CN105734031A - 一种erk1/2蛋白抑制多肽、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域,具体而言,涉及一种ERK1/2蛋白抑制多肽,该多肽可竞争性抑制ERK1/2与IQGAP1的结合,进而抑制ERK1/2的磷酸化。ERK1/2蛋白抑制多肽仅有21个氨基酸,无论是人工合成该多肽还是运用宿主细胞表达制备均非常方便易行,利于大规模推广利用;且该多肽来源于生物体内固有的蛋白质,用于动物实验不会造成免疫排除,通常大多数抑制剂均为人工合成的化合物,相比之下本申请提供的蛋白多肽对细胞毒性更小,也更为特异。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域,具体而言,涉及一种ERK1/2蛋白抑制多肽、其制备方法及应用。
背景技术
Ras蛋白是一种小G蛋白,RAS信号途径是一种很常见且重要的细胞分子信号传导途径。其信号途径为:Ras→Raf(MAPKKK)→MAPKK(MEK)→MAPK(ERK1/2)→进入细胞核→转录因子→基因表达。RAS通路与炎症,肿瘤等密切相关。因此成为治疗炎症,肿瘤的作用靶点。
目前针对Ras通路的多个环节开发出了多种抑制剂。但是目前尚没有特异性针对ERK1/2的抑制剂,因而目前仅能通过抑制其上游蛋白——如MEK蛋白等——来间接实现抑制ERK1/2活性的目的。由于细胞信号转导最重要的特征之一是构成复杂的信号网络系统,具有高度的非线性特点,因而细胞内不同信号通路间普遍存在着信号对答(cross-talking)的现象,而Ras信号通路作为细胞内部最重要的信号通路之一,ERK1/2的上游蛋白通常也是其他信号通路的传导节点,所以对其上游蛋白进行抑制会对细胞内部的活动造成广泛的影响,进而无法特异性地针对ERK1/2蛋白进行研究,这大大地限制了ERK1/2蛋白的相关研究。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ERK1/2蛋白抑制多肽,所述多肽可特异性地抑制ERK1/2的磷酸化,从而发挥ERK1/2抑制剂的功能。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种ERK1/2蛋白抑制多肽,所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1,6-bisphosphatase1,FBP1)是糖异生中的关键限速酶之一,在糖代谢中起重要作用。哺乳动物存在肝脏型和肌肉型两种果糖-1,6-二磷酸酶同工酶,分别由Fbp1和Fbp2基因编码。
本申请中记载的ERK1/2蛋白抑制多肽为FBP1中的一部分序列,该段序列在不同物种间高度保守,由27个氨基酸构成。
IQGAP1(IQmotifcontainingGTPaseactivatingproteins)是近年来新发现的一个蛋白家族,其序列中含有类似于RasGAPs催化域的广泛序列和位于N端的4个可与钙调蛋白相互作用的IQ模体,在哺乳动物中有三个同源物IQGAP1~3。不同于IQGAP2和IQGAP3限制性地表达于肝和肠道等器官,IQGAP1呈现出一种全身性地表达。有研究表明,IQGAP1可通过其WW结构域调节ERK的磷酸化(如图1所示)。发明人在实验中偶然发现FBP1能与ERK一样结合IQGAP1的WW结构域,在进一步的研究中,发明人将FBP1分成七段,发现只有第四段能与IQGAP1进而抑制ERK的磷酸化,为了描述方便,发明人将这第四段多肽命名为FBPe4,其即为本申请所述的ERK1/2蛋白抑制多肽。由于FBPe4具有上述特性,因而可作为ERK1/2蛋白的竞争性抑制剂来使用。
FBPe4可以特异性抑制ERK1/2的活性,可更精确地用于ERK1/2功能的相关研究与应用。并且它来源于生物体内固有的蛋白质,相比人工合成的化合物抑制剂更加安全。
优选的,如上所述的ERK1/2蛋白抑制多肽,所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNo:1所示的氨基酸序列经添加一个或几个氨基酸,得到的编码相同活性蛋白质的氨基酸序列。
进一步优选的,所述多肽为FBP1蛋白的氨基酸序列。
