CN105746334B - 一种促进植物远缘杂交结实的雌蕊处理试剂及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物育种领域，提供了一种促进植物远缘杂交结实的雌蕊处理试剂及其应用方法，该试剂主要由硼酸、CaCl₂、牛血清白蛋白、甘露醇溶液等组成，在授粉前10‑30分钟向雌蕊柱头喷施该试剂，有利于提高结实率，并对幼苗成活率也有有利的影响。利用本发明所提供的方法，可以有效地克服植物种间杂交的不亲和性，有效地克服了普通小麦和除虫菊与其同科不同属植物的杂交障碍，实验证明，通过该方法提高杂交种子的结实率，种子饱满度好，为植物远缘杂交获得优良杂种提供了一种新的途径。

Description

一种促进植物远缘杂交结实的雌蕊处理试剂及其应用方法

技术领域

本发明涉及植物育种领域，提供了一种可以促进植物远缘杂交结实的雌蕊处理试剂及其应用方法。

背景技术

远缘杂交(Distant hybridization)是指种以上分类单位生物类型之间的杂交，包括同属植物的种间杂交(Interspecific hybridization)、不同属植物的属间杂交(Intergeneric hybridization)以及更高分类阶元物种之间的杂交，如亚族间杂交(Inter-subtribal hybridization)、族间杂交(Intertribal hybridization)等，是实现基因远缘转移的一条重要途径。

植物遗传育种技术，又称品种改良，是改良农作物、园林植物的遗传特性，以培育高产优质品种的技术，是一项投资少而效益高的生物技术，对发展种植业生产具有十分重要的意义。品种改良和种质创新的前提和基础是种质资源，远缘杂交则是实现这一目标的一条重要和有效途径。

由于各物种间存在不同程度的生殖隔离，使得远缘杂交在很多情况下都难以成功。成功的远缘杂交依赖于植物传粉受精过程中一系列成功的事件，从花粉粒的附着、萌发、花粉管的生长、双受精的完成，到合子、胚乳的发育等，其中任何一个环节发生障碍，都会直接导致杂交的失败。与生物体自身相关的远缘杂交障碍主要有:亲本的不可交配性(Incrossability)或不亲和性(Incompatibility)；杂种胚与胚乳组织发育的不协调性(Incongruity)以及由于杂种胚的降解(Degeneration)或败育(Abortion)或杂种的不育(Sterile hybrid)而引起的杂种崩溃(Hybrid breakdown)。或者说，依据能否正常完成受精作用并发育形成合子，而将生殖障碍划分为受精前障碍(Pre-fertilizationbarriers)(也称合子前障碍，Pre-zygotic barriers)和受精后障碍(Post-fertilizationbarriers)(也称合子后障碍，Post-zygotic barriers)。其中，受精前障碍是主要影响因素，如果克服受精前障碍，在保持合子成活率稳定的情况下，可以保证一定的远缘杂交后代的数量。

以小麦为代表的禾本科植物的远缘杂交研究进展：

小麦在粮食产物中种植面积大、产量高、贸易额多，是人类主食之一。培育出高产稳定，适应性强，抗逆性强的小麦是现在育种工作者所期望的，而远缘杂交育种是实现这一目的最经济的手段，在小麦属种的其它属，小麦种属内其他物种以及与小麦亲缘关系更远的种属中蕴藏着各种各样的、普通小麦中所不具备的性状基因，而这些基因控制着小麦的优良性状。通过远缘杂交、染色体工程技术、基因工程技术等生物手段，可以将这些基因整合到小麦基因中并使之表达，从而丰富小麦的遗传基因库，为小麦育种提供各种优良种质资源。

