CN105748655A - 用于增加巴戟天属代谢物的产量的方法 - Google Patents

用于增加巴戟天属代谢物的产量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105748655A
CN105748655A CN201511023127.6A CN201511023127A CN105748655A CN 105748655 A CN105748655 A CN 105748655A CN 201511023127 A CN201511023127 A CN 201511023127A CN 105748655 A CN105748655 A CN 105748655A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extract
dry weight
plant
anthraquinone
iridoid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201511023127.6A
Other languages
English (en)
Inventor
陈深源
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN105748655A publication Critical patent/CN105748655A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/74—Rubiaceae (Madder family)
    • A61K36/746—Morinda
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12N9/1037—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01074—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase

Abstract

本发明关注诱导巴戟天种(例如巴戟(<i>Morinda officinalis</i> How))的毛根培养物以增加治疗上有用的代谢物、相关的根提取物的产量的遗传转化法，以及使用巴戟天种(例如巴戟)的提取物治疗溃疡性结肠炎的方法。

Description

用于增加巴戟天属代谢物的产量的方法
发明背景：
巴戟(MO)，茜草科(Rubiaceae)家族的成员，广泛生长在热带和亚热带地区的一种小型藤本植物。该植物的根(命名为Bajitian)已收录在中华人民共和国药典(2010版)中，用于帮助强化骨和肾以及用于增强免疫系统功能。与西方国家相比，在东亚特别是在中国，草药疗法在几个世纪以来均为普遍的。在东北亚，巴戟天(Morindaofficinalis)的根继续传统地用于治疗类风湿性关节炎、糖尿病和高血压(Choi,J.等，2005)。该植物亦已用于治疗阳痿、月经失调和其它炎性疾病，例如皮炎。包含来源于许多植物(包括巴戟天根(RadixMorindaeOfficinalis))的组分的组合物，已被公开作为用于治疗癌症以及前列腺和肾的其它病症的剂(美国专利号7,223,424，WenHsienChou)。
已从巴戟天中分离许多成分。这些成分包括环烯醚萜苷类、蒽醌类和低聚糖。已鉴定这些成分中某些的药理作用。环烯醚萜类为在许多种植物和在一些动物中发现的一类次级代谢物(美国专利申请号20110217394)。发现环烯醚萜类具有大范围的生物活性，包括抗炎活性(Shin等，2013)和镇痛(antinoiceptive)活性。数种蒽醌类亦已显示具有抗骨质疏松活性。
黄酮类生物合成途径已完善建立并已在许多不同的植物物种中广泛研究(参见例如Koes等，BioEssays，16，(1994)，123-132)。查耳酮合酶(E.C.2.3.1.74)为苯丙素（phenylpropanoid）生物合成途径的类黄酮特定分支中的第一个酶(Dixon等，PlantCell7:1085-1097(1995))。因此其为次级代谢中的关键酶(美国专利号7,202,397)。
MO有5-7年生长周期。第1-5年为生长期，第6-7年为采收期。因其次级代谢物的高药用价值所致，MO已被穷尽地野外采掘。这些次级代谢物对植物生长而言并非必需的并因此少量地产生(Zhou等，2011)。因此，需要高数量的植物用于治疗量，其加剧了对野生植物的搜寻和后续耗尽。迫切需要创造这些代谢物的备选来源以支持病患需求。
炎性肠病(IBD)为一种自身免疫病，其中身体的自身免疫系统攻击消化系统的元件。一种IBD亚型溃疡性结肠炎(UC)，为侵袭结肠的一种特发性慢性复发-缓解型炎性病症，其以腹泻和直肠出血为特征。用于UC病患的当前药物疗法包括5氨基水杨酸(5aminosalicyclicacid)(5-ASA)、皮质类固醇、巯嘌呤和抗-TNF抗体。这些剂目标是通过免疫抑制控制炎症的程度。然而，长期功效仅在约1/3的患有中度至重度疾病的病患中实现并时常伴有不良作用，例如感染、淋巴瘤和皮肤癌的风险。
发明概述：
本发明的一方面是基于一个出人意料的发现，MO毛根的提取物对治疗小鼠中葡聚糖硫酸酯诱导的结肠炎有效。所述巴戟的提取物含有环烯醚萜类和蒽醌类。优选所述提取物含有量的范围为所述提取物干重的0.20%-5%的环烯醚萜类；和/或量的范围从大于0至小于所述提取物干重的1%的蒽醌类。更优选所述环烯醚萜类含有量的范围为所述提取物干重的0.25%-2.5%的水晶兰苷；和/或量的范围为所述提取物干重的0.1%-2.0%的去乙酰基车叶草苷酸。特别优选的是，所述蒽醌类含有量的范围为所述提取物干重的0.001%-0.15%的甲基异茜草素-1-甲醚。
本发明的一方面涉及使用MO的毛根及其提取物治疗溃疡性结肠炎的方法。
本发明的另一方面涉及一种增加MO根中的次级代谢物产量的方法，其经由使用发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)将编码查耳酮合酶(CHS)的核苷酸序列引入MO的基因组中进行(图1)。此基因转导法经优化产生稳定的MO毛根培养物(图2)，其具有次级代谢物的高生产力。毛根为来源于寄主植物(MO)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)的感染的转化根的分化培养物。所述遗传转化根能够在缺乏生长激素的情况下无限生长并长期产生次级代谢物。
本发明的又一方面涉及一种分离的核酸分子，其包含与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列，和/或编码与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。本发明的另一方面涉及包含编码CHS基因的核苷酸序列的表达载体。
含有上述MO毛根的提取物用于治疗UC的组合物以及所述组合物用于制造治疗UC的药剂的用途，亦在本发明的范围内。
附图简述
上述内容将从本发明的示例性实施方案的以下更具体描述中显而易见，如在附图中所述。
