CN105723224A - 古德帕斯丘抗原结合蛋白检测和抑制以及其在糖尿病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过给有需要的受试者使用GPBP抑制剂治疗2型糖尿病、限制2型糖尿病的发生和治疗前驱糖尿病状态的方法。本发明还公开了通过确定来自受试者的样本的GPBP用量并将其与对照相比来诊断前驱糖尿病状态和用于诊断发生2型糖尿病的倾向性的方法。

Description

古德帕斯丘抗原结合蛋白检测和抑制以及其在糖尿病中的应用
交叉引用
本申请要求2013年9月27日提交的美国临时专利申请序列号61/883792的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本申请中。
技术背景
基底膜胶原IV(α3NC1)的α3链的非胶原(NC1)结构域的构象部分取决于磷酸化作用。古德帕斯丘抗原结合蛋白(GoodpastureAntigenBindingProtein)(GPBP)(WO00/50607；WO02/061430)是一种新型的非常规蛋白激酶，其能在其超分子组装的过程中催化α3NC1结构域的构象异构化，导致基底膜中多种α3NC1构象异构体的产生和稳定化。GPBP水平上升与非耐受化α3NC1构象异构体(其导致了自身免疫反应介导古德帕斯丘(GP)病)的产生有关。在GP患者中，抗α3NC1(也称为GP抗原)的自身抗体引起迅速发展的肾小球性肾炎并常常引起肺出血，这两者是GP病的主要临床表现。
COL4A3BP是用于调节细胞内部(如肌球蛋白)和外部(如胶原IV)的结构蛋白超分子组织的基因。主要的基因产物GPBP(也称为GPBP-1或77kDGPBP)主要存在于细胞外区室中，在细胞外区室中能够看到GPBP绕胶原IV循环或结合到胶原IV上。有趣的是，该基因也表达可替换的异构体，其主要存在于细胞内并且溶于胞质溶胶(即，GPBP-2也称为GPBPΔ26或CERT)或者不可溶但与细胞膜和细胞器结合(即，GPBP-3也称为91kDGPBP)(WO00/50607；WO2010/009856；Revert-Ros等人，2011，JBiol.Chem286，35030-35043)。
发明内容
在一方面，本发明提供用于治疗2型糖尿病(T2D)或限制T2D发生的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，用于治疗T2D或限制T2D的发生。
在另一方面，本发明提供用于治疗前驱糖尿病状态的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，包括但不限于抗GPBP抗体，用于治疗前驱糖尿病状态。
在进一步的方面，本发明提供用于诊断前驱糖尿病状态的方法，包括：
(a)确定来自有患上前驱糖尿病状态风险的受试者的样本的GPBP用量；和
(b)将样本的GPBP用量与对照样本的GPBP用量相比；
其中与对照样本相比，样本的GPBP用量增加表示受试者存在前驱糖尿病状态。
在另一方面，本发明提供用于诊断发生T2D的倾向的方法，包括：
(a)确定来自有患上前驱糖尿病状态风险的受试者的样本的GPBP用量；和
(b)将样本的GPBP用量与对照样本的GPBP用量相比；
其中与对照样本相比，样本的GPBP用量增加表示受试者有发生T2D的倾向性。
附图说明
图1.升高的细胞外葡萄糖水平诱导了GPBP表达。C2C12细胞在补充有2％马血清和抗菌素的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium))中分化5天。培养物用PBS(磷酸盐缓冲盐水)冲洗并在含有指定浓度的葡萄糖的补充有2％马血清的DMEM中另外孵育24小时。细胞用PBS冲洗并在50mMTris-HClpH7.0、150mMNaCl、1％TritonX-100、1mMPMSF(苯甲基磺酰氟)、10mg/mL亮肽酶素中在4℃裂解30min。如其他地方所述的，通过离心(16000xg，5min，4℃)澄清裂解物，确定上清液的总蛋白浓度(Bio-Rad)，并且近似量(50μg)的每种提取物利用抗-GPBP单克隆抗体(mAb)N27和抗-微管蛋白(Sigma)进行蛋白质印迹分析。
图2.在增加的细胞外葡萄糖浓度下，GPBP激酶抑制增强葡萄糖消耗。A，将A549细胞在含有指定浓度的葡萄糖以及10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中培养24h。然后将细胞在25mMTris-HClpH7.5、150mMNaCl、1％TritonX-100、0.1％SDS、1mMPMSF、10μg/mL亮肽酶素、20mMNaF在4℃裂解30min。通过在16,000xg离心5min(4℃)澄清裂解物并确定上清液的总蛋白浓度(Bio-Rad)。近似量(50μg)的每种裂解物采用蛋白质印迹分析，使用分别购自CellSignalingTechnology、FibrostatinSL和Sigma的初次抗体以及购自Promega的HRP偶联的抗兔IgG和抗鼠IgG第二抗体，以检测在Ser318(PSer318AS160)、GPBP和微管蛋白处磷酸化的AS160蛋白。