远缘杂交将近缘种属的有益基因导入，创造新的种质资源，是目前小麦育种的主要研究方向之一。小麦族近缘属植物中的遗传因子是丰富多彩的，其中具有大量普通小麦所不具备的优良基因，如蛋白质含量高、抗倒伏、稳产抗病、抗逆等优良性状，如果能够导入到现在的种植小麦中，将会有很大的突破。孙善成等(1987)从事小麦与偃麦草远缘杂交三十余年，从介绍了亲本选配原则、花期调节、交配方法等远缘杂交技术,用回交与重复授粉、筛选结实率高的组合与单株、延长生育期等方法克服远缘杂种F₁的不育性等方面做了有益的探索，总结了小偃麦远缘杂种的培育和选择的方法,并创制并应用了八倍体小偃麦、异附加系、异代换系和六倍体小偃麦(小麦新品种)等。近几年，我国在小麦远缘杂交育种方面方面取得了很多可喜的成就，并成功培育出了一系列小麦新品种。袁汉民、杨欣明(2004)等采用常规杂交的方法，利用普通小麦与黑小麦、人工合成小麦双二倍体、柱穗山羊草杂交，培育出了十个稳定的优良品系。张正茂等(2003)等则通过远缘杂交获得旱地小麦新品种小冰麦，在特定品质上要优于普通小麦。李振声、陈濑阳等通过基因工程技术，远缘杂交技术与常规育种相结合的方法，利用小麦与长穗偃麦草远缘杂交成功培育成了小偃4号、小偃5号、小偃6号、小偃107、小偃168、小偃503、早优504等多个小麦新品种，并广泛的用于了农业生产。陈惠民、夏光敏等(1999)选用细胞融合技术培育出小麦与高冰草的杂种，克服了小麦常规育种中远缘杂交不亲和的障碍，缩短了育种周期，在此基础上还先后获得了小麦与谷子、掉毛雀麦、无芒雀麦3种组合的远缘杂种植株。刘登才、李光蓉(2001)等发现山羊草作为母本、小麦推广种作为父本的杂交成功率较高，而且其杂交后代能够很好的继承亲本抗逆性，抗倒伏的性状，此杂种小麦的经济价值很高。

小麦远缘杂交与品种间杂交相比，最主要的问题是：远缘杂交存在不亲和的障碍，即杂种不育或者杂交后代不易成活；杂交子代易夭亡，即使有些个体正常的发育成熟，结实率也很低，甚至有些子代完全不育。由于远缘杂交具有上述特点就增加了远缘杂交育种工作的困难性、重复性。因此，长期以来限制了远缘杂交在小麦育种实践中的广泛应用。

以除虫菊为代表的园林植物的远缘杂交研究进展：

除虫菊(学名：Pyrethrum cinerariifolium)是菊科的多年生草本植物。原产欧洲，栽培药用，主要作农业杀虫剂。我国本世纪20年代开始引种栽培。现在，我国各地均适宜栽培，目前在山东、陕西、黑龙江、吉林、辽宁、江苏、浙江、安徽、江西、湖南、四川、广东、云南都有分部。

除虫菊的农业价值在于不仅可以除灭蚊虫，而且可杀灭农作物和林木、果树的害虫。它和烟草、毒鱼藤合称为“三大植物性农药”。

为了提高除虫菊的产量和含量，在除虫菊品种方面加大优选力度，国内外进行了多种优良品种的繁育工作。包括：1、通过太空育种培育除虫菊。利用太空理想的微重力、超洁净、高真空、强辐射和弱磁场等特殊环境影响下，促使种子完成地面难以实现的基因变异。然后通过对这些变异种子的筛选获得具有优良性状的品种在地面培育。2、通过基因工程培育除虫菊。主要采用基因转化和增强除虫菊基因表达来提高除虫菊素的含量。

但是最根本的方法还是通过选择优良品种来培育除虫菊。但是同样受到种质资源狭窄的限制。菊科，是菊亚纲的第一大科，共13族1300余属，近2.2万种，除南极外，全球分布。我国约有220属近3000种，全国各地分布，其中太行菊属、葶菊属、紫菊属、君范菊属等15属为中国特有。