本领域技术人员应可根据本发明公开ERK1/2蛋白抑制多肽序列对其进行改造,将SEQIDNo:1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸,得到的编码相同活性蛋白质的氨基酸序列,如天然蛋白FBP1即为实例之一,通过过表达FBP1也可抑制ERK1/2蛋白活性。
编码如上所述的ERK1/2蛋白抑制多肽的基因,所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
编码如上所述的ERK1/2蛋白抑制多肽的基因,所述基因的核苷酸序列为SEQIDNo:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸,编码相同活性蛋白质的核苷酸序列,得到的编码相同活性蛋白质的核苷酸序列。
应当理解,本领域人员可根据本发明公开的ERK1/2蛋白抑制多肽的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:2),在保证其活性的前提下,取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸,得到该基因的突变序列。
例如简并密码子直接的互相替换:
aaagatgctctgcaaccaggccggaacctggtggcagccggctacgcactgtatggcagtgccaccatgctggtccttgcc也能编码出SEQIDNo:1所示蛋白。
SEQIDNO:2所示的核苷酸序列是由81个核苷酸组成的基因。
此外,可将FBP1全长序列中缺失SEQIDNO:2所示的核苷酸序列得到缺失突变体,所述缺失突变体可用于FBP1的功能研究或者基于FBP1功能的相关疾病的研究,特别是在FBP1与IQGAP1相互作用研究中的应用。
含有如上所述基因的重组质粒。
进一步优选的,所述重组质粒为将SEQIDNo:2所示的核苷酸序列插入到pcDNA3.1/V5-His-TOPO中得到。
含有如上所述重组质粒的宿主细胞。
进一步优选的,所述宿主细胞为大肠杆菌、PANC-1或MIAPaCa-2中的一种。
根据如上所述的重组质粒在PANC-1细胞中表达制备ERK1/2蛋白抑制多肽的方法,包括以下步骤:
将核苷酸序列为SEQIDNo:2的基因片段定向克隆到pcDNA3.1/V5-His-TOPO表达载体中,将得到的重组表达质粒转染PANC-1细胞并培养,表达重组蛋白;将表达后的蛋白经初步分离、纯化后制得重组蛋白。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1)、本申请首次提供了一种ERK1/2蛋白特异性的竞争性抑制剂。
2)、ERK1/2蛋白抑制多肽仅有21个氨基酸,无论是人工合成该多肽还是运用宿主细胞表达制备均非常方便易行,利于大规模推广利用。
3)、ERK1/2蛋白抑制多肽来源于生物体内固有的蛋白质,用于动物实验不会造成免疫排除,通常大多数抑制剂均为人工合成的化合物,相比之下本申请提供的蛋白多肽对细胞毒性更小,也更为特异。
4)、由于为生物体内固有的蛋白质,还可通过慢病毒等手段将编码该多肽的基因片段转染至细胞内进行稳定表达,操作方便,更利于在体研究;更一步的,也可将包含该基因片段的病毒注射入实验动物体内,并结合动物行为学等实验手段,在整体水平上对ERK1/2及其所在信号通路进行更深入的研究,具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为FBPe4抑制ERK1/2的原理示意图:正常情况下,IQGAP1可通过其WW结构域协助MEK进行ERK1/2的磷酸化(图左部分);在FBPe4存在时,会竞争性地与WW结构域结合进而抑制ERK1/2的磷酸化;
图2~4为本申请实施例1中FBPe4与IQGAP1的相互作用验证及初步功能验证;
图2为寻找IQGAP1与FBP1相结合的蛋白区段的GST试验pulldown实验;A为IQGAP1结构域及IQGAP1的6段含有GST标签的截断体的示意图;B为GSTpulldown实验验证IQGAP1WW结构域可以与FBP1互相结合(IP:GST,IB:FBP1);
图3为寻找FBP1与IQGAP1相结合的蛋白区段的GST试验pulldown实验;A为FBP1结构域及FBP1的7段含有GST标签的截断体的示意图;B为GSTpulldown实验验证FBP1的e4结构域可以与IQGAP1互相结合(IP:GST,IB:IQGAP1);