图1描述通过发根土壤杆菌进行的在MO中的基因转导。
图2描述毛根的诱导。
图3A和3B分别显示赤桉(E.camaldulensis)CHScDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:1)和赤桉CHScDNA的翻译的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。
图4描述pFM-CHS的质粒图谱。
图5A-D显示外植体的无菌生长的不同阶段。其花费约6-8周从阶段A(图5A)达到阶段D(图5D)。图5E显示准备好进行转染的幼小植株。
图6A-F描述诱导毛根的过程。图6A为外植体的预培养。图6B为发根土壤杆菌与外植体一起培养。图6C显示用300mg/l头孢噻肟对外植体消毒。图6D显示根样结构的生长(箭头)。图6E描述根样结构的独立培养。图6G描述毛根的快速生长。
图7显示使用对CHS、rolC、ITS和virC特异的多个引物从分离自转基因毛根克隆的MO基因组DNA扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。
图8描述在60天生长结束时的毛根克隆的摇瓶培养物。箭头指示增厚区。
图9描述提取的MO毛根的HPLC分布图。图9A显示MO毛根的甲醇提取物的环烯醚萜分布图。HPLC条件：流动相：A：0.4%H3PO4，B：甲醇，流速：1.000ml/min，梯度洗脱：0~13min，A：95%；13~14min，A：95~91.6%；14~65min，A：91.6~91.3%；65~70min，A：91.3~86%；70~175min，A86~84%；75~100min，A84~80.5%；100~105min，A:80.5~95%。柱温：25.00℃。检测器波长=233nm。图9B显示MO毛根的甲醇提取物的蒽醌分布图。HPLC条件：流动相A：0.2%H3PO4，B：乙腈，流速：1.000ml/min，梯度洗脱0~15min，A：90~80%；15~50min，A：80~70%；50~70min，A：70~60%；70~100min，A：60~50%；100~120min，A：50~20%；120~125min，A：20%；125~130min，A：20~90%，柱温：30.00℃。检测器波长：277nm。进样体积=15.00μL
发明详述
本发明的示例性实施方案的描述如下。
定义
通过参考本发明的优选实施方案和其中包含的方法的下列详述，可更容易地理解本发明。在公开和描述本发明方法和技术之前，要理解的是，本发明不限于具体的分析或合成方法，因为这些方法当然可改变。亦要理解的是，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而并非意图其为限制性的。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的意义。
除非文段另有明确指示，否则本文所用的单数形式“一”、“一个”、“所述”亦包括复数所指。因此，例如，提及“细菌”是指一种或多种细菌并包括本领域技术人员已知的其等同物。此外，意图术语“包含”包括其中所述方法、仪器、组合物等基本上由所列步骤、组分等组成和/或由所列步骤、组分等组成的实施方案。类似地，意图术语“基本上由……组成”包括其中所述方法、仪器、组合物等由所列步骤、组分等组成的实施方案。
本文所用的术语“大约”是指与给定数字差别小于10%的数字。在某些实施方案中，术语“大约”表示所述数字与给定数字差别小于9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。
本文所用的术语“毛根”是指这样的结构，其作为发根土壤杆菌和寄主植物之间相互作用的结果而形成。毛根能够无限生长并可进行基因工程改造以表达关注的核苷酸序列。
本文所用的术语“分离的”是指从其自然环境中移出的蛋白质、多肽、肽、核酸分子、多核苷酸、宿主细胞或病毒(即从与其天然相关的至少一种其它组分中分离的)。
本文所用的术语“序列同一性”是指两个多肽之间或两个多核苷酸之间的百分比同一性。两个多肽之间的百分比同一性为所述序列共享的相同位置的数量的函数，其考虑用于最佳比对所需要引入的空位数量和各空位的长度。在确定氨基酸序列之间的同一性百分数的领域中多种计算机程序和数学算法为可得的，例如在NCBI可得的Blast程序(例如Altschul等，1997，NucleicAcidRes.25:3389；Altschul等，2005，FEBSJ.272:5101)。相同的程序可应用于核苷酸序列。用于确定核苷酸序列同源性的程序在专业数据库(Genbank或WisconsinSequenceAnalysisPackage)中亦为可得的，例如BLASTN、BESTFIT、FASTA和GAP程序。
本发明涉及巴戟天种例如巴戟(MO)植物的提取物。本发明亦涉及治疗受试者中的炎性肠病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的MO植物的提取物。在一些实施方案中，所述MO植物的提取物来自MO植物的毛根。在其它实施方案中，所述MO植物的提取物包含环烯醚萜和蒽醌。
在一些实施方案中，所述环烯醚萜介于所述提取物干重的约0.20%-5.0%之间。在其它实施方案中，所述环烯醚萜介于所述提取物干重的约0.50%-4.50%之间、约1.0%-4.0%之间、约1.5%-3.5%之间或约2.0%-3.0%之间。在其它实施方案中，所述环烯醚萜介于所述提取物干重的约0.20%-0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%或4.5%之间。在另外的实施方案中，所述环烯醚萜为所述提取物干重的约0.20%、0.50%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、1.75%、2.0%、2.25%、2.5%、2.75%、3.0%、3.25%、3.5%、3.75%、4.0%、4.25%、4.5%、4.75%或5.0%。
在一些实施方案中，所述环烯醚萜包含水晶兰苷和去乙酰基车叶草苷酸。在另外的实施方案中，所述水晶兰苷介于所述提取物干重的约0.25%-2.5%之间。在另其它实施方案中，所述水晶兰苷介于所述提取物干重的约0.50%-2.0%之间、约0.75%-1.5%之间或约1.0%-1.25%之间。在其它实施方案中，所述水晶兰苷介于所述提取物干重的约0.20%-0.5%、1.0%、1.5%、2.0%或2.5%之间。在一些实施方案中，所述水晶兰苷为所述提取物干重的约0.25%、0.50%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、1.75%、2.0%、2.25%或2.5%。在其它实施方案中，所述去乙酰基车叶草苷酸介于所述提取物干重的约0.1%-2.0%之间。在另其它实施方案中，所述去乙酰基车叶草苷酸介于所述提取物干重的约0.25%-1.75%之间、约0.50%-1.50%之间或约0.75%-1.25%之间。在另外的实施方案中，所述去乙酰基车叶草苷酸介于所述提取物干重的约0.1%-0.25%、0.5%、1.0%、1.5%或2.0%之间。在另其它实施方案中，所述去乙酰基车叶草苷酸为所述提取物干重的约0.1%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%、0.55%、0.60%、0.65%、0.70%、0.75%、0.80%、0.85%、0.90%、1.0%、1.05%、1.10%、1.15%、1.20%、1.25%、1.30%、1.35%、1.40%、1.45%、1.50%、1.55%、1.60%、1.65%、1.70%或1.75%。
