缓冲液交换过程的在线拉曼浓度预测，其中抗体水溶液被甘露醇溶液替换以提供糖/蛋白(甘露醇/阿达木单抗)溶液。缓冲液交换后为蛋白质浓度。
图28描述了图27中所示实验的重复，其中蛋白质浓度相扩展至180 g/L。
图29描述了组氨酸和阿达木单抗溶液的拉曼校准。
图30描述了渗滤缓冲液交换过程的在线拉曼浓度预测，其中蛋白质水溶液被组氨酸溶液替换。组氨酸交换后为阿达木单抗浓度。
图31A-C描述了通过单一组分比较含蛋白质的2组分缓冲系统的实际与预测浓度：A. Tris浓度；B. 醋酸盐浓度；和C. 阿达木单抗浓度。
图32A-B描述了通过单一组分比较含蛋白质的1组分缓冲系统的实际与预测浓度：A. 吐温™浓度；和B. 阿达木单抗浓度。
图33描述了当两种抗体(D2E7和ABT-874)采用未修饰蛋白质的光催化交联法(PICUP)分别进行聚集时所使用的条件。该抗体从0-4小时暴露于聚集光源。
图34描述了图33中概述的交联的尺寸排阻色谱结果。
图35描述了拉曼光谱和采用D2E7样品的主成分分析模型化的光谱，表明聚集样品有明显的主成分得分，并且使用拉曼光谱可以将其从聚集体中区分出来。
图36描述了拉曼光谱和采用ABT-874样品的主成分分析模型化的光谱，表明聚集样品有明显的主成分得分，并且使用拉曼光谱可以将其从聚集体中区分出来。
图37A-B描述了拉曼光谱和采用(A) D2E7样品和(B) ABT-974样品的偏最小二乘分析模型化的光谱，表明拉曼光谱结果和SEC测量结果之间的一些相关性。
5.具体实施方式
本发明涉及用于抗体(例如单克隆抗体)的色谱纯化的组合物和方法，其采用改进的模拟移动床分离策略。为了清楚起见且非限制性地，该详述分成下述亚部分：
5.1. 定义；
5.2. 抗体生成；
5.3. 抗体制备；
5.4. 抗体纯化；
5.5 示例性纯化策略；和
5.6 拉曼光谱。
5.1. 定义
术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其由通过二硫键互连的4条多肽链――2条重(H)链和2条轻(L)链组成。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域――CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域――CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDRs)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包括抗体的片段，其保留与抗原特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段实例包括(i)Fab片段，包括VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)包括VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)包括抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(v)包括VH结构域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546，其完整教导引入本文作为参考)；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单一蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883，其完整教导引入本文作为参考)。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生2个抗原结合位点(参见例如，Holliger，P.，等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak，R. J.，等人(1994)Structure 2:1121-1123，其完整教导引入本文作为参考)。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫粘附素分子的一部分。此种免疫粘附素分子的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S. M.，等人(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6:93-101，其完整教导引入本文作为参考)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标签，以制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人(1994)Mol. Immunol. 31:1047-1058，其完整教导引入本文作为参考)。抗体部分例如Fab和F(ab')2片段可以使用常规技术由完整抗体制备，例如完整抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附素分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的。在一个方面，抗原结合部分是完整结构域或完整结构域对。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语是指编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等人(1971)Ann. NY Acad，Sci.190:382-391和Kabat，E. A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242，其完整教导引入本文作为参考)。对于重链可变区，高变区范围为关于CDR1的氨基酸位置31-35、关于CDR2的氨基酸位置50-65和关于CDR3的氨基酸位置95-102。对于轻链可变区，高变区范围为关于CDR1的氨基酸位置24-34、关于CDR2的氨基酸位置50-56和关于CDR3的氨基酸位置89-97。
术语“人抗体”包括具有与人种系免疫球蛋白序列对应的可变和恒定区的抗体，如由Kabat等人描述的(参见Kabat，等人(1991)Sequences of proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。突变可以使用选择性诱变方法引入。人抗体可以具有由氨基酸残基替换的至少一个位置，所述氨基酸残基例如不由人种系免疫球蛋白序列编码的活性增强氨基酸残基。人抗体可以具有由并非人种系免疫球蛋白序列的一部分的氨基酸残基替换的高达20个位置。在其他实施方案中，替换高达10个、高达5个、高达3个或高达2个位置。在一个实施方案中，这些替换在CDR区内。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不意欲包括此抗体，其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上。
短语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体，从重组、组合人抗体库中分离的抗体，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor，L. D.，等人(1992)Nucl. Acids Res. 20:6287-6295，其完整教导引入本文作为参考)，或通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述任何其他方法涉及剪接人免疫球蛋白基因序列为其他DNA序列。此种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(参见，Kabat，E. A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)。然而，在特定实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或当使用对于人Ig序列是转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是此序列，其虽然衍生自且涉及人种系VH和VL序列，但可能不天然存在于体内人抗体种系谱(repertoire)内。然而，在特定实施方案中，此种重组抗体是选择性诱变方法或回复突变或两者的结果。
“分离的抗体”包括基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与特定靶标特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合除特定靶标外的抗原的抗体)。特异性结合特定人靶标的分离的抗体可以结合来自其他物种的相同靶标。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学试剂。
如本文使用的，术语“Koff”意指抗体从抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。
如本文使用的，术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
短语“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但在一个方面，是双链DNA。