采用AmershamECLPrimeWesternBlotting检测试剂(AmershamECLPrimeWesternBlottingDetectionReagent)(GE医疗生命科学(GEHealthcareLifesciences)进行显影，并采用ImageQuantLAS4000Mini装置(GE医疗生命科学)进行图像采集。B，将A549细胞在DMEM中培养14h，该DMEM是含有指定浓度的T12并补充了10％胎牛血清和青霉素/链霉素的F-12(315mg葡萄糖/dL)。孵育后，如同A中对细胞进行裂解，并且同样地对上清液中的蛋白质浓度进行测定。利用GlucocardG+计(ArkrayFactory,Inc.)在孵育期的开始和结束时确定基质中的葡萄糖浓度，并利用相应裂解物的蛋白质浓度计算细胞的葡萄糖摄取，用于归一化目的。利用阿霉素(0.5μM)(数据未示出)能得到类似结果，阿霉素是一种不同的GPBP激酶抑制剂(WO/2014/006020)。C，将A549细胞在DMEM中孵育20h，该DMEM是不含(对照)或含有T12(50μM)并添加了10％胎牛血清和青霉素/链霉素的F-12(315mg葡萄糖/dL)，并如同A中对细胞进行裂解。如同A中的，近似量(50μg)的每种裂解物采用蛋白质印迹分析，以检测在Ser318(PSer318AS160)或微管蛋白处磷酸化的AS160蛋白。
图3.在生理学细胞外葡萄糖浓度下，GPBP激酶抑制同样增强了葡萄糖消耗。C2C12小鼠成肌细胞在补充有2％马血清和青霉素/链霉素的DMEM中10天分化成肌管，然后在添加了0.25％马血清、初始葡萄糖浓度115mg/dL、不含或含有T12(50μM))的DMEM中在指示的时间内进行孵育。利用GlucocardG+计(ArkrayFactory,Inc.)确定基质中的葡萄糖浓度。示出的是平均值±SEM(n＝2)。根据t-学生试验分析(t-Studenttestanalysis)，所示各组之间的差异是统计学上显著的。*P＝0.0152；***P＝0.0005。
图4.Irs2-/-小鼠显示出增加的胶原IV表达。收集8-12周大的雄性的野生型(WT，n＝9)小鼠、血糖量正常的Irs2-/-(Irs2-/-，n＝9)小鼠以及糖尿病Irs2-/-(n＝9)小鼠的肾脏，包埋在石蜡中，利用来自EMDMillipore的抗-IV型胶原抗体进行切片的免疫组织化学分析。当空腹血清葡萄糖水平大于120mg/dL时，认为小鼠患有糖尿病。在所示合成照片中，胶原IV表达水平用黑色范围(未表达)和白色范围(表达)表示。示出的是代表图像。初始放大：x400。
图5.Irs2-/-小鼠显示出增加的COL4A3BP表达.收集8-12周大的雄性的野生型(WT，n＝9)小鼠、血糖量正常的Irs2-/-(Irs2-/-，n＝9)小鼠以及糖尿病Irs2-/-(n＝9)小鼠的肾脏，包埋在石蜡中，利用来自FibrostatinSL的抗-GPBPmAbN26进行切片的免疫组织化学分析。当空腹血清葡萄糖水平大于120mg/dL时，认为小鼠患有糖尿病。在所示合成照片中，GPBP表达水平用黑色范围(未表达)和白色范围(表达)表示。示出的是代表图像。初始放大：x400。
图6.血糖量正常的Irs2-缺陷小鼠的循环GPBP水平得到提高。收集野生型(WT，n＝12)小鼠、血糖量正常的Irs2-/-(Irs2-/-，n＝12)小鼠以及糖尿病Irs2-/-(n＝19)小鼠(8-12周大)在被杀死时的血样，并使用基本上如在WO2010/009856中描述的以mAbN26作为捕获抗体、以mAbN27作为检测抗体的原型夹心ELISA测量循环GPBP水平。当空腹血清葡萄糖水平大于120mg/dL时，认为小鼠患有糖尿病。*P<0.05，***P<0.001。
图7.对10周大小鼠的血糖的抗GPBP治疗的效果。不同组的小鼠一周一次接受腹膜内注射的1μg/g体重的抗-GPBPmAbN26或小鼠IgG(Sigma)，并利用血糖测试仪每周监测空腹血糖(尾静脉)。雄性经治疗的野生型(WT+mAbN26，n＝2)，野生型对照(WT+ContIgG，n＝2)，经理的Irs2-/-(KO+mAb26，n＝2)，Irs2-/-对照(KO+ContIgG，n＝2)。雌性经治疗的野生型(n＝2)，野生型对照(n＝2)，经治疗的Irs2-/-(n＝3)，Irs2-/-对照(n＝2)。
具体实施方式
所有引用的参考文献的全部内容通过引用并入本申请中。在本申请中，除非另有说明，采用的技术能够在任意公知的参考文献中找到，比如：MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook,etal.,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)(分子克隆：实验室手册(Sambrook等人，1989，冷泉港实验室出版社))、GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology,Vol.185,editedbyD.Goeddel,1991.AcademicPress,SanDiego,CA)(基因表达技术(酶学方法，第185卷，D.Goeddel编辑，1991，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州))、“GuidetoProteinPurification”inMethodsinEnzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)AcademicPress,Inc.)