在另其它实施方案中，所述蒽醌少于所述提取物干重的约1.0%。在另外的实施方案中，所述蒽醌为所述提取物干重的约1.0%。在其它实施方案中，所述蒽醌少于所述提取物干重的0.95%、0.90%、0.85%、0.80%、0.75%、0.70%、0.65%、0.60%、0.55%、0.50%、0.45%、0.40%、0.35%、0.30%、0.25%、0.20%、0.15%、0.10%或0.05%。在另外的实施方案中，所述蒽醌少于所述提取物干重的约0.95%、0.90%、0.85%、0.80%、0.75%、0.70%、0.65%、0.60%、0.55%、0.50%、0.45%、0.40%、0.35%、0.30%、0.25%、0.20%、0.15%、0.10%或0.05%。在另其它实施方案中，所述蒽醌介于所述提取物干重的约0.01%-1.0%之间。在一些另外的实施方案中，所述蒽醌介于所述提取物干重的约0.10%-0.90%之间、约0.20%-0.80%之间、约0.30%-0.70%之间或约0.40%-0.50%之间。
在一些实施方案中，所述蒽醌包含甲基异茜草素-1-甲醚。在另外的实施方案中，所述甲基异茜草素-1-甲醚少于所述提取物干重的约0.15%。在另其它实施方案中，所述甲基异茜草素-1-甲醚少于所述提取物干重的约0.1%。在其它实施方案中，所述甲基异茜草素-1-甲醚为所述提取物干重的约0.15%。在再其它实施方案中，所述甲基异茜草素-1-甲醚为所述提取物干重的约0.1%。在另其它实施方案中，所述甲基异茜草素-1-甲醚介于所述提取物干重的约0.001%-0.15%之间、约0.01%-0.15%之间或约0.10%-0.15%之间。
本发明亦涉及一种分离的核酸分子，其包含与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述分离的核酸分子包含与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列。
本发明亦涉及一种多肽序列，其通过与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列编码。在另外的实施方案中，所述多肽序列通过与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列编码。本发明亦涉及一种核苷酸序列，其编码与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核苷酸序列编码与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。本发明亦涉及一种多肽，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的编码查耳酮合酶的氨基酸序列。
本发明亦涉及一种表达载体，其包含编码查耳酮合酶多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述查耳酮合酶多肽来自赤桉(Eucalyptuscamaldulensis)。在另外的实施方案中，所述表达载体包含与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述表达载体包含与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含编码这样的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有查耳酮合酶活性并包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在另其它实施方案中，所述表达载体另外包含启动子，其中所述启动子对于赤桉而言并非为内源的。合适启动子的实例为花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus)19S和35S启动子。
本发明亦涉及一种包含表达载体的发根土壤杆菌细菌，所述表达载体包含编码查耳酮合酶多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述查耳酮合酶多肽来自赤桉。在另外的实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%序列同一性。在其它实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%或99%序列同一性并编码具有查耳酮合酶活性的多肽。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列编码这样的多肽，其具有查耳酮合酶活性并包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
本发明亦涉及一种来自巴戟天家族的植物或植物部分，优选MO植物或植物部分，其通过包含表达载体的发根土壤杆菌转化，所述表达载体包含编码查尔酮合酶多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述查耳酮合酶多肽来自赤桉。在另外的实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%序列同一性。在其它实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列编码这样的多肽，其具有查耳酮合酶活性并包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
本发明亦涉及一种通过发根土壤杆菌细菌转化的MO植物的提取物，其中所述发根土壤杆菌细菌包含表达载体，其中所述表达载体包含编码查耳酮合酶多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%序列同一性。在其它实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列编码这样的多肽，其具有查耳酮合酶活性并包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