如本文提及编码如结合特定靶标的那些的抗体或抗体部分(例如，VH、VL、CDR3)的核酸使用的，短语“分离的核酸分子”包括核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码结合除特定靶标外的抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，所述其他序列可以在人基因组DNA中天然位于核酸侧面。短语“分离的核酸分子”还意欲包括编码二价、双特异性抗体的序列，例如其中VH和VL区不包含除双抗体序列外的其他序列的双抗体。
短语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)包括重组表达载体已引入其内的细胞。应当理解此种术语不仅意指具体主体细胞还指此种细胞的后代。因为特定修饰可以由于突变或环境影响而在随后世代中发生，所以此种后代事实上可以不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文使用的，术语“约”意指大于或小于参考值约10-20%的范围。在特定情况下，本领域技术人员将认识到由于参考值的性质，术语“约”可以意指距离所述值多于或小于10-20%的偏差。
如本文使用的，“色谱”是指用于从分子的混合物分离出所关注的靶标分子的分析技术，且依赖于在该混合物的组分中吸引至固相的选择性吸引力。实例包括亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和疏水相互作用色谱。
在涉及在混合物中的所关注的靶标分子的情况下，“纯化”表示其相对浓度(靶标的重量除以混合物中所有组分或部分的重量)增加至少20%。在一系列实施方案中，相对浓度增加至少约40%、约50%、约60%、约75%、约100%、约150%、或约200%。在从其纯化的组分的相对浓度(从其纯化的组分或部分的重量除以混合物中所有组分或部分的重量)减少至少约20%、约40%、约50%、约60%、约75%、约85%、约95%、约98%或约100%的情况下，所关注的靶标分子也可称为纯化。在又一系列实施方案中，所关注的靶标分子经纯化到至少约50%、约65%、约75%、约85%、约90%、约97%、约98%、或约99%的相对浓度。在一个实施方案中所关注的靶标分子是与其他组分或部分“分离”的情况下，应理解，在另一个实施方案中该组分或部分是以本文中所提供的水平进行纯化的。
5.2. 抗体生成
如该章节中使用的，术语“抗体”是指完整抗体或其抗原结合片段。
本公开内容的抗体可以通过多种技术生成，包括用所关注的抗原免疫接种动物随后为常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交程序是典型的，但原则上可以采用用于制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的一种典型动物系统是鼠系统。杂交瘤制备是非常良好确立的程序。用于分离用于融合的免疫接种的脾细胞的免疫接种规程和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
抗体典型地可以是人、嵌合或人源化抗体。本公开内容的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的非人单克隆抗体序列进行制备。编码重和轻链免疫球蛋白的DNA可以得自关注的非人杂交瘤，并且使用标准分子生物学技术工程改造为包含非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，鼠可变区可以使用本领域已知的方法与人恒定区连接(参见例如授予Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见例如授予Winter的美国专利号5,225,539，和授予Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在一个非限制性实施方案中，本公开内容的抗体是人单克隆抗体。此种人单克隆抗体可以使用转基因或转染色体(transchromosomic)小鼠生成，所述转基因或转染色体小鼠携带人免疫系统而不是小鼠系统的部分。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中被称为HuMAb Mouse®(Medarex，Inc.)、KM Mouse®(Medarex，Inc.)和XenoMouse®(Amgen)的小鼠。
此外，表达人免疫球蛋白基因的可替代转染色体动物系统是本领域可获得的，并且可以用于产生本公开内容的抗体。例如，可以使用被称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；此种小鼠在Tomizuka等人(2000)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97:722-727中描述。此外，携带人重和轻链转染色体的牛已在本领域中得到描述(例如，Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894和PCT申请号WO 2002/092812)，并且可以用于产生本公开内容的抗体。
本发明的重组人抗体可以通过筛选重组组合抗体库进行分离，例如使用由衍生自人淋巴细胞的mRNA制备的人VL和VH cDNAs制备的scFv噬菌体展示库。用于制备且筛选此库的方法是本领域已知的。除用于生成噬菌体展示库的商购可得的试剂盒外(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612，其完整教导引入本文)，特别适合于在生成和筛选抗体展示库中使用的方法和试剂的实例可以在例如下述中找到：Ladner等人美国专利号5,223,409；Kang等人PCT公开号WO 92/18619；Dower等人PCT公开号WO 91/17271；Winter等人PCT公开号WO 92/20791；Markland等人PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人PCT公开号WO 92/09690；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人(1992)Hum AntibodHybridomas 3:81-85；Huse等人(1989)Science 246:1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348:552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J 12:725-734；Hawkins等人(1992)J MolBiol 226:889-896；Clackson等人(1991)Nature 352:624-628；Gram等人(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrard等人(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等人(1991)NucAcid Res 19:4133-4137；和Barbas等人(1991)PNAS 88:7978-7982；其完整教导引入本文。
本公开内容的人单克隆抗体还可以使用人免疫细胞已重构到其内，从而使得人抗体应答可以在免疫接种后生成的SCID小鼠进行制备。此种小鼠在例如授予Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述。
在本发明的另外一个实施方案中，可以改变抗体或其片段，其中修饰抗体的恒定区以相对于未修饰抗体减少至少一种恒定区介导的生物学效应子功能。为了修饰本发明的抗体，从而使得它显示出与Fc受体减少的结合，抗体的免疫球蛋白恒定区区段可以在Fc受体(FcR)相互作用所必需的特定区域上进行突变(参见例如，Canfield和Morrison(1991)J.Exp. Med. 173:1483-1491；和Lund等人(1991)J. of Immunol. 147:2657-2662，其完整教导引入本文)。抗体的FcR结合能力的减少还可以减少依赖于FcR相互作用的其他效应子功能，例如调理作用和吞噬作用和抗原依赖性细胞毒性。
5.3. 抗体制备