图4为FBPe4的初步功能验证;A为RNA干扰实验验证FBP1特异性地干扰ERK2与IQGAP1的结合(shNT:乱序小干扰RNA,IP:IQGAP1);B为FBP1e4段蛋白在不同物种中的氨基酸序列;C为免疫共沉淀实验验证FBPe4可特异性地干扰ERK2与IQGAP1的互相结合;
图5为本申请实施例3中FBPe4的功能验证;A为FBP1G260R及FBP1ΔFBPe4突变蛋白的结构示意图;B为免疫共沉淀实验验证FBPe4特异性地抑制ERK1/2的磷酸化(IP:Flag)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1含有FBPe4与IQGAP1的相互作用验证及初步功能验证
S11、主要实验材料:
1)、细胞
本试验选择胰腺癌细胞系PANC-1。胰腺癌细胞系为K-ras突变型细胞系,能在正常情况下检测到pERK1/2,因此能观察到经过FBPe4处理后,pERK1/2的变化情况,便于观察实验效果。
PANC-1购自ATCC(AmericanTypeCultureCollection,Manassay,VA,USA)公司。PANC-1细胞使用DMEM培养基(CORNING,Manassa,VA,USA),含10%胎牛血清(LifeTechnologies)、100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)。细胞培养箱中培养,培养条件为5%CO2,37℃,95%湿度。
2)、质粒
Flag-FBP1,FBPe4和FBPΔE4装入pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen,460083)载体,该载体含有Flag标签。GST-FBP1,IQGAP1突变体装入pGEX-4T-1载体。
3)、抗体
FBP1(Abcam,ab109732,稀释浓度1:1000);
ERK2(SantaCruzBiotechnology,SC-1647,稀释浓度1:5000);
FLAGM2(Sigma-Aldrich,F-3165,稀释浓度1:3000);
IQGAP1(SantaCruzBiotechnology,H-109,稀释浓度1:5000)。
4)、shRNA序列购自Sigma-Aldrich(St.Lois,MO)公司:
5′-CCGGCCTTGATGGATCTTCCAACATCTCGAGATGTTGGAAGATCCATCAAGGTTTTTG-3′(shFBP1)
S21、IQGAP1蛋白的结构域如图2A所示,根据IQGAP1结构域,将IQGAP1分成6段,并合成从P1到P6的6段含有GST标签的截断体。
利用GSTpulldown实验,将IQGAP1的6段GST截断体与FBP1蛋白共同孵育。
GSTpulldown实验步骤:PANC-1细胞使用细胞裂解缓冲液(20mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,0.1%NonidetP40,1mMDTT(dithiothreitol),10%glycerol,1mMEDTA,2.5mMMgCl2及1μg/mlleupeptin)4℃裂解30分钟。GST融合蛋白结合到GST珠子上(GEHealthcareLifescience)。细胞裂解产物与GST珠子4℃共同敷育4h。珠子用细胞裂解缓冲液清洗5次,每次清洗后,离心,去除上清。加入RIPA缓冲液与loadingbuffer(NOREX),DTT的混合液60μL,100℃煮5分钟。然后利用10%SDS-polyacrylamide胶电泳后分离蛋白,然后转入硝化纤维膜,与1抗4℃共同敷育过夜。次日用1×TBST清洗后,与二抗室温敷育1小时。蛋白随后用化学发法检测。
WesternBlotting法检测结果(图2B)显示P3段即IQGAP1WW结构域可以与FBP1互相结合。
S22、对FBP1蛋白结构域进行分析(图3A)并设计7段含有GST标签的截断体。同样利用GSTpulldown实验,将FBP1的7段GST截断体与IQGAP1蛋白共同孵育。
WesternBlotting法检测结果(图3B)显示e4段结构域可以与IQGAP1互相结合。