日本的Ohishi(1966)通过胚挽救措施获得了亲缘关系相对很远的一些远缘杂种,包括我国的单属种芙蓉菊(Crossostephium chinense)。Douzono等实现了菊科菊属种间杂交种(1998)的周年生产(Dendranthemum grandiflorium and D.Shiwogiku)。李辛雷等(2008)开展了不同倍性菊属物种间远缘杂交试验,比较不同杂交组合的杂交亲和指数,并对授粉后生殖生物学过程(柱头花粉附着、花粉萌发、花粉管生长、受精及子房发育)进行荧光显微观察。胡枭,赵惠恩(2008)以太行菊属的太行菊与菊属、亚菊属以及F11(矶菊×毛华菊)、F12(矶菊×毛华菊)作为远缘杂交的亲本,计20个杂交组合,共获得2063粒种子,694株幼苗,经过形态学鉴定,初步筛选出23株杂种苗,分别为太行菊×异色菊、太行菊×野菊、太行菊×甘菊、甘菊×太行菊、太行菊×亚菊、亚菊×太行菊的杂交种.汤访评等(2011)，对栽培菊花品种进行改良和种质创新，以菊花品种‘天坠玉露’为母本，大岛野路菊×芙蓉菊、南京野菊×芙蓉菊和菊花脑×菊蒿3个属间杂种为父本进行人工杂交，对杂种后代进行细胞学、形态学观察和基因组双色荧光原位杂交分析。

目前,荷兰和日本的研究人员也在研究如何利用更多近缘属进行菊花种质资源的创新,通过转基因手段将除虫菊的关键基因导入菊花但未能表达。因此，通过远缘杂交培育有益成分含量高，适应性广、抗病性强的除虫菊新种质将有利于该产业的推广应用。

发明内容

针对现有远缘杂交存在的诸多问题，本发明立足于解决受精前的障碍，以提高远缘杂交结实率，提供了一种主要由硼酸、CaCl₂、牛血清白蛋白、甘露醇溶液等组成的处理试剂，在授粉前10-30分钟向雌蕊柱头喷施该试剂，有利于提高结实率，并对幼苗成活率也有有利的的影响。利用本发明所提供的方法，可以有效地克服植物种间杂交的不亲和性，有效地克服了普通小麦和除虫菊与其同科不同属植物的杂交障碍，实验证明，通过该方法提高杂交种子的结实率，种子饱满度好，为植物远缘杂交获得优良杂种提供了一种新的途径。

本发明首先提供了一种促进植物远缘杂交结实的雌蕊处理试剂，该处理试剂的主要成分按重量百分比计为：

0.02-0.06％硼酸、0.4-0.6％CaCl₂、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12-12.5g/100ml的甘露醇,0.04-0.20％果胶酶、0.1-0.3％纤维素酶、0.1-0.3％半纤维素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量为无菌水，其pH为6-8。

上述各组分中之所以加入各种酶，是由于植物雌蕊外层的主要成分复杂，主要是由纤维素、半纤维素、果胶，木质素等多糖物质交联在一起组成，上述采用的各种酶可以促进其消化雌蕊外壁，利于花粉管的突入，如果各种酶用量过少，则不能充分破坏外壁，花粉管进入效果达不到；用量如果过大，则可能对雌蕊内部和外部结构造成损伤，也不利于受精、发育结实，故而选择上述的具体用量；组分中的BSA是酶的稳定剂，加入之后可以防止酶的分解和非特异性吸附，能有效减轻有些酶的变性，防止酶吸附到管壁而损失；硼酸和氯化钙中的硼元素和钙元素能够促进花粉管的萌发和延伸，同时赤霉素也促进花粉管的萌发和延伸；甘露醇调控处理液的渗透压，上述物质综合作用，在促进花粉管萌发中都有作用，对于远缘杂交可能更好的促进试剂稳定、花粉管的萌发和延伸，维持酶的稳定性，从而为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶起到作用打破雌蕊坚硬的外壁，便于花粉管的进入提供更好的条件。

更进一步的，发明人针对小麦优化了上述处理试剂的成分，其主要成分按重量百分比计为：

0.02-0.04％硼酸、0.4％CaCl₂、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12g/100ml的甘露醇,0.04-0.18％果胶酶、0.1-0.15％纤维素酶、0.1-0.15％半纤维素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量为无菌水，其pH为6-8。

同理，发明人针对除虫菊优化了上述处理试剂的成分，其主要成分按重量百分比计为：

0.04-0.06％硼酸、0.6％CaCl₂、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12.5g/100ml的甘露醇,0.08-0.20％果胶酶、0.2-0.3％纤维素酶、0.2-0.3％半纤维素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量为无菌水，其pH为6-8。