为了表达本发明的抗体，将编码部分或全长轻和重链的DNAs插入一种或多种表达载体内，从而使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。(参见例如，美国专利号6,914,128，其完整教导引入本文作为参考)。在该背景中，术语“可操作地连接”意指抗体基因这样连接到载体内，从而使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。表达载体和表达控制序列选择为与所使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入分开的载体内，或更一般地，2种基因都插入到相同表达载体内。抗体基因通过标准方法插入表达载体内(例如，在抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，那么平端连接)。在插入抗体或抗体相关的轻或重链序列前，表达载体可以已携带抗体恒定区序列。例如，将特定的VH和VL序列转变为全长抗体基因的一种方法是将其分别插入已编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，从而使得VH区段与载体内的一个或多个CH区段可操作地连接，并且VL区段与载体内的CL区段可操作地连接。另外或可替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体内，从而使得信号肽与抗体链基因的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因外，本发明的重组表达载体可以携带一种或多种调节序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调节序列”意欲包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。此种调节序列例如在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述，其完整教导引入本文作为参考。本领域技术人员将认识到，表达载体的设计包括调节序列的选择可以依赖于此种因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调节序列包括指导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如，Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等人的美国专利号4,510,245、和Schaffner等人的美国专利号4,968,615，其完整教导引入本文作为参考。
除抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体还可以携带一种或多种另外序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和/或选择标记基因。选择标记基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如，全部为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017，其完整教导引入本文作为参考)。例如，一般地，选择标记基因对载体已引入其内的宿主细胞赋予针对药物的抗性，所述药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。合适的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(通过氨甲蝶呤选择/扩增用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
本发明的抗体或抗体部分可以通过免疫球蛋白轻和重链基因在宿主细胞中的重组表达进行制备。为了重组表达抗体，用携带编码抗体的免疫球蛋白轻和重链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，从而使得轻和重链在宿主细胞中表达且分泌到宿主细胞在其中培养的培养基内，从所述培养基中可以回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重和轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体内，并且将载体引入宿主细胞内，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.,(1989)，Ausubel等人(编辑)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)以及美国专利号4,816,397和6,914,128中描述的那些，其完整教导引入本文。
为了表达轻和重链，通过标准技术将编码重和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞内。各种形式的术语“转染”意欲包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中表达抗体是合适的，因为此种真核细胞且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配且分泌正确折叠且免疫学活性的抗体。已报道抗体基因的原核表达对于制备高收率的活性抗体是无效的(Boss和Wood(1985)Immunology Today 6:12-13，其完整教导引入本文作为参考)。
用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于该目的的合适原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(E. coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及杆菌(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)(例如于1989年4月12日公开的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种合适的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)、和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是举例说明性而不是限制性的。
除原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于多肽编码载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或通常的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株是通常可得且在本文中有用的，例如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)宿主例如乳酸克鲁维氏酵母(K. lactis)、脆壁克鲁维氏酵母(K. fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维氏酵母(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维氏酵母(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦尔特克鲁维氏酵母(K. waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维氏酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维氏酵母(K. thermotolerans)、和马克斯克鲁维氏酵母(K. marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichodermareesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺氏酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌例如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A. nidulans)和黑色曲霉(A. niger)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了众多杆状病毒毒株和变体以及来自宿主的相应允许昆虫宿主细胞，例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒毒株是可公开获得的，例如苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5毒株，并且此种病毒可以根据本发明在本文中用作病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
用于表达本发明的重组抗体的合适哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin,(1980)PNAS USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与DHFR选择标记一起使用，例如如Kaufman和Sharp(1982)Mol. Biol. 159:601-621中描述的，其完整教导引入本文作为参考)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过使宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内的一段时间，产生抗体。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(用于在悬浮培养中生长的亚克隆的293或293细胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(sertoli cell)(TM4，Mather，Biol. Reprod. 23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)，其完整教导引入本文作为参考。
宿主细胞用上述表达或克隆载体转化用于抗体制备，并且在适当修饰的常规营养培养基中培养，用于诱导启动子、选择转化体、或扩增编码所需序列的基因。