本发明亦涉及治疗受试者中的炎性肠病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的MO植物的提取物。在一个所述方法中，将来自通过发根土壤杆菌细菌转化的MO植物的提取物以治疗上有效的量给予罹患UC的病患，其中所述发根土壤杆菌细菌包含表达载体，其中所述表达载体包含编码查尔酮合酶多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%序列同一性。在其它实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列编码这样的多肽，其具有查耳酮合酶活性并包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述提取物来自所述MO植物的毛根。
在其它实施方案中，可将有效量的MO植物提取物单独给予或作为药物组合物给予受试者。所述药物组合物可含有药学上可接受的赋形剂，例如溶媒、辅料、载体或稀释剂，其为公众容易得到的。此外，药物组合物亦可包含药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等，其为公众容易得到的。关于用于制剂和给予的技术的详情已在科学和专利文献中充分描述，参见例如“雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)”的最新版(MaackPublishingCo，EastonPa.)。在另外的实施方案中，本发明的化合物或药物组合物可口服给予。
在另外的实施方案中，所述MO植物提取物的有效量以介于约0.2mg/kg-约12mg/kg之间的量给予受试者。在另一个实施方案中，所述MO植物提取物的有效量以介于约0.8mg/kg-约4mg/kg之间的量给予受试者。在其它实施方案中，所述MO植物提取物的有效量以约0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.2mg/kg、1.4mg/kg、1.6mg/kg、1.8mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.2mg/kg、4.4mg/kg、4.6mg/kg、4.8mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg或12mg/kg的量给予受试者。在另其它实施方案中，所述MO植物提取物的有效量以大于约0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg或0.8mg/kg的量给予受试者。在其它实施方案中，所述MO植物提取物的有效量以小于4.0mg/kg、4.2mg/kg、4.4mg/kg、4.6mg/kg、4.8mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg或12mg/kg的量给予受试者。在另外的实施方案中，所述MO植物提取物的有效量以介于约0.2mg/kg-约11.5mg/kg之间、约0.2mg/kg-约11.0mg/kg之间、约0.4mg/kg-约10.5mg/kg之间、约0.4mg/kg-约10mg/kg之间、约0.4mg/kg-约9.5mg/kg之间、约0.4mg/kg-约9mg/kg之间、约0.4mg/kg-约8.5mg/kg之间、约0.4mg/kg-约8.0mg/kg之间、约0.4mg/kg-约7.5mg/kg之间、约0.4mg/kg-约7mg/kg之间、约0.4mg/kg-约6.5mg/kg之间、约0.4mg/kg-约6.0mg/kg之间、约0.4mg/kg-约5.5mg/kg之间、约0.4mg/kg-约5.0mg/kg之间、约0.4mg/kg-约4.8mg/kg之间、约0.4mg/kg-约4.6mg/kg之间、约0.4mg/kg-约4.4mg/kg之间、约0.4mg/kg-约4.2mg/kg之间、约0.6mg/kg-约4.0mg/kg之间、约0.6mg/kg-约3.8mg/kg之间、约0.6mg/kg-约3.6mg/kg之间、约0.6mg/kg-约3.4mg/kg之间、约0.6mg/kg-约3.2mg/kg之间、约0.6mg/kg-约3.0mg/kg之间、约0.6mg/kg-约2.8mg/kg之间、约0.8mg/kg-约3.8mg/kg之间、约0.8mg/kg-约3.6mg/kg之间、约0.8mg/kg-约3.4mg/kg之间、约0.8mg/kg-约3.2mg/kg之间、约0.8mg/kg-约3.0mg/kg之间、约0.8mg/kg-约2.8mg/kg之间、约0.8mg/kg-约2.6mg/kg之间、约1.2mg/kg-约4.2mg/kg之间、约1.2mg/kg-约4.0mg/kg之间、约1.2mg/kg-约3.8mg/kg之间、约1.2mg/kg-约3.6mg/kg之间、约1.2mg/kg-约3.4mg/kg之间、约1.2mg/kg-约3.2mg/kg之间、约1.2mg/kg-约3.0mg/kg之间、约1.2mg/kg-约2.8mg/kg之间、约1.2mg/kg-约2.6mg/kg之间、约1.6mg/kg-约4.2mg/kg之间、约1.6mg/kg-约4.0mg/kg之间、约1.6mg/kg-约3.8mg/kg之间、约1.6mg/kg-约3.6mg/kg之间、约1.6mg/kg-约3.4mg/kg之间、约1.6mg/kg-约3.2mg/kg之间、约1.6mg/kg-约3.0mg/kg之间、约1.6mg/kg-约2.8mg/kg之间或约1.6mg/kg-约2.6mg/kg之间的量给予受试者。
在另外的实施方案中，所述MO植物的毛根提取物包含一种或多种特异性化学物质，所述化学物质通过MO毛根的甲醇提取物的HPLC分布图中描述的新峰鉴定，如在图9A-B中所示。在其它实施方案中，所述MO植物的提取物包含在波长223nm下80分钟峰处鉴定的一种或多种化学物质(图9A)。在另其它实施方案中，所述MO植物的提取物包含在波长277nm的15-20分钟峰处鉴定的一种或多种化学物质(图9B)。在又一个实施方案中，所述MO植物的提取物包含在波长277nm的20-40分钟峰处鉴定的一种或多种化学物质(图9B)。
在另一个实施方案中，公开的是在巴戟天种的毛根中产生增加水平的代谢物的方法，其通过以下进行：使用发根土壤杆菌转染植物或植物部分(例如小植株)，所述发根土壤杆菌含有携带编码查耳酮合酶的cDNA的表达载体，以及筛选转化有编码查耳酮合酶多肽的核苷酸的毛根克隆。在此实施方案中，在根中产生所需代谢物的更高产量。合适的巴戟天种包括MO、海巴戟(Morindacitrifolio)、亮叶巴戟(Morindalucida)、椭圆叶巴戟(Morindaelliptica)、琴叶巴戟(Morindapandurifolia)和狭叶巴戟(Morindaangustifolia)。Pistelli，L.等(2010)提供了毛根诱导、遗传学和代谢物产生的方面的综述，其对实施本发明的遗传转化方法而言为有用的。