S23、利用RNA干扰技术敲除FBP1。使用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)转染进PANC-1细胞,48小时后收样并提取蛋白,使用IQGAP抗体做作免疫共沉淀及WesternBlotting检测。
免疫共沉淀:回收细胞,使用细胞裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,1%NonidetP-40,0.5%sodiumdeoxycholate和1%proteaseinhibitorcocktails,Sigma-Aldrich)裂解细胞。细胞裂解产物离心,取上清,与protein-G珠子(LifeTechnologies)4℃共同敷育过夜。次日,珠子用细胞裂解缓冲液清洗5次,每次清洗后,离心,去除上清。加入RIPA缓冲液与LoadingBuffer(NOREX),DTT的混合液60μL,100℃煮5分钟
WesternBlotting:细胞回收后,使用RIPA缓冲液[1×PBS,1%NonidetP-40,0.1%sodiumdodecylsulfateandproteaseinhibitorcocktail(Sigma-Aldrich,St.Lous,MO)]裂解细胞。使用BCAassay(ThermoFisherScientific)检测裂解后得到蛋白的蛋白浓度。然后加入LoadingBuffer(NOREX),DTT混合后100℃煮5分钟。将上述煮后的样品,利用10%SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离蛋白后,然后转入硝化纤维膜,与1抗4℃共同敷育过夜。次日用1×TBST清洗后,与二抗室温敷育1小时。蛋白随后用化学发法检测。
WesternBlotting结果显示,未敲除FBP1时,ERK2与IQGAP1结合较弱(图4A第2泳道IP,IB:ERK2),而敲除FBP1后,ERK2与IQGAP1结合增强(图4A第3泳道IP,IB:ERK2);但敲除FBP1与否并不影响ERK2上游的C-Raf、MEK2与IQGAP1的结合(图4A第2、3泳道IP,IB:C-Raf、IB:MEK2),因此可说明FBP1特异性地干扰ERK2与IQGAP1的结合。进一步的,本申请比对了不同物种中e4段蛋白的氨基酸序列,发现其序列高度保守(图4B)。
S24、利用氨基酸的保守序列,合成含有FBPe4的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-FBPe4(见实施例2),利用该重组质粒表达不含这段氨基酸序列的FBP1ΔFBPe4质粒:
FBP1ΔFBPe4(缺失E4段质粒)构建的引物:
上游引物:5’-GCCATCGGGGAGTTCATTTTGGT-3’;
下游引物:5’-CGGTAGCCCCTCAAGTAAAACCAC-3’。
将FBP1ΔFBPe4质粒转入细胞,使用IQGAP抗体做作免疫共沉淀,结果显示,FBPe4蛋白能干扰ERK2结合,但是FBP1ΔFBPe4不能干扰结合(图4C),这进一步验证了本申请提供的ERK1/2蛋白抑制多肽FBPe4可抑制ERK与IQGAP1的结合。
实施例2含有FBPe4的重组质粒的构建及FBPe4的表达
根据SEQIDNo:2所示的碱基序列,将这段序列克隆到表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO(含Fag标签,可用Flag抗体检测)。
S21、PCR扩增目标DNA,电泳回收目标DNA
利用FBP1质粒(序列如SEQIDNo:3所示)为模板扩增得到FBPe4的基因序列(即SEQIDNo:2),PCR扩增反应体系为:
其中,FBPe4上游引物为:
5-CGGATATCAAGGATGCTCTGCAACCAGGCCGG-3’;
FBPe4下游引物:
5’-CGCTCGAGGGCAAGGACCAGCATGGTGGCACT-3’。
PCR反应程序为:
完成后将扩增产物进行琼脂糖电泳,切取100bp左右的目标条带,利用胶回收试剂盒回收DNA。
S22、选择酶切位点EcoRV和Xhol进行对目标条带和表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO进行双酶切
酶切体系为:
37℃水浴过夜。