用于制备抗体的宿主细胞可以在多种培养基中进行培养。商购可得的培养基例如Ham's F10™(Sigma)、Minimal Essential Medium™((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco's Modified Eagle's Medium™((DMEM)，Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，Ham等人，Meth. Enz. 58:44(1979)，Barnes等人，Anal. Biochem. 102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利号Re. 30,985中描述的任何一种培养基都可以用作用于宿主细胞的培养基，其完整教导引入本文作为参考。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补加有激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等价能源。任何其他必需的补充物也可以以本领域技术人员已知的合适浓度包括。培养条件例如温度、pH等是先前由选择用于表达的宿主细胞使用的那些，并且对于普通技术人员将是显而易见的。
宿主细胞还可以用于产生完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。应当理解关于上述程序的变化在本发明的范围内。例如，在特定实施方案中，可以希望用编码本发明抗体的轻链或重链(但并非两者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除编码轻和重链中任一或两者的一些或全部DNA，其并非是对于抗原结合所必需的。由此种截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包含。此外，通过标准化学交联方法使本发明的抗体与第二抗体交联，可以制备双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重和轻链对于除原始抗原外的抗原特异。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的合适系统中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化体宿主细胞，以允许抗体重和轻链表达，并且从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞且从培养基中回收抗体。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质间隙中产生、或直接分泌到培养基内。在一个方面，如果抗体在细胞内产生，那么作为第一个步骤，可以例如通过离心或超滤去除颗粒碎片，或者宿主细胞或者裂解的细胞(例如，起因于匀浆)。当抗体分泌到培养基内时，来自此种表达系统的上清液可以首先使用商购可得的蛋白质浓缩过滤器进行浓缩，例如Amicon™或Millipore Pellicon™超滤单元。
在本发明的方法前，用于从细胞碎片中纯化抗体的程序最初依赖于抗体的表达部位。一些抗体可以从细胞直接分泌到周围生长培养基内；其他在细胞内制备。对于后面的一类抗体，纯化方法的第一个步骤一般涉及：使细胞裂解，这可以通过多种方法完成，包括机械剪切、渗压震扰或酶促处理。此种破坏将细胞的完整内容物释放到匀浆内，并且另外产生由于其小尺寸难以去除的亚细胞片段。这些一般通过差速离心或通过过滤去除。当抗体被分泌时，来自此种表达系统的上清液一般首先使用商购可得的蛋白质浓缩过滤器进行浓缩，例如Amicon™或Millipore Pellicon™超滤单元。当抗体被分泌到培养基内时，重组宿主细胞还可以例如通过切向流过滤与细胞培养基分离。抗体可以使用本发明的抗体纯化方法从培养基中进一步回收。
5.4. 抗体纯化
5.4.1 一般地抗体纯化
本发明提供了用于从包括抗体和至少一种HCP的混合物中产生纯化的(或“HCP减少的”)抗体制剂的方法。当抗体已使用上文描述的方法和本领域的常规方法产生时，本发明的纯化方法以分离步骤开始。表1概括了纯化方案的一个实施方案。设想了该方案的变化，包括但不限于其中颠倒离子交换步骤次序的变化，并且在本发明的范围内。
表1 纯化步骤与其相关目的
纯化步骤 目的
初步回收 样品基质的澄清
亲和色谱 抗体捕获、宿主细胞蛋白质和相关杂质减少
低pH孵化 病毒减少/灭活
阴离子交换色谱 抗体捕获、宿主细胞蛋白质和相关杂质减少
疏水相互作用色谱 抗体聚集体和宿主细胞蛋白质的减少
病毒过滤 如果存在的话，大病毒的去除
超滤/渗滤 浓缩和缓冲液更换
最后过滤 浓缩和配制抗体
一旦已获得包括抗体的澄清的溶液或混合物，就使用不同纯化技术的组合执行抗体与由细胞产生的其他蛋白质例如HCPs的分离，所述不同纯化技术的组合包括一个或多个亲和分离步骤、一个或多个离子交换分离步骤和一个或多个疏水相互作用分离步骤。分离步骤基于其结合特性、电荷、疏水性程度或大小分离蛋白质的混合物。在本发明的一个方面，分离使用色谱执行，包括亲和、阳离子、阴离子和疏水相互作用。几种不同的色谱树脂可用于这些技术中的每种，从而允许纯化方案准确适合于所涉及的具体蛋白质。每种分离方法的本质是可以引起蛋白质以不同速率向下穿过柱，从而达到当它们进一步向下经过柱时增加的物理分离，或与分离介质选择性粘附，随后通过不同溶剂差异性洗脱。在一些情况下，当杂质与柱特异性粘附，并且抗体则不是时，即抗体存在于流通物中，抗体与杂质分离。
如上所述，纯化方案的准确适合依赖于待纯化蛋白质的考虑。在某些实施方案中，本发明的分离步骤用于使抗体与一种或多种HCPs分离。虽然本发明涉及一般地蛋白纯化，但其可以特别适合抗体纯化。例如，可以使用本文描述的方法成功地纯化的抗体包括但不限于：人IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM抗体。在特定实施方案中，本发明的纯化策略排除蛋白A亲和色谱的使用，例如在IgG3抗体纯化的背景中，这是因为IgG3抗体与蛋白A无效率地结合。允许纯化方案特异性适合的其他因素包括但不限于：Fc区的存在或不存在(例如，在全长抗体的背景中，与其Fab片段相比较)，因为蛋白A与Fc区结合；在生成目的抗体中采用的具体种系序列；和抗体的氨基酸组成(例如，抗体的一级序列以及分子的总电荷/疏水性)。共享一种或多种特征的抗体可以使用适合于利用那种特征的纯化策略进行纯化。
5.4.2. 模拟移动床色谱
如上文所述，抗体纯化典型地包括一个或多个色谱分离步骤。虽然此色谱分离步骤通常以批处理方式来进行，但是此批处理方式分离可导致纯化过程明显低效率。例如，因为批处理方式中色谱柱的使用只需要柱子被加载至其动态容量，所以批处理方式需要使用比如果柱子被加载至其饱和容量多两到三倍以上的树脂。这种低效率可大大增加总成本，因为蛋白色谱树脂通常是非常昂贵的。此外，批柱色谱中的洗涤和洗脱过程需要大量的液体体积，这不仅增加了纯化过程的成本，而且还大大增加了完成这种分离所需要的时间。
在某些实施方案中，本发明涉及一个或多个模拟移动床(SMB)色谱分离的使用。在某些实施方案中，此SMB分离排除(in addition to)或取代一个或多个传统的批处理方式分离。由于SMB色谱分离涉及使用加载至更接近其饱和容量的柱子，因此它们需要更小体积的色谱树脂。此外，由于SMB分离允许进行更有效的洗涤和洗脱过程，因此SMB分离的使用导致缓冲液的消耗大幅减少和更省时的纯化过程。
在某些实施方案中，SMB系统将包括用固相色谱载体充填的一个或多个组件。此载体包括但不限于亲和色谱树脂、离子交换色谱树脂和疏水相互作用色谱树脂。在某些实施方案中，假如该系统包括至少两个色谱柱，则特定的组件可以包括一个或多个色谱柱。在某些实施方案中，每个组件的各个方面以及多组件系统中的每个组件彼此间是流体连通的。在某些实施方案中，此流体连通通过相互连接的流体导管来实现。在某些实施方案中，此导管通过阀门或其他装置分离开，以允许流体的引入和/或移出。
在本发明的某些实施方案中，流体导管相互连接SMB系统的上流和下流端以形成回路，通过该回路流体混合物连续循环。在某些点可以引入流体流和在其他的点可以移出流出液流。在某些实施方案中，提供导管和阀门的歧管系统以选择性地放置进料的入口、洗脱缓冲液的入口、分离组分的出口和未结合(或较少结合)组分的出口。在某些实施方案中，每个入口和出口点与分离的组件或柱子连通。例如，在某些实施方案中，进料在指定点进入系统并通过连续的内部再循环流动通过固相。该移动接触导致进料组分的色谱分离。以相对快速率流动的未结合组分从未结合组分出口移除，例如通过第一洗涤流出液流的移除。将使结合化合物与固相分离的缓冲液在结合和未结合组分各自出口阀门位置之间的入口阀门处加入。
在某些实施方案中，将指定的入口和出口阀门位置向下流移动从歧管上的一个位置至下一个固相床柱。选择该步骤的时间使得阀门的指定与内部再循环流动完全同步。在这些条件下，系统最终达到稳定状态，特定的产品特性在每个阀门的位置以预定的间隔依次出现。该类型的系统模拟单个位置固定的阀门，而固相以恒定和连续的速率围绕每个阀门产生恒定质量产物的再循环回路移动。在某些实施方案中，可以采用另一装置，其中柱子通过手动或机械传送带进行物理移动，而阀门的位置保持固定。
SMB分离过程接近实际的移动床系统的特征，因为组件和阀门位置的数目增加。在某些实施方案中，组件的数量将高达2、3、4、5、6、7、8、9或10，其中每个组件包括一个或多个独立的色谱柱。在特定的实施方案中，SMB系统将包括4或8个色谱柱。