发根病可由发根土壤杆菌引起，所述发根土壤杆菌可分离自土壤。所述革兰氏阴性菌将DNA从其根-诱导(Ri)质粒中转移到受感染植物细胞的基因组中，其导致根的形成。其在控制根的有益生长中的用途通过Strobel，美国专利号4,588,693描述。在毛根培养物的生产中，通过将植物细胞或植物部分暴露给土壤杆菌属(Agrobacterium)来使土壤杆菌属感染植物。能够产生毛根的任何植物部分、组织或细胞均可用于本发明。这类植物部分可包括(例如且不限于)植物茎、叶柄、子叶节、下胚轴或者其它植物部分或细胞。优选使用针对根的维持最优化的半固体培养基或液体营养液，这导致与未感染的植物细胞相比增加的根生长速率。尽管许多类型的材料和溶液及培养基是已知的并可用于本发明，数个优选的实例包括Murashige-Skoog和GamborgB5培养基。可采用针对满足用于制备可持续毛根培养物的不同寄主植物的体外营养需求最优化的数个培养基改良。
实施例
实施例1：查耳酮合酶(CHS)cDNA的克隆和载体构建
让新近采集的红桉(赤桉)树叶在液氮中冷冻并储存于-80℃。根据制造商说明书使用RNA提取试剂盒(Clontech，PaloAlto，USA)分离RNA。
使用MagnosphereUltrapuremRNA纯化试剂盒(Clontech，PaloAlto，USA)从总RNA中纯化mRNA。使用来自Clontech的cDNA合成试剂盒从mRNA合成cDNA。使用引物EcCHSF1(ATGGTGAGCGTCGAGGAATT)(SEQIDNO:3)和EcCHSR1(TTAAGCAGACAGGGCGTGGA)(SEQIDNO:4)通过PCR(聚合酶链反应)从cDNA库中扩增编码查耳酮合酶的全长cDNA。所得cDNA产生自mRNA，其不包含基因组内含子。所述赤桉CHS基因包含带有一个间插内含子的至少两个外显子。PCR条件如下：95℃10min，然后30个循环的95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，和72℃5min。在琼脂糖电泳之后使用来自Clontech的DNA纯化试剂盒纯化CHSDNA，克隆到pMD-19T(Clontech)中并测序。
测序结果揭示具有翻译成390个氨基酸的可读框(图3B)的1170bp的cDNA(图3A)。然后通过将CHSDNA克隆至二元植物表达载体pRI101-AN(Clontech)中处于花椰菜花叶病毒35S启动子的转录控制下来构建表达载体。该载体命名为pFM-CHS(图4)并用于产生转基因植物的所有转染研究。
实施例2：使用发根土壤杆菌转化MO
A.小植株的微体繁殖：
从成体植物切下MO的幼芽，修剪并切成1-cm块，用蒸馏水清洗1小时、75%乙醇清洗50秒以及0.1%红汞清洗10min。然后将所述外植体用蒸馏水漂洗3次、风干，并置于补充有300mg/l头孢噻肟的1/2强度Murashige-Skoog(MS)培养基上直至建立无菌培养物。然后在含有1/2MS、IBA(2.0mg/l)和蔗糖(15%)的固体培养基上培养已消毒的芽。2个月生长之后，将所述无菌小植株修剪叶、切成0.5-1.5cm块(图5A-E)并在用发根土壤杆菌转染之前在1/2MS培养基上培养3-5天。
B.毛根克隆的建立
使用pFM-CHS转化的发根土壤杆菌ATCC15834在10mlYEB培养基中于28℃以200rpm振荡生长过夜至OD600为0.5-0.8。然后将所述培养物离心，在1/2MS培养基中重悬浮细胞并调节至OD600为0.6。
将来自培养物母株(图5E)的幼小植株修剪叶和根，切成1-cm块并在1/2MS液体培养基中于室温下超声处理5min，并随后浸没于发根土壤杆菌培养物中达15min，吸干，转移至培养基(1/2MS+100uM乙酰丁香酮)，并生长3-5天。然后将转染的外植体转移到消毒的培养基(1×MS+头孢噻肟300mg/l)并每隔5-10天进行继代培养(图6A、B)。3-4周之后，在外植体的切口末端出现毛根(图6A-F)。当长度达到2cm时摘取毛根，并每隔3-4周进行继代培养。选取没有细菌污染的快速生长克隆用于PCR分析以确认成功转化。这些转染条件为包含4280个外植体的12个优化实验的结果，克隆率为3.2%。
C.使用PCR鉴定克隆
使用对CHS和T-DNA特异的引物通过PCR确认已转化的根克隆。PCR产物的大小表明所述CHS基因被整合到MO的基因组中(图7)。不含virC的PCR产物表明对rolC和CHS的阳性扩增并非因残留的发根土壤杆菌所致。将内部转录间隔区(ITS)的PCR产物用作DNA质量对照。在MS培养基中生长6周之后，通过HPLC分析针对环烯醚萜和蒽醌生产力分析所述克隆。
D.毛根克隆的生产力
在500-ml爱伦美氏烧瓶中评价所述转基因毛根克隆的生产力(图8)。将0.5g毛根接种到300ml的1/2MS培养基中并于25℃在振荡器平台中以100rpm生长60天。在生长期结束时，采收毛根，在烘箱中于50℃干燥直至达到恒重，用甲醇提取，并如在实施例3中所述通过反相HPLC分析蒽醌类和环烯醚萜类。如在表1中所示，所有毛根克隆的蒽醌生产力均显著高于(50-90倍)天然植物，而环烯醚萜生产力从较低到略较高变化。
表1.在摇瓶中生长60天的毛根克隆的生产力
实施例3：从毛根中提取的环烯醚萜和蒽醌的HPLC分布图
将干燥的粉状根(4kg)和毛根(288g)在回流下用甲醇提取两次。然后将所述提取物过滤并在减压下蒸发。将浓缩的提取物冻干并在分析或用于动物研究之前重悬于水中。原生根的产率为13.77%，而毛根的产率为34.38%。
在C18柱上通过反相HPLC分析多个毛根克隆和天然草药的甲醇提取物，以定量环烯醚萜类和蒽醌类的水平。将纯化的水晶兰苷和甲基异茜草素-1-甲醚用于生成标准曲线。
如在图9A中所示，来自MO的转基因毛根的提取物的环烯醚萜分布图类似于天然植物，但处于更高浓度。水晶兰苷峰和去乙酰基车叶草苷酸峰二者均被显著检出。因毛根中蒽醌浓度的剧烈增加所致，所述HPLC分布图(图9B)与甲基异茜草素-1-甲醚为主要组分的天然植物相当不同。
实施例4：用于溃疡性结肠炎的动物模型
在急性小鼠溃疡性结肠炎模型中检查了MO毛根的甲醇提取物的治疗效果。所述小鼠溃疡性结肠炎模型用于预测溃疡性结肠以及所述疾病在人类受试者中的治疗(例如Low等，2013)。以良好动物护理方案(GoodAnimalCareProtocol)条件圈养10组雄性BalbC小鼠。通过4%葡聚糖硫酸酯(DSS)诱导结肠炎。在MO根提取物对UC的试验性给药研究(50mg/kg、150mg/kg和450mg/kg)中，产生意料之外的研究结果。在提取物浓度大于50mg/kg时对UC并无有益作用。
随后通过将来自MO天然植物或毛根培养物的剂量低于50mg/kg的提取物连同4%DSS共同饲喂小鼠7天来研究药物疗法对结肠炎的作用。将5-氨基-水杨酸(5-ASA)用作阳性处理对照。对动物称重并每天监测粪便稠度，以确定疾病活动指数(DAI)。将所有动物麻醉并从近端直肠分离结肠，以及测量回盲连接处与近端直肠之间的结肠长度。
表2.DAI分数的评价
*潜血检测试纸(Hemoccult)试验。蓝色表示粪便中存在血。
表3.使用来自巴戟天天然植物和转基因毛根的提取物治疗小鼠中DSS-诱导的溃疡性结肠炎
与仅DSS相比，**P＜0.01，*P＜0.05；与标准组(仅水)相比##P＜0.01。DAI=疾病活动指数#包括结肠隐窝破裂和损伤的腺结构