(《酶学方法》中的《蛋白质纯化指南》，(M.P.Deutshcer编辑，(1990)学术出版社公司))、PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis,etal.1990.AcademicPress,SanDiego,CA)(PCR实验指南：方法和应用指导(Innis等人，1990，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州))、CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,2ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.NewYork,NY)(动物细胞培养：基本技术指南，第二版(R.I.Freshney，1987，Liss公司，纽约市，纽约州))、GeneTransferandExpressionProtocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,TheHumanaPressInc.,Clifton,N.J.)(GeneTransferandExpressionProtocols，109-128页，E.J.Murray编辑，TheHumanaPressInc，克利夫顿，新泽西州)和theAmbion1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。
除非本申请另有明确地说明，本申请中使用的单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代。本申请中使用的“和”能够与“或”互换使用，除非另有明确地说明。
除非上下文中另外明确指出，所公开的用于本发明的一个方面的实施例也能够在本发明的其他方面中使用，并且能够与在本发明其他方面中公开的实施例组合使用。
在一方面，本发明提供用于治疗T2D的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，用于治疗T2D。在该方面中，所述受试者是已经被确诊患有T2D。在另一方面，本发明提供用于限制T2D发生的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，用于限制T2D的发生。在该方面中，所述受试者可以是任何有发生T2D风险的受试者，包括但不限于那些带有一种或多种危险因素的受试者，所述危险因素选自，包括但不限于，肥胖、久坐不动的生活方式、较差的饮食习惯(例如：脂肪过多、纤维素不足、太多简单碳水化合物等)、前驱糖尿病状态和/或T2D家族史、年龄50或更大、高血压、高胆固醇以及妊娠期糖尿病史。
在进一步的方面，本发明提供用于治疗前驱糖尿病状态的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，用于治疗前驱糖尿病状态。在该方面中，所述受试者是患有前驱糖尿病状态的。如在本发明中使用的，“前驱糖尿病状态(pre-diabeticstate)”是满足了糖尿病诊断标准中的一些而不是全部诊断标准的状态。因此，前驱糖尿病状态可以包括：1)具有空腹葡萄糖耐量受损，其是一种β-细胞对口服葡萄糖负荷(oralglucosechallenge)(OGT)的响应是有缺陷的病症，或者2)具有一直升高的空腹葡萄糖(IFG)，其是一种空腹血糖高于被认为是正常的水平但并未高到足以被分类为糖尿病的病症。前驱糖尿病状态与胰岛素抵抗和增加的心血管病变风险有关。具有前驱糖尿病状态的个体其有相对较大的发生T2D的风险。
如在本发明中使用的，“GPBP”是指任何GPBP同种型(isoform)，即：GPBP-1(SEQIDNO:10)、GPBP-2(SEQIDNO:11)和GPBP-3(SEQIDNO:12)。GPBP-1(也称为77kDGPBP)主要在细胞外区室中存在，在细胞外区室中能够看到其绕胶原IV循环或结合到胶原IV上。GPBP-2(也称为GPBPΔ26或CERT)是通过mRNA可变外显子剪接产生的598残基长度的GPBP-1变体，主要在细胞内和细胞质中存在。GPBP-3(也称为91kDGPBP)是707个残基长度的GPBP-1变体，其来自另一非典型的mRNA翻译起始，其仍然主要在细胞内且与细胞膜有关(包括质膜和细胞器的外层)。
如本发明中使用的，“GPBP抑制剂”指能降低所有或个别GPBP同种型的活性或表达的任意化合物或分子。