在某些实施方案中，模拟移动床过程在亲和色谱的背景下使用。在某些实施方案中，色谱材料能够选择性或特异性结合所关注的抗体。此色谱材料的非限制性实例包括：蛋白A、蛋白G、含与所关注的抗体结合的抗原的色谱材料和含Fc结合蛋白的色谱材料。在特定的实施方案中，该亲和色谱步骤涉及将初级回收样品呈递至含合适的蛋白A树脂的柱。蛋白A树脂可用于各种抗体同种型的亲和纯化和分离，特别是IgG1、IgG2和IgG4。蛋白A是一种细菌的细胞壁蛋白，主要通过其Fc区与哺乳动物的IgGs结合。在其自然状态下，蛋白A有五个IgG结合结构域以及功能未知的其他结构域。
在某些实施方案中，模拟移动床过程在离子交换色谱的背景下使用。离子交换分离包括两种物质基于其各自的离子电荷的差异而被分离的任何方法，并且可以使用阳离子交换材料或阴离子交换材料。
阳离子交换材料与阴离子交换材料的使用是基于蛋白质的总电荷。因此，在使用阳离子交换步骤前采用阴离子交换步骤，或在使用阴离子交换步骤前采用阳离子交换步骤均在本发明的范围之内。此外，仅采用阳离子交换步骤，仅采用阴离子交换步骤，或两者的任何系列组合均在本发明的范围之内。
离子交换色谱也可以用作离子交换分离技术。离子交换色谱基于分子总电荷之间的差异来分离分子。对于抗体的纯化，该抗体必须具有与离子交换材料(例如树脂)附着的官能团相反的电荷，以便结合。例如，在pH值低于其pI的缓冲液中通常具有总正电荷的抗体可很好地与含负电荷官能团的阳离子交换材料结合。
在离子交换色谱中，假如周围缓冲液的离子强度低，在溶质表面上的带电小块可被与色谱基质相连的相反电荷吸引。洗脱一般通过增加缓冲液的离子强度(即，导电性)来实现，以与溶质竞争离子交换基质的带电位点。改变pH并从而改变溶质的电荷是实现溶质洗脱的另一种方式。导电性或pH的变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或分步的(分步洗脱)。
阴离子或阳离子取代基可连接到基质以形成用于色谱的阴离子或阳离子载体。阴离子交换取代基的非限制性实例包括二乙基氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)和季胺(Q)基团。阳离子取代基包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸基(P)和磺酸基(S)。纤维素离子交换树脂例如DE23™、DE32™、DE52™、CM-23™、CM-32™和CM-52™可从WhatmanLtd. Maidstone，Kent，U.K获得。SEPHADEX®类和-locross-linked的离子交换剂也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP-SEPHADEX®以及DEAE-、Q-、CM-和S-SEPHAROSE®和SEPHAROSE® Fast Flow都可从Pharmacia AB获得。另外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物，例如TOYOPEARL™ DEAE-650S或M和TOYOPEARL™ CM-650S或M可从TosoHaas Co.，Philadelphia，Pa获得。
离子交换步骤促进所关注抗体的捕获，同时减少杂质如HCPs。在某些方面，离子交换柱是阳离子交换柱。例如，但不限于，用于此阳离子交换柱的合适树脂是CM HyperDF™树脂。这些树脂可从商业来源例如Pall Corporation获得。这种阳离子交换程序可以在室温或大约室温进行。
在某些实施方案中，所述模拟移动床过程在疏水相互作用色谱(“HIC”)的背景下使用。鉴于离子交换色谱依赖于抗体的电荷来隔离它们，疏水相互作用色谱使用抗体的疏水性。抗体上的疏水性基团与柱子上的疏水性基团相互作用。蛋白质的疏水性越强，与柱子的相互作用越强。因此，HIC步骤去除宿主细胞衍生的杂质(例如，DNA和其他高和低分子量的产品相关的物质)。
疏水相互作用在高离子强度下是最强的，因此，这种形式的分离在盐沉淀或离子交换程序后方便地执行。高盐浓度对抗体与HIC柱的吸附是有利的，但实际浓度根据抗体的性质和所选择的特定HIC配体可以在很宽的范围内变化。各种离子可以以所谓的憎溶(soluphobic)系列排列，这依赖于其是促进疏水相互作用(盐析效应)还是破坏水的结构(离液效应)，并且导致疏水相互作用的减弱。阳离子就渐增的盐析效应而言排序为Ba++；Ca++；Mg++；Li+；Cs+ ；Na+ ；K+ ；Rb+ ；NH4+，而阴离子可以就渐增的离液效应而言排序为PO--- ；SO4-- ；CH3CO3 - ；Cl- ；Br- ；NO3- ；ClO4- ；I- ；SCN-。
一般情况下，Na、K或NH4硫酸盐有效促进HIC中的配体-蛋白质相互作用。可以配制影响相互作用强度的盐，如由下述关系给出的：(NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4Cl >NaBr > NaSCN。一般情况下，约0.75-约2 M硫酸铵或约1-4 M NaCl的盐浓度是有用的。
HIC柱通常包括疏水配体(例如，烷基或芳基)与之偶联的基本基质(例如，交联琼脂糖或合成共聚物材料)。合适的HIC柱包括被苯基基团取代的琼脂糖树脂(例如，PhenylSepharose™柱)。许多HIC柱是商购可得的。实例包括但不限于：具有低或高取代的PhenylSepharose™ 6 Fast Flow柱(Pharmacia LKB Biotechnology，AB，瑞典)；PhenylSepharose™ High Performance柱(Pharmacia LKB Biotechnology，AB，瑞典)；OctylSepharose™ High Performance柱(Pharmacia LKB Biotechnology，AB，瑞典)；Fractogel™ EMD Propyl或Fractogel™ EMD Phenyl柱(E. Merck，德国)；Macro-Prep™ Mehyl或Macro-Prep™ t-Butyl Supports(Bio-Rad，California)；WP HI-Propyl(C3)™柱(J. T.Baker，New Jersey)；和Toyopearl™醚、苯基或丁基柱(TosoHaas，PA)。
5.5. 示例性纯化策略
在某些实施方案中，该SMB分离过程将采用一系列的蛋白A柱。在一个特定的、非限制性的实例中，SMB分离过程将采用四个蛋白A柱。在特定的实施方案中，四个蛋白A柱的直径为1.6 cm且高度为5 cm，并充填有MabSelect蛋白A树脂。在可替代的实施方案中，可以使用另外的柱子，例如，5、6、7、8、9或10个柱，并且柱子可具有大得多的直径和高度，导致充填柱的体积高达约2、高达约3、高达约4、高达约5、高达约6、高达约7、高达约8、高达约9、高达约10、高达约11、高达约12、高达约13、高达约14、高达约15、高达约16、高达约17、高达约18、高达约19、高达约20、高达约25、高达约30、高达约40、高达约50、高达约60、高达约70、高达约80、高达约90、高达约100或更多升。
在某些实施方案中，特定SMB分离方案中采用的每个蛋白A柱在样品加载前可以用合适的缓冲液平衡。合适的缓冲液的非限制性实例是Tris缓冲液，pH值约为7.2。合适的平衡条件的非限定性的实例是350 mM Tris，pH约为7.2。该平衡之后，可以将样品加载到柱上。柱的装载完成后，可以使用例如平衡缓冲液将该柱洗涤一次或多次。其他的洗涤(包括采用不同的缓冲液洗涤)可以在洗脱柱前进行。例如，可以使用一个或多个柱体积的25 mM的Tris（pH约为7.2）进行柱的洗涤。该洗涤后可以任选地使用平衡缓冲液洗涤一次或多次。然后蛋白A柱可以使用适当的洗脱缓冲液进行洗脱。合适的洗脱缓冲液的非限定性实例是醋酸/NaCl缓冲液，pH约为3.5。合适的条件为例如0.1M醋酸，pH约为3.5。洗脱液可以使用本领域技术人员所熟知的技术进行监测。例如，可以遵循在OD280处的吸光度。可以从初始偏转为约0.5 AU开始收集柱的洗脱液，直至洗脱峰后缘处的读数为约0.5 AU。然后所关注的洗脱组分可以准备用于进一步处理。例如，使用pH约为10的Tris(例如，1.0 M)将所收集的样品滴定至pH约为5.0。任选地，该滴定样品可被过滤并进一步处理。
在某些实施方案中，样品装载被计算产生特定的目标保留时间。在特定的实施方案中，样品装载被计算以使得目标保留时间为约0.5至约12分钟，在某些实施方案中，其选自高达约0.5、高达约1、高达约2、高达约3、高达约4、高达约5、高达约6、高达约7、高达约8、高达约9或高达约10分钟。在某些实施方案中，目标保留时间为3分钟。在某些实施方案中，样品装载也被计算产生高达约50、高达约60、高达约70、高达约80、高达约90或高达约100%的柱的饱和结合容量。
在某些实施方案中，SMB分离过程涉及用于平衡、装载、洗涤、洗脱、再生和存储缓冲液的引入的特定程序。在某些实施方案中，该程序将由三个部分组成：第1次运行、第2次至第(n-1)次运行和最后一次运行。此程序的非限定性实例如下：
在某些实施方案中，第一个洗涤步骤采用与平衡缓冲液相同的缓冲液。在某些实施方案中，第一个洗涤步骤可以结合到样品装载步骤中。在某些实施方案中，洗涤、洗脱和再生步骤可以被计算和编排以保持装载时间为运行时间的约50%。
5.5. 拉曼光谱
拉曼光谱基于以下原则：单色入射辐射到材料上将以特定的方式发生反射、吸收或散射，这取决于接收辐射的特定分子或蛋白质。虽然大部分能量以相同的波长散射(瑞利散射)，但少量(例如，10-7)辐射以一些不同的波长散射(斯托克斯和反斯托克斯散射)。该散射与转动、振动和电子能级跃迁有关。散射光子波长的变化提供了化学和结构信息。