由于小麦和除虫菊之间的物种差异，发明人经过对其雌蕊外层化学结构的研究发现针对除虫菊时各种酶用量应该增大，以加快破除其外壁，利于花粉管的突入，同时需提高硼酸和氯化钙以利其花粉管的萌发和延伸，故此两者的处理试剂有上述的差异存在；

除此之外，发明人还提供了上述处理试剂的具体使用方法，具体步骤如下：

对母本植物进行去雄处理，之后对母本的雌蕊进行喷施处理，喷施时用高雾化喷施，喷施时间为10-30秒，处理时间30-60min；雾化程度为80-100:1。

综上所述，采用本发明的雌蕊处理试剂，在授粉前10-30分钟向雌蕊柱头喷施该试剂，有利于提高结实率，并对幼苗成活率也有有利的的影响。利用本发明所提供的方法，可以有效地克服植物种间杂交的不亲和性，有效地克服了普通小麦和除虫菊与其同科不同属植物的杂交障碍，实验证明，通过该方法提高杂交种子的结实率，种子饱满度好，为植物远缘杂交获得优良杂种提供了一种新的途径。

具体实施方式

实施例1、小麦远缘杂交试验

试验材料:

试验用普通小麦农艺性状优良的品系15份为母本，包括山农18，山农22，山农23、济麦22、良星66、良星99、泰农18、临麦4号、山农20、鲁原502、济南17号、汶农14、烟农21号、青麦6号；经鉴定的抗病披碱草植株为父本进行远缘杂交。每个杂交组合3个重复，每重复至少3株6穗，对照为不予试剂处理。

使用试剂：对酶液中的甘露醇浓度、酶种类和各种酶浓度的效果进行了筛选。酶液的基本成分为0.02-0.04％硼酸、0.4％CaCl₂、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12g/100ml的甘露醇,附加0.04％-0.18％果胶酶(Serva)、0.10％-0.15％纤维素酶(Onozuka RS)、0.10％-0.15％半纤维素酶(Sigma公司)，0.05-0.08％赤霉酸，余量为无菌水，pH6-8。

试验方法：

材料均于2012～2013年度种植于山东农业大学试验田。

杂交采用捻穗法，授粉后次日再重复一次。

(1)整穗：于抽穗时选择抽出剑叶鞘3-4cm尚未开花的健壮麦穗作杂交母本。在当选小麦植株的主茎穗和次生分蘖上,去除穗子基部的2个小穗和上部小穗,1行留5个小穗,共10个小穗。只保留基部第1、2朵花,其余全部去掉,剪掉整个颖壳的三分之一。

(2)去雄：用镊子轻轻去掉每朵小花的3个雄蕊。去雄时从下向上依次进行,完成1行再进行另1行。

(3)喷施试剂：用高雾化小喷壶喷施，喷施20秒；使用喷壶雾化颗粒细，1.5mm口径，150mm，高雾化小喷壶喷施。

试剂处理完毕后套上纸袋,下口用曲别针别住,并挂纸牌,用铅笔在纸牌注明材料名称、去雄日期等内容。

(4)授粉：处理30min-12min后。一般采用捻穗法:将选好的父本穗子的小穗顶端剪开,再用手轻擦几下后剪下插在地里,小花的花药由颖壳伸出时,立即剪开母本穗子上纸袋上端,把父本穗倒插入袋中捻转几下,使花粉尽量散落在柱头上,然后封好上口,在纸牌上注明父本名称及授粉时间等。

收获后，室内考种，计算平均结实率，并进行LSD检验；将杂交种子在室内发芽，健壮幼苗移栽于大田，抽穗后调查长成植株的数目，并计算成株率。收获后室内考种，计算杂种植株在开放授粉条件下的每穗结实率，其公式如下：