如本发明人在下述实例中证明的，GPBP-1介导(mediate)了动物模型的T2D发病机理并且GPBP-1活性的抑制延迟或预防了高血糖症。因此，GPBP-1表达或活性抑制剂能用于治疗或限制T2D的发生，或者用于治疗那些患有糖尿病或前驱糖尿病状态的患者。本发明人近期发现(数据未示出)GPBP-1参与了通过一循环相关的至少3个关键活性点：蛋白激酶(细胞质，最终细胞核和内质网)、陪伴分子(内质网)和炎症“细胞因子”(细胞外分室)。朝向细胞外部的循环进程部分通过GPBP-3表达的调节(WO2010/009856)并且由于细胞外GPBP-1再次被捕获且返回到细胞质而完成。证据还表明GPBP-2表达能弥补体内GPBP-1缺陷(Revert-Ros等人，2011，JBiol.Chem286,35030-35043)支持了GPBP-2表达在某种程度上有助于GPBP循环的正常进程。GPBP循环在细胞内阶段和细胞外阶段的存在表明由细胞质中的超常活性引起的病症会直接受到抑制剂化合物的干扰，但也会间接地或者受到ER中活性的抑制剂的干扰或者受到阻碍细胞外活性的抗体的干扰；反之，由细胞外超常活性引起的病症会直接受到阻断抗体的影响并且会间接受到细胞内活性的抑制剂的干扰。因此，根据GPBP循环，可以使用GPBP任意同种型的抑制剂(GPBP-1、GPBP-2和/或GPBP-3)来治疗或限制T2D的发生，或者治疗那些患有糖尿病或前驱糖尿病状态的患者。
在所有方面和实施例中，受试者可以是任何哺乳动物，包括但不限于人、狗、猫、马或家畜(牛、羊等)。在最优选的实施例中，所述受试者是人类受试者。
如本发明中使用的，“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指实现下述中的一个或多个：(a)减轻病症的严重程度；(b)限制或预防具有待治疗病症特征的症状或并发症的发生；(c)抑制具有待治疗病症特征的症状或并发症的恶化；(d)限制或预防先前出现病症症状的患者的症状或并发症的复发。
可以采用本发明的方法限制T2D的症状和并发症，包括但不限于高血糖症、胰岛素抵抗、糖尿病性肾病变、糖尿病神经病变、糖尿病性视网膜病、蛋白尿、肾小球清除率受损(impairedglomerularclearance)、糖尿病循环障碍(diabeticcirculatorydisorders)以及肾衰竭。这些症状/并发症中的任意数量得到限制对于患有T2D的受试者都有非常大的益处。
本发明的方法能够用于治疗患有前驱糖尿病的受试者，例如通过限制/减缓受试者高血糖症、胰岛素抵抗和/或心血管病变的发展，和/或通过限制/减缓受试者向T2D的发展。
在一个实施例中，受试者与对照相比具有增加的循环GPBP。该实施例可以帮助识别从该治疗中获益最多的受试者。该“增加”是与对照(比如来自正常受试者的对照样本，或在对照群中先前确定为“正常”水平GPBP的对照样本)相比任意量的GPBP增加，例如，5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％或更大。在一个实施例中，作为标准曲线参考的GPBP正常值是在血浆中小于10ng/ml。在不同的实施例中，正常GPBP范围是在血浆中为～1ng/ml至10ng/ml之间。因此，在一个实施例中，受试者经鉴定其血浆中含有超过10ng/ml的GPBP时采用根据本发明的方法治疗。确定循环GPBP量的方法是已知的(参见WO2010/009856和US7935492)。
任何合适的GPBP抑制剂可以用于本发明的方法中。在一个实施例中，GPBP抑制剂包括抗-GPBP抗体，比如单克隆抗体或多克隆抗体。如在本发明中使用的，“抗-GPBP抗体”表示结合至所有或单独的GPBP同种型的抗体。在能与任意其他实施例组合的优选实施例中，该抗体是单克隆抗体，比如人源化单克隆抗体。本发明中使用的术语“抗体”旨在包括选择性与本发明的多肽或其片段反应的抗体片段。使用常规技术或使用重组DNA通过基因工程合成可以使抗体片段化，并且用与上述用于完整抗体同样的方法对片段进行用途筛选。例如，F(ab’)2片段通过用胃蛋白酶处理抗体产生。得到的F(ab’)2片段能用木瓜蛋白酶处理以生成Fab片段。单克隆抗体片段的实例包括(i)Fab片段，基本由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2和F(ab’)2片段，包含两个由铰链区的二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，基本由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，基本由单臂抗体(比如scFV、串联二-scFV、二抗体、三抗体等)的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段，(Ward等人，(1989)Nature341:544-546)，其基本由VH结构域组成；以及(vi)一种或多种分离的CDRs或功能性抗体互补位。
在各种进一步的实施例中，GPBP抑制剂包括一种或多种选自由下述组成的组中的抑制剂：
(a)对GPBP有选择性的适体；
(c)对GPBPmRNA有选择性的抑制性核酸；
(d)包括通式X1-SHCIX2-X3(SEQIDNO:1)的氨基酸序列的肽，
其中X1是序列ATTAGILATL(SEQIDNO:2)的0-10位氨基酸；
X2是E或Q；以及