在某些实施方案中，可以对多组分混合物(例如本文所述的SMB技术的上下文中所采用的那些)执行拉曼光谱以提供一种具有高度特异性的组分的“指纹”。由混合物的拉曼光谱分析引起的光谱指纹将是每个单独组分的叠加。谱带的相对强度与特定组分的相对浓度有关。因此，在某些实施方案中，拉曼光谱可用于定性地和定量地表征组分混合物。因此，在某些这样的实施方案中，拉曼光谱可用于监测和/或确定涉及制备本发明的HCP减小的目标蛋白质制剂的一种或多种多组分混合物的组成。
拉曼光谱可用于表征大多数的样品，包括固体、液体、浆液、凝胶、薄膜、粉末和一些气体，并具有很短的信号采集时间。一般情况下，样品可以直接取自待解决(at issue)的生物过程，而不需要特殊的制备技术。另外，入射光和散射光可以经长距离传输，从而允许远程监控。此外，由于水仅提供微弱的拉曼散射，因此水溶液样品可以进行表征而没有水的显著干扰。
本文所述的适用过程和组合物可基于市售的拉曼光谱分析仪进行分析。例如，可以采用RamanRX2™分析仪，或Kaiser Optical Systems, Inc. (Ann Arbor，MI)销售的其他分析仪。另外，拉曼分析仪可购自例如PerkinElmer (Waltham，MA)、Renishaw(Gloucestershire，UK)和Princeton Instruments (Trenton，NJ)。市售的拉曼光谱分析仪的技术细节和操作参数可以从各自的供应商获得。
合适的曝光时间、样品大小和采样频率可以基于例如拉曼光谱分析仪和所采用的过程(例如，在提供UF/DF生物过程操作的实时监测的过程中)来确定。同样，适当的探头放置也可以基于分析仪和其采用的过程来确定。例如，用于水浸探头以提供足够信号的样品大小可以是小于20 mL，或小于10 mL(例如，8 mL或以下)。提供足够信号的曝光时间可以是小于2分钟，或小于1分钟(例如，30秒)。
对于需要量化的组分以及在多于一种pH依赖性离子化形式下存在的组分(例如，组氨酸)，拉曼光谱校准可以在不同的浓度和/或在各种pH下进行以预测给定的pH范围内的浓度，使得组分(例如，组氨酸)的测量是非pH依赖性的。例如，不同的pH依赖性的形式的组氨酸校准模型可用于测量和定量不同的离子化形式的组氨酸，使得可以确定溶液性质。可以执行信号处理，其可以包括强度校正(例如，标准正态变量(SNV))和/或基线校正(例如，一阶导数)。
曝光时间可以通过测定典型的测试溶液的CCD饱和来确定，并确保他们在可接受的仪器范围内(例如，40-80%)。
在一些实施方案中，采用pH控制或pH范围建模用于特定的组分(例如，缓冲液，如组氨酸)。在一些实施方案中，入射光被减到最小，这可以例如通过使用盖子来实现以阻止周围光源干扰光谱(例如，铝箔)。
在某些实施方案中，其中例如，将蛋白质(例如抗体)和不带电物质一起浓缩，蛋白质占溶液的显著体积，除去了显著量的溶质。这导致不带电物质浓度的净减少。该效应被称为“体积排阻(volume exclusion)”，这与蛋白质浓度成正比。
在某些实施方案中，例如涉及带电组分测定的那些实施方案，发生唐南(Donnan)效应，因为在较高的浓度下蛋白质电荷对溶液中的总带电物质的贡献变得显著。由于预期在膜的任一侧建立平衡，因此电中性需求导致膜的截留侧上的正电荷物质(例如，缓冲液物质)的净减少。这种现象被称为唐南效应。
根据本申请的的某些实施方案，采用RamanRX2™分析仪。该分析仪以及其他市售的拉曼分析仪提供监控多达四个通道的同步全光谱范围的能力。在某些实施方案中，采用标准的NIR激光激发以使样品兼容性最大化。可采用可编程的连续监测格式，例如通过RamanRX2™分析仪，并且该装置与过程光学是兼容的，这使得从发现阶段到制备阶段可采用一种分析仪类型。便携外壳和光纤采样接口允许分析仪在多个位置使用。
本发明公开主题的某些实施方案中，用拉曼光谱表征含有预定量的已知组分的至少一种多组分混合物标准品(即，多组分混合物标准品)以获得用于具有未知组分和/或未知浓度的已知或未知组分的混合物的模型(例如，校准曲线)。优选地，通过拉曼光谱表征含有预定量的已知组分的一系列多组分混合物标准品以获得模型。
获得用于具有未知组分和/或未知浓度的已知或未知组分的混合物的模型的方法可以通过本领域技术人员确定。例如，偏最小二乘回归分析基于预计存在于多组分测试混合物中的主要组分。此外，可以使用可从拉曼光谱供应商获得的软件程序来设计多组分混合物标准品，这反过来可以用来开发用于多组分测试混合物的模型。
应理解，参考“提供具有预定量的已知组分的多组分混合物标准品”和“对多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析”，以及更一般​​地，开发一种表征具有未知组分或未知浓度的组分的多组分混合物的模型包括平行分析(即，“在线”获得的数据)，以及参考用于多组分混合物标准品(即，具有已知浓度的已知组分的多组分混合物)的先前获得的或先前记录的结果(例如，拉曼光谱指纹)。例如，参考从包含“提供具有预定量的已知组分的多组分混合物标准品”和“对多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析”的供应商产品文献中获得的拉曼光谱结果。
本申请的某些实施方案采用拉曼光谱技术表征生物过程操作(包括但不限于SMB操作)中使用的组分(例如，多组分混合物)。例如，在某些实施方案中，拉曼光谱可用于表征意欲与SMB分离的上下文中的生物活性剂(例如，单克隆抗体)结合的制剂。这些制剂，有时被称为“制剂缓冲液”是确定生物制剂中赋形剂水平的典型多组分混合物。例如，该制剂一般包括一个或多个下述物质：pH缓冲液(例如，柠檬酸盐、Tris、醋酸盐或组氨酸混合物)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)、糖或糖醇(例如，甘露醇)和/或氨基酸(例如，L-精氨酸或甲硫氨酸)。制剂缓冲液的错误常导致不合格的批次，这反过来导致重大的损失。本文所公开的技术的使用可以减少或消除这样的低效率。
在某些实施方案中，拉曼光谱技术可用于识别蛋白聚合，例如但不限于，在SMB操作过程中可以形成的那些。例如但不限于，在某些实施方案中，本发明的拉曼光谱技术可以识别蛋白药物(Drug Substance)和药物制剂(Drug Product)样品的聚合，包括但不限于抗体药物(Drug Substance)样品和抗体药物制剂(Drug Product)样品。
在某些实施方案中，拉曼光谱可用于测试和表征存在于过滤操作(例如，超滤/渗滤过程)中的制剂，例如纯化生物活性剂(例如单克隆抗体)的过滤操作，包括但不限于与SMB操作结合执行的操作。例如但不限于，本发明的拉曼光谱技术可用于获得在线或离线所获得的样品以确定单个读数中存在的组分的身份(identity)和量(quantity)。在某些实施方案中，除了赋形剂的浓度外，可测定蛋白质浓度。在某些这样的实施方案中，可对0至150mg/ml范围内的蛋白浓度进行分析。
在某些实施方案中，拉曼光谱可用于监测、验证、测试并因此控制生物过程操作，例如但不限于，与SMB操作结合执行的那些。与生物过程操作(例如，色谱、过滤)一起使用的单元操作、pH变化、通过加入组分或稀释溶液导致的组成变化，均获得由有机或无机组分和生物分子组成的混合物。因此，快速和准确地测量中间体的组成(例如，通过使用拉曼光谱)提供了改善和保持操作和生物制品的一致性和质量的机会。
在某些实施方案中，通过拉曼光谱测量混合物中单个组分的组合物允许在有和没有生物分子的存在下准确地制备这样的混合物。例如，在某些实施方案中，这样的测量对制备广泛用在生物过程操作中的缓冲溶液将是有用的，利于提高制备的一致性或提供近实时制备缓冲溶液。在某些实施方案中，这将消除用于制备、储存和递送缓冲溶液的精细设备的需要。在某些实施方案中，拉曼光谱的使用允许测试并且可提供缓冲溶液的释放，其中缓冲液制剂中的潜在错误(例如，化学组分浓度、错误的化学试剂等)采用简单的仪器进行实时检测。可检测的制剂包括但不限于不含蛋白质的三组分制剂(缓冲液+糖+氨基酸)、蛋白质和糖制剂、蛋白质和表面活性剂制剂、以及蛋白质和缓冲液制剂。
在某些实施方案中，溶液组成的精确测量允许生物溶液的调整从而可以实现添加物(阴离子、阳离子、疏水性的、溶剂等)的正确目标组成。目前，这种测量是繁琐的并且需要复杂的分析方法，不适合实现实时使用。拉曼光谱的使用允许测量提供非常高程度的保证文件，这是监管行业的期望。
在某些实施方案中，本发明的技术允许能够监测和控制蛋白质-蛋白质反应、蛋白质-小分子反应和/或通过化学、物理或生物方法实现的蛋白质修饰。在某些这样的实施方案中，使用拉曼光谱监测反应物(其原始状态的生物性的)和产品(其最终状态的生物性的)以及其他化学或生物性质的反应物/催化剂的独特生化标记。以这种方式监测反应物和产品允许(除其他外)反应条件和反应物量的反馈控制。在某些实施方案中，也可能设计一种系统以除去反应副产物和/或产物从而不断优化、改善或保持该系统的产物质量或性能。
在某些实施方案中，拉曼光谱还允许在色谱操作(包括但不限于SMB操作)中生物产物的分离和纯化。在某些这样的实施方案中，产品/产品变体/产品异构体或杂质的洗脱可以进行监测，并可以根据所需的产品质量或工艺性能进行柱流出物的分馏。在某些实施方案中，也可以在其他单元操作(例如但不限于，过滤和非色谱分离)中应用拉曼光谱以分离/富集馏分。
在某些实施方案中，拉曼光谱能够用作一种非侵入性的工具。例如但不限于，拉曼光谱测量可以通过材料进行而不干扰信号。这在生物过程操作中提供了额外的独特优势，其中保持包含这些混合物的容器/器皿(vessels)的完整性是至关重要的。
在某些实施方案中，拉曼光谱可以是检测溶液被其他组分“污染”的极有价值的平均值。在某些这样的实施方案中，检测从一个纯化步骤到另一步骤的色谱载体或其部分的样品残留(carryover)。在某些实施方案中，该样品残留包括但不限于从蛋白A色谱载体中浸出的A蛋白。在某些这样的实施方案中，将从被污染的溶液所获得的拉曼光谱数据与用统计或光谱比较技术预期的光谱进行对比，并且如果不同的话，可以在将其用于生物过程前允许快速检测这些溶液制剂中的错误。