如在表3中所示，结肠炎诱导之后，结合体重减轻、粪便稠度和大量出血的组合DAI分数，在仅DSS(UC模型)组中显著增加。超过90%的动物有血便。肠相对容易被破坏并伴有充血和脓肿。50%的动物具有严重溃疡和粘连。结肠的长度亦显著减少。给予来自天然植物和毛根二者的提取物均能够显著降低DAI分数。当与经5-ASA处理的小鼠相比时，经药物处理的小鼠的结肠长度显著增加，表明对结肠炎的治疗效果。
来自5组小鼠的结肠的组织病理学检验揭示，当与5-ASA组相比时，在用来自毛根和天然植物的提取物处理的组中，发生溃疡和破坏肠内层的动物的数量明显更低。用来自MO毛根的提取物处理的小鼠的组，亦发现具有最低的溃疡发生率，表明与用5-ASA或来自天然植物的提取物处理的组相比改善的治疗效果。
所述毛根提取物的高效力在3个独立研究中得到确认，并通过HPLC测量了环烯醚萜和蒽醌含量(表4)。
表4.毛根提取物的主要成分
本文所引用的所有专利、公布的申请和参考文献的教导，均通过引用以其整体结合。
虽然已参考其示例性实施方案具体地说明和描述本发明，但本领域技术人员将理解的是，在不背离随附权利要求所包含的本发明范围的情况下，可作出形式和细节上的各种改变。
参考文献：
Bao，L.和L.Qin，等(2011).“来自巴戟天的蒽醌化合物在体外抑制折骨的骨吸收(AnthraquinonecompoundsfromMorindaofficinalisinhibitosteoclasticboneresorptioninvitro)。”Chemico-BiologicalInteractions194(2-3):97-105。
Choi，J.和K.T.Lee，等(2005).“从巴戟天的根中分离的水晶兰苷的镇痛抗炎作用(Antinociceptiveanti-inflammatoryeffectofMonotropeinisolatedfromtherootofMorindaofficinalis)。”BiolPharmBull28(10):1915-8。
Ke，F.，Yadav，P.K.和Ju，L.Z.(2012).“溃疡性结肠炎治疗中的草药(HerbalMedicineintheTreatmentofUlcerativeColitis)。”SaudiJGastroenterol18:3-10。
Li，N.，Qin，L.P.，等(2009).“巴戟天提取物对卵巢切除大鼠中骨损失的抑制作用(InhibitoryEffectsofMorindaofficinalisExtractonBoneLossinOvariectomizedRats)。”Molecules14:2049-2061。
Low，D，Nguyen，DD和Mizoguchi，E.(2013).“溃疡性结肠炎的动物模型及其在药物研究中的应用(Animalmodelsofulcerativecolitisandtheirapplicationindrugresearch)。”DrugDesign,DevelopmentandTherapy7:1341-1357。
Palladino，M.A.，等(2003).“抗-TNF-a疗法：新一代(Anti-TNF-aTherapies:TheNextGeneration)。”NatureReviews2:736-746。
Pistelli，L.，Giovannini，A.，Ruffoni，B.，Bertoli，A.和Pistelli，L.(2010).“用于次级代谢物生产的毛根培养物(HairyRootCulturesforSecondaryMetabolitesProduction)。”营养制品的生物农场：功能性食品和通过生物传感器的安全控制(Bio-FarmsforNutraceuticals:FunctionalFoodandSafetyControlbyBiosensors).第13章:168-184。
Ruoyi，Z.(2010).“从巴戟天中提取的多糖对胎鼠海马神经元的保护作用(ProtectiveeffectsofpolysaccharidesextractedfromMorindaOfficinalisonfetalrathippocampalneurons)。”香港，香港大学.硕士。
Samaan，M.A.和P.Bagi，等(2014).“对溃疡性结肠炎中抗-TNF药物的更新(AnUpdateonAnti-TNFAgentsinUlcerativeColitis)。”GastroenterologyClinicsofNorthAmerica43(3):479-494。
Shin，J.和K.Yun，等(2013).“从巴戟天的根中分离的水晶兰苷经由NF-?B失活改善RAW264.7巨噬细胞中的促炎介质和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎(MonotropeinisolatedfromtherootsofMorindaofficinalisamelioratesproinflammatorymediatorsinRAW264.7macrophagesanddextransulfatesodium(DSS)-inducedcolitisviaNF-?Binactivation)。”FoodandChemicalToxicology53:263-271。
Soon，Y.Y.和B.K.Tan(2002).“在链佐星（streptozotocin）诱导的糖尿病大鼠中评价巴戟天的降血糖和抗氧化活性(Evaluationofthehypoglycemicandanti-oxidantactivitiesofMorindaofficinalisinstreptozotocin-induceddiabeticrats。)”SingaporeMedJ43(2):077-85。
Wu，Y.B.，Zheng，C.J.，Qin，L.P.，等(2009).“来自巴戟天的蒽醌类对成骨细胞和破骨细胞的抗骨质疏松活性(AntiosteoporoticActivityofAnthraquinonesfromMorindaofficinalisonOsteoblastsandOsteoclasts)。”Molecules14:573-583。
YOSHIKAWA，M.和S.YAMAGUCHI，等(1996).“化学信息摘要：中国天然药物的化学成分——巴戟天根——干燥的巴戟的根：Morindolide和Morofficinaloside的结构(ChemInformAbstract:ChemicalConstituentsofChineseNaturalMedicine,MorindaeRadix,theDriedRootsofMorindaofficinalisHow.:StructuresofMorindolideandMorofficinaloside)。”ChemInform27(12):no-no。
Zhou，M.，Zhu，X.，Shao，J.、Tang，Y.和Wu，Y.(2011).“植物毛根培养物中生物活性物质的生产和代谢工程(Productionandmetabolicengineeringofbioactivesubstancesinplanthairyrootculture)。”ApplMicrobiolBiotechnol90:1229-1239。