其中,EcoRV和Xhol的酶切位点为:
EcoRV(GATATC);
Xhol(CTCGAG)。
S23、连接
酶切产物琼脂糖电泳,利用胶回收试剂盒回收DNA。
连接体系:
16℃连接过夜。
连接后得到pcDNA3.1/V5-His-TOPO-FBPe4重组质粒。
S24、Top10感受态细菌转化
-80℃取出Top10感受态细菌,置于冰上,加入连接产物(10μL)。冰上放置30分钟,42℃孵育90秒,冰上放置10分钟,加入LB培养基200μL。37℃摇床,180转/min,一小时后细菌涂氨苄西林LB板。24小时后挑取单克隆,扩增后质粒回收试剂盒回收质粒。按S22的酶切体系,酶切后琼脂糖电泳鉴定,选取阳性克隆(电泳可见100bp条带)测序。
S25、细胞内表达
将已克隆的FBPe4质粒lipo2000转染PANC-1细胞,WesternBlotting鉴定蛋白表达。将表达后的蛋白经初步分离、纯化后制得重组蛋白。
实施例3FBPe4抑制ERK1/2的磷酸化
S31、利用pcDNA3.1/V5-His-TOPO-FBPe4重组质粒构建FBP1G260R质粒。
FBP1G260R(第260位甘氨酸换为精氨酸)构建的引物:
上游引物:
5’-CATCGCACTCTGGTCTACAGAGGGATATTTCTGTAC-3’
下游引物:
5’-AACATCAGCCACCATGGAGCCCACATACCGGGCCC-3’
FBP1G260R失去了合成糖原的酶活性。
FBP1G260R及FBP1ΔFBPe4突变蛋白的结构如图3A所示。
S32、将FBP1G260R及FBP1ΔFBPe4质粒转入PANC-1细胞并表达,收取细胞裂解液并用Flag抗体做免疫共沉淀实验(FBP1G260R及FBP1ΔFBPe4质粒表达的重组蛋白均带有Flag标签)。
实验结果显示,FBP1,FBP1G260R,FBPe4均能抑制ERK1/2的磷酸化,但FBP1ΔFBPe4不能抑制,这说明FBPe4多肽片段具有抑制ERK1/2的磷酸化的作用,且该作用的实现与FBP1的合成糖原的酶活性无关。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种ERK1/2蛋白抑制多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.如权利要1所述的ERK1/2蛋白抑制多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNo:1所示的氨基酸序列经添加一个或几个氨基酸,得到的编码相同活性蛋白质的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的ERK1/2蛋白抑制多肽,其特征在于,所述多肽为FBP1蛋白的氨基酸序列。
4.编码权利要求1所述的ERK1/2蛋白抑制多肽的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
5.编码权利要求4所述的基因,其特征在于,所述基因的氨基酸序列为SEQIDNo:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸,编码相同活性蛋白质的核苷酸序列,得到的编码相同活性蛋白质的核苷酸序列。
6.含有权利要求4或5所述基因的重组质粒。
7.如权利要求6所述的重组质粒,其特征在于,所述重组质粒为将SEQIDNo:2所示的核苷酸插入到pcDNA3.1/V5-His-TOPO中得到。
8.含有权利要求6所述重组质粒的宿主细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为大肠杆菌、PANC-1或MIAPaCa-2中的一种。
10.权利要求7所述的重组质粒在PANC-1细胞中表达制备ERK1/2蛋白抑制多肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将核苷酸序列为SEQIDNo:2的基因片段定向克隆到pcDNA3.1/V5-His-TOPO表达载体中,将得到的重组表达质粒转染PANC-1细胞并培养,表达重组蛋白;将表达后的蛋白经初步分离、纯化后制得重组蛋白。
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