在某些实施方案中，如通过下面实例作为概念证据所证明的，可以使用拉曼光谱定量测量含杂质的混合物中抗体的浓度，所述混合物来自细胞培养收获材料，包括宿主细胞蛋白、DNA、脂质等。在这样的实施方案中，所述方法可用于监测含未纯化混合物的生物过程操作中的流入液和流出液。实例可以包括但不限于对柱、过滤器和非色谱分离装置(膨胀床、流化床、两相萃取等)的装载和洗脱操作。所提供的实例表明，0.1至1 g/L的抗体浓度可以在基质中定量，所述基质包括蛋白A亲和色谱柱的未结合部分，该色谱柱装载有基于化学成分确定的培养基的细胞培养过程制备的澄清收获溶液。如果拉曼光谱被串联合并，那么这种测量将实现柱装载的直接监测和控制，从而实现在预定结合容量下柱的一致和最佳负荷，该预定结合容量代表动态结合容量或静态(平衡)容量的百分比。本领域技术人员将认识到，该技术可以适用于如上所述的各种其他操作。
在某些实施方案中，拉曼光谱可用于生物过程纯化操作的质量控制和/或反馈控制(例如，控制串联缓冲液稀释以用于治疗性抗体纯化过程)。在某些这样的实施方案中，拉曼光谱可用于涉及蛋白结合反应或其他化学反应(例如，液相Heck反应)过程的质量控制和/或反馈控制，如Anal. Chem., 77:1228-1236 (2005)中所描述，其在此整体引入作为参考。
6.实施例
6.1. 个案分析：mAb X
采用mAb X过程中间体作为原料流，典型的基于琼脂糖的亲和蛋白A色谱介质作为亲和色谱树脂进行个案分析。8个循环全部采用四个柱运行。将每个柱装载到饱和，图4示出了所得到的色谱图。偶数UV峰表示洗脱，奇数UV峰表示装载后立即洗涤1次。
以下缓冲液可用于所有SMB运行：
线位置 缓冲液
平衡/洗涤1 350mM Tris，pH 7.2
洗涤2 25mM Tris，pH 7.2
洗脱 100mM醋酸钠，pH 3.5
再生 200mM 醋酸
存储 50mM 醋酸钠，pH 5.0，2%苯甲醇。
下表概述了mAb X的SMB纯化程序。有三部分程序：第一次运行、第2次至第(n-1)次运行和最后一次运行。装载2模块根据饱和结合能力(SBC)研究的曲线下面积(AUC)计算(参见下文)。注意，下面的分离过程均在小于真正的SBC 20%下进行。第一次分离过程在1分钟的保留时间进行，第二次在3分钟的保留时间进行。
图8中的数据显示mAb X的饱和结合能力(SBC)研究。采用Poros A HPLC试验对柱的流通进行分析，以确定未结合到柱上的产品量。与典型的40 g/L的结合(“动态结合”)相比，饱和结合能力高达73 g/L的曲线下面积(AUC)表明通过SMB所达到的改进。将该AUC从饱和结合能力中减去以计算第2次循环至最后一次循环的装载量(参见图8)。
6.2. 个案分析mAb Y
采用mAb Y过程中间体作为原料流，和典型的基于琼脂糖的亲和蛋白A色谱介质作为亲和色谱树脂进行个案分析。8个循环全部采用四个柱运行。将每个柱加载到饱和，图6示出了所得到的色谱图。偶数UV峰表示洗脱，奇数UV峰表示加载后立即洗涤1次。
这些缓冲液可用于所有SMB运行：
线位置 缓冲液
平衡/洗涤1 350mM Tris，pH 7.2
洗涤2 25mM Tris，pH 7.2
洗脱 100mM 醋酸钠，pH 3.5
再生 200mM 醋酸
存储 50mM 醋酸钠 pH 5.0，2%苯甲醇。
下表概述了mAb Y的SMB纯化程序。有三部分程序：第一次运行、第2次至第(n-1)次运行和最后一次运行。装载2模块根据饱和结合能力(SBC)研究的曲线下面积(AUC)计算(参见下文)。计算洗涤1、洗涤2和再生步骤以保持装载时间为运行的50%，并计算装载步骤以产生3分钟的保留时间。注意，下面的分离过程均在小于真正的SBC 20%下进行。
图8中的数据显示mAb Y的饱和结合能力(SBC)研究。采用Poros A HPLC试验对柱的流通进行分析，以确定未结合到柱上的产品量。与典型的45 g/L的结合(“动态结合”)相比，饱和结合能力高达86 g/L的AUC表明通过SMB所达到的改进的结合能力。将该AUC从饱和结合能力中减去以计算第2次循环至最后一次循环的装载量(参见图9)。
6.3. 个案分析mAb X，杂质样品残留的检测
采用mAb X进行第二次SMB分离。在该分离中，mAb X存在于化学成分确定的培养基中。8个循环全部采用四个柱运行。将每个柱加载到饱和。以下缓冲液可用于所有SMB运行：
线位置 缓冲液
平衡/洗涤1 350mM Tris，pH 7.2
洗涤2 25mM Tris，pH 7.2
洗脱 100mM 醋酸钠，pH 3.5
再生 200mM 醋酸
存储 50mM 醋酸钠，pH 5.0，2%苯甲醇。
下表概述了mAb X的SMB纯化程序。有三部分程序：第一次运行、第2次至第(n-1)次运行和最后一次运行。装载2模块根据饱和结合能力(SBC)研究的曲线下面积(AUC)计算。注意，下面的分离过程均在小于真正的SBC 20%下进行。第一次分离过程在1分钟的保留时间进行，并且第二次在3分钟的保留时间进行。
该SMB分离的总产率为85%。进行的分析检测包括Poros A试验以确定mAb浓度和蛋白A可滤取的ELISA从而确定每次洗脱运行后蛋白A样品残留的存在。后者表示第二次循环(第5-8次洗脱运行)中蛋白A可滤取的比第一次循环(第1-4次洗脱运行)高，表明该杂质的一些样品残留效应。
6.4. 个案分析中试规模的mAb Z
将上述的蛋白A过程扩大至中试规模，并在mAb Z分离的背景下使用。三个柱(各10 cm直径×8 cm高，785 mL)用蛋白A色谱载体填充。与上文所述的小规模分离相似，柱切换采用手动操作。只有三个柱，工作流程可以按图10中所示进行。
mAb Z细胞培养收获物被酸化以沉淀细胞和细胞碎片。这些杂质的沉淀改善了随后离心的有效性，并增加了深度过滤器和膜过滤器的容量。澄清收获物使得样品以简单的洗涤步骤装载至蛋白A柱，并简化清洗程序。在柱前添加串联过滤器以保护其免受碎片破坏，并在柱前加入气阱保护其免受空气破坏。
所有处理步骤中均使用了简化的缓冲系统。平衡、所有洗涤、洗脱缓冲液仅由两种组分组成：Tris和醋酸。根据所定义的各成分量，可以通过各组分的摩尔浓度控制pH。因此，没有必要对所有缓冲液进行pH调整，这节省了大量的缓冲液制备时间。以下是在中试过程中使用的缓冲液。
线位置 缓冲液
平衡 25mM Tris，22mM 醋酸，pH 7.2
洗涤1 300mM Tris，260mM 醋酸，pH 7.2
洗涤2 25mM Tris，22mM 醋酸，pH 7.2
洗脱 25mM 醋酸，0.89mM Tris，pH 3.5
再生 0.2 M 氢氧化钠。
在清洗过程中，所有三个柱串联连接，从而节省了使用的清洗剂的量。将流速减少到200 cm/小时，以适应落在三个柱上的增加的压力。
该过程的总产率为91%，证明mAb Z细胞培养收获物可以通过酸化澄清，然后离心/深度过滤，并通过蛋白A亲和色谱捕获，得到简单的mAb捕获过程。
6.5 3-组分制剂缓冲液的测试
用水溶剂制备含精氨酸、柠檬酸和海藻糖的预定混合物的制剂缓冲液。组分从0到100mM变化。
采用RAMANRXN2™分析仪获得各混合物的15 mL等份的800至1700 cm-1范围处的拉曼光谱(2光谱/混合物)。光谱滤波参数被设置为标准正常方差(SNV)强度标准化、15点平滑进行的一阶导数(间隙点)基线校正以及平均强度值=0的平均中心差光谱。这被认为是数据换算而不是光谱过滤器。使用水浸探头收集光谱，每个样品的曝光时间为30秒。
主成分方法学用于建立模型。PLS(潜结构的偏最小二乘预测)模型用于三个组分中的每一个以确定组分间的相关性。该结果是线性模型，其将光谱强度(例如，从1700-800cm-1)转化为浓度(ax1+bx2+......+zx900=浓度)。此处显示的用于校准结果的软件为来自Thermo Galactic的具有PLSplus/IQ附加件的GRAMS/AI V 7.02。SIMCA P+用于许多图和实验模型的创建。通过去除两个样品，对样品进行交叉验证。进行数据分析以便相关性和交叉验证的测试步骤可被重复，直至组分间的相关性低于2%的误差阈值。可用单个读数提供缓冲液组分的精确量化(例如，2%内)。
校准曲线可采用随机混合设计获得。上述建立的3-组分模型用于生成关于精氨酸、柠檬酸和海藻糖的随机混合物的光谱的预测(图11)。这些预测与实际的光谱进行比较，以确认该模型具有±2%的预先确定的公差极限(tolerance limit)。该结果示于图12和13中。获得随机混合物的独立测量以验证该模型可用于进行测量。
6.6 4-组分制剂缓冲液的测试
实施例6.5的方法适用于含4组分的制剂缓冲液，其中所述组分为甘露醇、蛋氨酸、组氨酸和吐温™(聚山梨醇酯80)。测得的预定混合物的光谱示于图14-16。波数范围从远红外区到中红外区。由于蓝宝石盖子的局限性，100-800 cm-1的范围在该特定的实施例中可忽略不计，且校准发生在800-1800 cm-1。
按照与实施例6.5获得的3组分模型相同的方式得到4组分缓冲系统的模型。将以所得的模型为基础的预测与随机混合物的实际光谱进行比较，以确认该模型是足够精确的。此结果示于图17和18中。
6.7 含蛋白质的3-组分制剂缓冲液的测试
实施例6.6的方法适用于含3组分以及浓度范围为0至100 mg/ml的蛋白质的制剂缓冲液。所述组分为甘露醇、蛋氨酸、组氨酸和D2E7(阿达木单抗)。测得的预定混合物的光谱示于图19-21中。
按照与实施例6.6获得的4组分模型相同的方式得到含蛋白质的3组分缓冲系统的模型。将以所得的模型为基础的预测与随机混合物的实际光谱进行比较，以确认该模型是足够精确的。此结果示于图22中。实际与预测的光谱的决定系数(R2)和交叉检验标准误差(SECV)值显示在下面的表2中。