结实率＝结实粒数/授粉颖花数×100％

试验结果

结果分析：

试剂处理后远缘杂交效果处理显著，在没有使用雌蕊处理试剂的情况下，15个小麦品种，与披碱草的远缘杂交结实率在0.59-4.02％之间，最高的是山农22，最低的是济麦22.使用雌蕊处理试剂之后，结实率提高显著，2.79-5.89％，最高为山农18，最低为临麦4号。其中，增长倍数最多的是济麦22，增长到4.55倍。

实施例2、除虫菊的远缘杂交试验

试验材料

试验于2012年9月至2013年12月在山东省济南市忆禾园林有限公司苗圃进行。供试母本为常规栽培除虫菊品种，父本供试材料为太行菊，甘菊、异色菊、神农香菊、四倍体野菊、同源四倍体菊花脑,六倍体毛华菊、六倍体小红菊及普通栽培菊花。

所有材料均来源于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”。

使用试剂：对酶液中的甘露醇浓度、酶种类和各种酶浓度的效果进行了筛选。酶液的基本成分为0.04-0.06％硼酸、0.6％CaCl2、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12.5g/100ml的甘露醇,附加0.08％-0.20％果胶酶(Serva)、0.20％-0.30％纤维素酶(Onozuka RS)、0.20％-0.30％半纤维素酶(Sigma公司)，0.05-0.08％赤霉酸，余量为无菌水，pH6-8。

试验方法

(1)母本处理：选择生长健壮的除虫菊植株作为母本,选取20个发育良好的头状花序，套上硫酸纸袋。在舌状花刚露色时去雄，即将内轮两性管状小花全部去除，同时剪去舌状花花瓣直至可见柱头，不能伤及柱头，并进行套袋。

(2)搜集父本花粉：父本在头状花序开放散粉前套袋隔离。待母本柱头伸出，并开叉呈现一定角度和分泌黏液时(3-5d后)，收集已套袋的父本新鲜花粉，备用。

(3)授粉：授粉前，喷施雌蕊处理试剂，每个头状花序喷施10秒，30-60min后，用毛笔进行授粉，授粉后继续套袋隔离，次日重复喷施、授粉1次。

(4)统计亲和指数：待母本花梗变黄枯萎时采集授粉花序，脱粒、统计亲和指数。

结实率(％)＝所得种子数/杂交花序数目×100

结果：

结果分析：

试剂处理后远缘杂交效果处理显著，在没有使用雌蕊处理试剂的情况下，除虫菊与9个菊科植物品系的远缘杂交亲和指数在16.7-128.6之间，最高的是异色菊，最低的是同源四倍体菊花脑。使用雌蕊处理试剂之后，除了异色菊之外(亲和指数仅为未处理的1.06倍)，亲和指数明显提高，提高到2.11-3.38倍，提高幅度最大的是四倍体野菊，最低为六倍体毛华菊。

Claims (4)

1.一种促进植物远缘杂交结实的雌蕊处理试剂，其特征在于：该处理试剂的成分如下：

0.02-0.06％硼酸、0.4-0.6％CaCl₂、1.0％牛血清白蛋白、12-12.5g/100ml的甘露醇,0.04-0.20％果胶酶、0.1-0.3％纤维素酶、0.1-0.3％半纤维素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量为无菌水，pH6-8。

2.根据权利要求1所述的处理试剂，其特征在于：当母本为小麦时，处理试剂的成分如下：

0.02-0.04％硼酸、0.4％CaCl₂、1.0％牛血清白蛋白、12g/100ml的甘露醇,0.04-0.18％果胶酶、0.1-0.15％纤维素酶、0.1-0.15％半纤维素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量为无菌水，pH6-8。

3.根据权利要求1所述的处理试剂，其特征在于：当母本为除虫菊时，处理试剂的成分如下：

0.04-0.06％硼酸、0.6％CaCl₂、1.0％牛血清白蛋白、12.5g/100ml的甘露醇,0.08-0.20％果胶酶、0.2-0.3％纤维素酶、0.2-0.3％半纤维素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量为无菌水，pH6-8。

4.权利要求1所述雌蕊处理试剂的应用方法，其特征在于：具体步骤如下：

对母本植物进行去雄处理，之后对母本的雌蕊进行喷施处理，喷施时用高雾化喷施，喷施时间为10-30秒，处理时间30-60min；雾化程度为80-100:1。