X3是序列LMVKREDSWQ(SEQIDNO:3)的0-10位氨基酸；
(e)包括选自由SHCIE(SEQIDNO:4)、SHCIQ(SEQIDNO:5)、ILATLSHCIELMVKR(SEQIDNO:6)、ILATLSHCIQLMVKR(SEQIDNO:7)和LATLSHCIELMVKR(SEQIDNO:8)组成的组中的氨基酸序列的肽；以及
(f)I-20:
RDEVIGILKAEKMDLALLEAQYGFVTPKKVLEALQRDAFQAKSTPWQEDIYEKPMNELDKVVEKHKESYRRILGQLLVAEKSRRQTILELEEEKRKHKEYMEKSDEFICLLEQECERLKKLIDQEIKSQEEKEQEKEKRVTTLKEELTKLKSFALMVVDEQQRLTAQLTLQRQKIQELTTNAKETHTKLALAEARVQEEEQKATRLEKELQTQTTKFHQDQDTIMAKLTNEDSQNRQLQQKLAALSRQIDELEETNRSLRKAEEE(SEQIDNO:9)。
上述引用的多肽序列是本领域已知的；参考例如US7,326.768、US7,935.492、US6,579.969和US7,147.855。
基于WO2011/054530的教导，本领域技术人员能实施合成本发明公开的其他GPBP抑制剂。
可以通过比如添加聚乙二醇(PEG)或本领域的其他方法使所述肽进一步衍生化，以提供延长的半衰期。所述肽可以包括L-氨基酸、D-氨基酸(其能耐受体内的L-氨基酸特异性蛋白酶)、D-氨基酸和L-氨基酸的组合以及各种表达特定特性的“设计者”氨基酸(“designer”aminoacids)(例如，β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸以及Nα-氨基酸等)。合成氨基酸包括针对赖氨酸的鸟氨酸以及针对亮氨酸或异亮氨酸的正亮氨酸。
另外，所述肽具有肽模拟物键，比如酯键，以制备具有新特性的肽。例如，可以结合还原的肽键，如R1-CH2-NH-R2，生成一肽，其中R1和R2是氨基酸残基或序列。还原的肽键可以以亚单位二肽引入。这种肽具有耐受蛋白酶活性，并且在体内具有延长的半衰期。
术语“肽”是使用其最广泛的意义，指亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的序列。所述亚单位通过肽键连接，但是该肽能够包括其他不需要通过肽键连接到该肽上的部分。例如，如上所述，该肽能够进一步包括含有芳环的非氨基酸分子。
本发明描述的肽可以是化学合成的或重组表达的。如上述公开的，重组表达可以使用本领域标准方法实现。这种表达载体能够包括细菌或病毒表达载体，并且这种宿主细胞可以是原核或真核细胞。
所述肽/抗体抑制剂可以与药学上可接受的载体一起在药物组合物中给药。除了包括多肽/抗体，所述药物组合物可以包括(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)填充剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲剂。
在一些实施例中，所述药物组合物中的缓冲剂是Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、枸橼酸盐缓冲液或乙酸缓冲液。所述药物组合物还可以包括冻干保护剂，例如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在某些实施例中，所述药物组合物包括防腐剂，例如苯扎氯铵、苯乙铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸和它们的各种混合物。在其他实施例中，所述药物组合物包括填充剂，例如甘氨酸。在其他实施例中，所述药物组合物包括表面活性剂，例如，聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85、泊洛沙姆-188、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三月桂酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、失水山梨醇三油酸酯或它们的组合。所述所述药物组合物还可以包括张力调节剂，例如，能使所述制剂与人体血液基本等张或等渗压的化合物。示例性的张力调节剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、蛋氨酸、甘露醇、葡萄糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在其他实施例中，所述药物组合物额外的还包括稳定剂，例如，当与目标蛋白质结合能大体上防止或减少冻干的或液体形式的目标蛋白质的化学和/或物理不稳定性。示例性的稳定剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、蛋氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。