表2. 模型拟合汇总
组分 R2 SECV (g/L)
阿达木单抗 0.995 1.96
甘露醇 0.994 2.35
蛋氨酸 0.989 3.27
组氨酸 0.992 2.75
6.8 阿达木单抗UF/DF过程
建立超滤/透析过滤过程(UF/DF)以将赋形剂引入至阿达木单抗的溶液。进料泵(100)提供了通过切向流过滤膜的交叉流，输送容器中包含阿达木单抗的溶液通过膜。将透析过滤缓冲液(制剂缓冲液，包含蛋氨酸、甘露醇和组氨酸)泵入容器以匹配膜的过滤速率(流动通过膜渗透侧的液体)(110)。离开进料罐的进料流(120)通过泵(130)定向至膜组件(140)。具有相对较小的分子尺寸的包含水、缓冲液组分等的渗透流(150)通过膜组件。包含浓阿达木单抗的滞留流(160)定向返回至进料罐，其由滞留阀(170)控制。
将可与来自Kaiser Opticals的RamanRX2™分析仪(190)兼容的拉曼探针(180)放置在进料罐内以提供定期表征罐的内含物的能力。使用校正文件将获得的光谱转化为组分浓度，因此能监测透析过滤过程的进展。此外，能监测并任选控制由于蛋白质浓度增加发生的赋形剂浓度的变化(由唐南效应和电荷排阻效应产生的)。除了RamanRX2™分析仪之外的其它拉曼系统还能用于定期表征来自超滤/透析过滤过程的在线样品作为阿达木单抗纯化过程的质量控制的一部分。例如，得自拉曼分析的结果能用于评价透析过滤过程的完成和最终赋形剂浓度。
通过UF/DF膜将组氨酸、甘露醇和蛋氨酸的混合物透析过滤。将拉曼探针放置在滞留物容器中。以规定的时间间隔获得拉曼光谱，各个读数包括30秒的暴露，重复10次(10次扫描)。图24-25显示透析过滤过程中浓度的变化。如预期的，透析过滤过程中各个组分浓度增加达到稳定。
图24-25提供了来自透析过滤过程的在线监测的结果。在图24中，提供了各个透析过滤时间的糖、缓冲液和氨基酸浓度。如图24和25所示，氨基酸为蛋氨酸，并在y-轴上绘制浓度(mM)，糖为甘露醇，并在y-轴上绘制w/v %，以及缓冲液为组氨酸，并沿着y-轴绘制浓度(mM)。图24-25中各个图的x-轴为保留时间，其中检测0至81分钟的浓度并沿着x-轴绘制。
然后，通过5千道尔顿UF/DF膜(0.1 sq. m)将在水中以约40 mg/ml存在的阿达木单抗透析过滤至糖溶液达7体积倍数(diavolumes)。将拉曼探针放置在滞留物容器中。以规定的时间间隔获得拉曼光谱，各个读数包括30秒的暴露时间，重复10次(10次扫描)。随后，将蛋白质浓缩至140 g/L。
图26提供了从用于UF/DF体系的并如上述检测的糖/蛋白质体系(甘露醇/ 阿达木单抗)获得的校正数据。将来自图26的校正曲线用于确定图27和28中的甘露醇和阿达木单抗浓度。图27和28显示糖的透析过滤过程中浓度的变化。右边的图显示透析过滤和随后超滤过程中的蛋白质浓度。在图27和28中，将糖浓度(%)对保留体积(从0至6)绘图，并将阿达木单抗浓度(g/l)对保留体积(从0至6)绘图。
如预期的，透析过滤过程中糖的浓度增加达到稳定。蛋白质达到目标浓度。在图27中，使用校正至50 g/L的模型。图28显示使用120 g/L蛋白质和糖混合物获得的校正计算的糖和蛋白质浓度。
通过5千道尔顿UF/DF膜(0.1 sq. m)将在水中以约20 mg/ml存在的阿达木单抗透析过滤至组氨酸溶液(50 mM)达7体积倍数(diavolumes)。将拉曼探针放置在滞留物容器中。以规定的时间间隔获得拉曼光谱，各个读数包括30秒的暴露时间，重复10次(10次扫描)。随后，将蛋白质浓缩至50 g/L。图29提供了从缓冲液(组氨酸)/蛋白质(阿达木单抗)体系获得的校正数据。这是用于多达50 g/L蛋白质的组氨酸/阿达木单抗混合物的校正模型。图30提供了对于缓冲液/蛋白质体系中低浓度的缓冲液和蛋白质，透析过滤体积(从0至6透析过滤体积)对组氨酸浓度(nM)和阿达木单抗浓度(g/l)的图。
该图显示组氨酸(nM)透析过滤过程中浓度的变化。右边的图显示透析过滤和随后超滤过程中的蛋白质浓度(g/l)。如预期的，透析过滤过程中糖的浓度增加达到稳定。蛋白质达到目标浓度。在该图(图29)中，使用校正至50 g/L的模型。图中的浓度由于模型局限性低于预期，随后将其鉴定为与组氨酸的离子化相关。模型能将组氨酸的电离状态与实际总的组氨酸浓度和溶液性质相关联。
数据证实监控具有蛋白质和另外的单一组分的低和高浓度UF/DF操作的能力。能每隔3分钟读取浓度，由此提供实时(或接近实时)监控浓度的能力。在糖/蛋白质体系中，对于所有浓度的蛋白质使用糖获得非常高的精确度。在缓冲液/蛋白质体系中，在较高缓冲液浓度和较低蛋白质浓度下获得高的缓冲液精确度。还提供实时(或接近实时)检测和测定体积排阻效应和唐南效应的能力。因此，将拉曼光谱用作蛋白质溶液中赋形剂浓度检测的工具，并且还提供了检测除了赋形剂浓度之外的蛋白质浓度的能力以提供过程控制。
6.9 含蛋白质的2-组分制剂缓冲液的测试
实施例6.5的方法适用于含2组分(Tris和醋酸盐)以及蛋白质(阿达木单抗)的制剂缓冲液。以下述范围包含所述组分：Tris 50-160mM；醋酸盐30-130mM；和阿达木单抗4-15g/L。
校准曲线可根据实施例6.5中所概述的方法得到。上述开发的模型用来生成关于在根据表3的浓度制备的样品中Tris、醋酸盐和阿达木单抗的混合物的光谱的预测：
表3
将这些预测结果与实际的光谱进行比较，以确认该模型在预定的公差范围内。其结果示于图31A-C中。
6.10 含蛋白质的细胞培养收获物的测试
实施例6.5的方法用于含组分吐温™和蛋白质阿达木单抗的化学成分确定的细胞培养基收获物。所述细胞培养基从细胞培养批次中收获，过滤并装载到蛋白A柱。汇集蛋白A柱流出物，然后在存储和测试前进行无菌过滤。
此方法将被用来确定蛋白A柱装载的结束点。过滤的细胞培养收获将适用于捕获柱(通常为蛋白A)。当前监测柱装载输出的方法使用A280吸光度。然而，培养收获物包含在280 nm吸收光的多种组分。A280吸光度通常被饱和，使得A280方法无法在柱装载阶段测量抗体漏出。
拉曼光谱仪提供了在捕获柱装载输出流(柱流出物)中的抗体的具体测量方法。该测试通过向蛋白A流出物池中加入不同浓度的纯化抗体API药物(例如，阿达木单抗)模拟所提议的在线抗体测量法。 掺入实验所用的API样品含有0.1％吐温™。在直接掺入实验期间，吐温™浓度将会与抗体成正比改变，并可能在拉曼光谱校准时被误认为是抗体。为了避免这种情况，将吐温™视为额外的组分并独立于抗体浓度掺入。因此，以下列范围包括这些组分：吐温™ 0.1％-1.0％和阿达木单抗0.1-1.0 g/L。
校准曲线可根据实施例6.5中所概述的方法得到。上述开发的模型被用于生成关于在根据表4的浓度制备的样品中吐温™和阿达木单抗的混合物的光谱的预测：
表4
阿达木单抗 (g/L) 吐温™ (%)
1.0 0.0
0.0 1.0
0.6 0.6
1.0 0.1
0.1 1.0
1.0 1.0
0.1 0.1
0.7 0.4
0.1 0.3
0.5 0.4
0.2 0.7
0.8 0.3
将这些预测结果与实际的光谱进行比较，以确认该模型在预定的公差范围内。结果示于图32A-B中。
6.11抗体聚集体检测的测试
使用未修饰蛋白质的光催化交联(PICUP)将两种抗体(D2E7和ABT-874)分别聚集。将抗体暴露于聚集光源0 – 4小时(图33和34)并通过尺寸排阻色谱(SEC)定量聚集。通过拉曼光谱和使用主成分分析(PCA)(图35和36)以及偏最小二乘分析(PLS)(图37A和37B)模型化的光谱检测样品。图35和36显示聚集的样品具有独特的主成分得分并能使用拉曼光谱与聚集体区分。图37A和37B显示拉曼光谱结果和SEC检测之间的一些相关性。
本文引用了各种出版物，其内容在此整体引入作为参考。

Claims (7)

1.一种从样品混合物制备宿主细胞蛋白(HCP)降低的靶蛋白制剂的方法，所述样品混合物包含靶蛋白和至少一种HCP，所述方法包括：
(a) 进行所述样品混合物的拉曼光谱分析；
(b) 使所述样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%；和
(c) 收集色谱样品；和
(d) 进行所述色谱样品的拉曼光谱分析以鉴定其为HCP减少的靶蛋白制剂。
2.权利要求1的方法，其中色谱树脂选自亲和色谱树脂、离子交换色谱树脂和疏水相互作用色谱树脂。
3.权利要求1的方法，其中靶蛋白选自：酶；肽类激素；多克隆抗体；人单克隆抗体；人源化单克隆抗体；嵌合单克隆抗体；单链抗体；Fab抗体片段；F(ab')2抗体片段；Fd抗体片段；Fv抗体片段；分离的CDRs；双抗体；和免疫粘附素。
4.权利要求1的方法，其中将色谱树脂充填入一系列被包括入口和出口阀的流体导管分隔的流体连接柱，其中流体连接柱的数量选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个柱。
5.权利要求1的方法，其中样品混合物与色谱树脂接触以获得选自高达约0.5分钟、高达约1分钟、高达约2分钟、高达约3分钟、高达约4分钟、高达约5分钟、高达约6分钟、高达约7分钟、高达约8分钟、高达约9分钟、高达约10分钟、高达约11分钟和高达约12分钟的保留时间保留时间。
6.权利要求1的方法，其进一步包括在接触样品混合物前平衡色谱树脂和在接触样品混合物后洗涤色谱树脂的步骤，其中平衡和洗涤缓冲液为相同的缓冲液。
7.权利要求1的方法，其进一步包括色谱树脂的洗涤、洗脱和再生步骤，其中此步骤可被计算和编排以维持样品接触色谱树脂的步骤为过程的时间的约20%至约80%。
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