Claims (15)

1.一种巴戟（MorindaofficinalisHow）植物的提取物，所述提取物包含环烯醚萜和蒽醌，
其中所述环烯醚萜为所述提取物干重的约0.20%-5.0%，和所述蒽醌少于所述提取物干重的约1.0%。
2.权利要求1的提取物，其中所述提取物来自所述巴戟植物的毛根部分。
3.权利要求1的提取物，其中所述环烯醚萜包含水晶兰苷和去乙酰基车叶草苷酸，并且其中所述水晶兰苷为所述提取物干重的约0.25%-2.5%，和所述去乙酰基车叶草苷酸为所述提取物干重的约0.1%-2.0%。
4.权利要求1的提取物，其中所述蒽醌包含甲基异茜草素-1-甲醚，并且所述甲基异茜草素-1-甲醚为所述提取物干重的约0.001%-0.15%。
5.一种治疗受试者中的炎性肠病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的巴戟植物的毛根部分的提取物。
6.权利要求5的方法，其中所述提取物包含环烯醚萜和蒽醌，并且其中所述环烯醚萜为所述提取物干重的约0.20%-5.0%，和所述蒽醌少于所述提取物干重的约1.0%。
7.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含与SEQIDNO:1的cDNA核苷酸序列具有至少90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列；和/或编码与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。
8.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求7的核酸分子。
9.权利要求8的表达载体，其另外包含启动子，其中所述启动子对于赤桉而言并非为天然的。
10.一种发根土壤杆菌细菌，其包含权利要求8或9的表达载体。
11.一种巴戟植物，其通过权利要求10的发根土壤杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）细菌转化。
12.一种提取物，其来自权利要求11的巴戟植物的毛根。
13.一种治疗受试者中的炎性肠病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的权利要求12的提取物。
14.一种治疗受试者中的溃疡性结肠炎的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的来自所述巴戟的毛根的提取物。
15.权利要求14的方法，其中所述提取物包含环烯醚萜和蒽醌，
其中所述环烯醚萜为所述提取物干重的约0.20%-5.0%，和所述蒽醌少于所述提取物干重的约1.0%。
CN201511023127.6A 2014-12-31 2015-12-30 用于增加巴戟天属代谢物的产量的方法 Pending CN105748655A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462098781P 2014-12-31 2014-12-31
US62/098781 2014-12-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105748655A true CN105748655A (zh) 2016-07-13