在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如WO2011/054530描述的式(A)的化合物：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R选自N和CR3；R1是氢或C1-C6烷氧基；R2是C1-C6烷基或卤基(C1-C6烷基)；R3，若存在，是C1-C6烷基或卤基(C1-C6烷基)；以及R4是H或C1-C6烷基。
在式(A)的化合物的另一个优选实施例中，R1是氢或甲氧基；R2是甲基、氟甲基或二氟甲基；R3，若存在，是甲基或三氟甲基；以及R4是H或甲基。
在各种进一步优选的实施例中，R1是氢和/或R4是甲基。在进一步优选的实施例中，式(A)的化合物选自由以下物质组成的组：
或它们药学上可接受的盐。在最优选的实施例中，所述化合物是
或其药学上可接受的盐。
在另一个优选的实施例中，所述GPBP抑制剂是式(B)的化合物：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R选自N和CR3；
R3选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C2-C6烷基和(杂芳基)C1-C6烷基组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)或羟基(C1-C6烷基)；以及
R4是H、C1-C6烷基、-C(O)(C1-C20烷基)或-(CH2)1-5-C(O)OH。
在另一个实施例中，式B的GPBP抑制剂是式(C)的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在式(B)或(C)的GPBP抑制剂的一个实施例中，R选自N和CR3；R3选自由氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基组成的组；R1是氢、羟基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)或羟基(C1-C6烷基)；以及R4是H、C1-C6烷基、-C(O)(C1-C20烷基)或-(CH2)1-5-C(O)OH。
在另一个实施例中，所述GPBP抑制剂是一化合物，具有化学式：
或者
在式(B)和(C)的化合物的不同实施例中的任一个中，R2可以是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)或羟基(C1-C6烷基)。例如，R2可以是C1-C6烷基、甲基、卤基(C1-C6烷基)、氟甲基、二氟甲基、羟甲基或羟基(C1-C6烷基)。
在式(B)和(C)的化合物的不同进一步的实施例中的任一个中，R4可以是H、C1-C6烷基、甲基、丙基、-C(O)(C1-C20烷基)或-(CH2)1-5-C(O)OH。
在式(B)和(C)的化合物的不同进一步的实施例中的任一个中，R1可以是氢或甲氧基。
在式(B)和(C)的化合物的不同实施例中的任一个中，R3可以是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、甲基或三氟甲基。
在式(B)和(C)的化合物的进一步的实施例中，R1是氢或C1-C6烷氧基；R2是羟基(C1-C6烷基)；R3，如果存在，是C1-C6烷基或卤基(C1-C6烷基)；以及R4是H或C1-C6烷基。
在式(B)和(C)的化合物的又一个实施例中，R1是氢或甲氧基；R2是羟甲基；R3，如果存在，是甲基或三氟甲基；以及R4是H或甲基。
在另一个实施例中，GPBP抑制剂是式(D)的化合物：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R选自N和CR3；
R3选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C2-C6烷基和(杂芳基)C1-C6烷基组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及
R4是H、C1-C6烷基或(芳基)C1-C6烷基。
在一个实施例中，所述化学式(D)的化合物的化学式为：
在化学式(D)的化合物的任意实施例中的一个实施例中，R1是氢。在化学式(D)的化合物的任意实施例中的另一个实施例中，R是CR3，R3是甲酰基(C1-C6烷基)。在另一个实施例中，R3是-COH。在不同的实施例中，R2可以是-CH＝CH-C(O)OH；-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；或-CH＝CH-C(O)(OEt)。在不同的进一步的实施例中，R4可以是(芳基)C1-C6烷基或–CH2-Ph。在优选的实施例中，所述化学式D的化合物是具有下述化学式的化合物：
，
或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，所述GPBP抑制剂包括化学式(I)的化合物：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R选自N和CR5；