Family

ID=56342274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511023127.6A Pending CN105748655A (zh) 2014-12-31 2015-12-30 用于增加巴戟天属代谢物的产量的方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9968645B2 (zh)
CN (1) CN105748655A (zh)
HK (1) HK1225636A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019219032A1 (zh) * 2018-05-17 2019-11-21 广州中医药大学 一种维生素d受体激动剂
CN114752621A (zh) * 2022-06-16 2022-07-15 广东省农业科学院作物研究所 一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018136266A1 (en) * 2017-01-18 2018-07-26 Chien Du Shieng Compositions for use in treating inflammatory bowel diseases and intestinal colitis
CN111534483B (zh) * 2020-05-23 2020-12-18 广东壹加再生医学研究院有限公司 一种胰岛素样生长因子结合蛋白7激活剂在人脐带间充质干细胞成软骨分化中的应用
US11299700B1 (en) 2021-02-19 2022-04-12 Acequia Biotechnology, Llc Bioreactor containers and methods of growing hairy roots using the same
CN112931224A (zh) * 2021-04-16 2021-06-11 广州中医药大学(广州中医药研究院) 巴戟天的组织培养方法
CN116589603A (zh) * 2023-02-28 2023-08-15 中山大学 巴戟天多糖纳米硒及其制备方法和抗肿瘤的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588693A (en) 1983-02-28 1986-05-13 Research And Development Institute, Inc. At Montana State University Development of plant roots
US20110217394A1 (en) 2000-12-05 2011-09-08 Brett Justin West Iridoid Based Formulations
US6855344B2 (en) 2001-07-17 2005-02-15 Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation
US7202397B2 (en) 2002-08-16 2007-04-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chalcone synthase
KR20050092313A (ko) * 2004-03-15 2005-09-21 주식회사 엘지생활건강 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 식물 추출물을 함유하는피부미백용 화장료

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019219032A1 (zh) * 2018-05-17 2019-11-21 广州中医药大学 一种维生素d受体激动剂
CN114752621A (zh) * 2022-06-16 2022-07-15 广东省农业科学院作物研究所 一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法

Also Published As

Publication number Publication date
HK1225636A1 (zh) 2017-09-15
US9968645B2 (en) 2018-05-15
US20160220625A1 (en) 2016-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105748655A (zh) 用于增加巴戟天属代谢物的产量的方法
Babich et al. Modern trends in the in vitro production and use of callus, suspension cells and root cultures of medicinal plants
Alamgir et al. Biotechnology, in vitro production of natural bioactive compounds, herbal preparation, and disease management (treatment and prevention)
Zhao et al. An improved syringe agroinfiltration protocol to enhance transformation efficiency by combinative use of 5-azacytidine, ascorbate acid and tween-20
KR20100120157A (ko) 헤마글루티닌을 발현하는 트랜스제닉 식물에서 생산된 재조합 인플루엔자 바이러스-유사 입자(ＶＬＰｓ)
Wang et al. Identification of anthocyanin composition and functional analysis of an anthocyanin activator in Solanum nigrum fruits
Jia et al. Comparison of soybean transformation efficiency and plant factors affecting transformation during the Agrobacterium infection process
Huang et al. Anti-hepatitis B virus activity of esculetin from Microsorium fortunei in vitro and in vivo
Stepanova et al. Hairy roots of Scutellaria spp.(Lamiaceae) as promising producers of antiviral flavones
Song et al. PbMYB120 negatively regulates anthocyanin accumulation in pear
Shanmugaraj et al. Potential for developing plant-derived candidate vaccines and biologics against emerging coronavirus infections
Arnao et al. Melatonin from microorganisms, algae, and plants as possible alternatives to synthetic melatonin
Dehghani et al. Microalgae as an efficient vehicle for the production and targeted delivery of therapeutic glycoproteins against SARS-CoV-2 variants
Park et al. Two chalcone synthase isozymes participate redundantly in UV-induced sakuranetin synthesis in rice
Baek et al. Development of hairy root cultures for biomass and triterpenoid production in Centella asiatica
Karlson et al. CRISPRi-mediated down-regulation of the cinnamate-4-hydroxylase (C4H) gene enhances the flavonoid biosynthesis in Nicotiana tabacum
Wang et al. Functional characterization of a dihydroflavanol 4-reductase from the fiber of upland cotton (Gossypium hirsutum)
Zhang et al. Flavonoids as potential antiviral agents for porcine viruses
Abdelkhalek et al. Protective and Curative Activities of Paenibacillus polymyxa against Zucchini yellow mosaic virus Infestation in Squash Plants
Gajurel et al. Production and secretion of isowighteone in hairy root cultures of pigeon pea (Cajanus cajan) co-treated with multiple elicitors
Malarz et al. Hairy root cultures as a source of phenolic antioxidants: simple phenolics, phenolic acids, phenylethanoids, and hydroxycinnamates
Zhang et al. Safflower flavonoid 3′ 5′ hydroxylase promotes methyl jasmonate-induced anthocyanin accumulation in transgenic plants
Lee et al. Expression of genes related to phenylpropanoid biosynthesis in different organs of Ixeris dentata var. albiflora
Kagambega et al. Polyphenolic profile, anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of some african medicinal plants
Wang et al. Dihydrochalcones in sweet tea: Biosynthesis, distribution and neuroprotection function

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1225636

Country of ref document: HK

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160713

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1225636

Country of ref document: HK