R5选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C2-C6烷基和(杂芳基)C1-C6烷基组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C1-C6烷基或(杂芳基)C1-C6烷基；
R3是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基或(杂芳基)C1-C6烷基；以及
R4是羟基、卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH、-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基或(杂芳基)C1-C6烷基。
在另一个实施例中，所述GPBP抑制剂是化学式(II)的化合物：
在另一个实施例中，所述GPBP抑制剂是化学式(I)或(II)的化合物，其中：
R选自N和CR5；
R5选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)和-(CH2)1-5-C(O)NH2组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)或-(CH2)1-5-C(O)NH2；
R3是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及
R4是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH或-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)。
在另一个实施例中，所述GPBP抑制剂是化学式(I)或(II)的化合物，其中：
R选自N和CR5；
R5是选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基和氨基(C1-C6烷基)组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R3是C1-C6烷基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及
R4是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH或-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)。
在另一个实施例中，GPBP抑制剂是式(II)的化合物，其中R是N。这些化合物能够由式(III)表示：
在又一个实施例中，GPBP抑制剂是式(II)的化合物，其中R是CR5。这些化合物能够由式(IV)表示：
在一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R1是氢、羟基或C1-C6烷氧基。在一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R1是氢。在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)或硫烷基(C1-C6烷基)。在又一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)或甲酰基(C0-C6烷基)。
在又一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)或羟基(C1-C6烷基)。例如，在某些实施例中，R2能够是C1-C6烷基，比如甲基、乙基或异丙基。在其他实施例中，R2能够是卤基(C1-C6烷基)，比如氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。在某些实施例中，R2能够是羟基(C1-C6烷基)。例如，羟基(C1-C6烷基)能够是羟甲基、1-羟乙基或2-羟乙基。
在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R2是C1-C6烷基。在某些实施例中，R2是甲基。在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R3是C1-C6烷基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)。在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R3是-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)或-(CH2)1-5-C(O)NH2。
在又一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R3是-(CH2)1-2-C(O)OH或-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷氧基)。例如，在某些实施例中，R3能够是-(CH2)2-C(O)OH、-(CH2)2-C(O)(OCH3)、-(CH2)2-C(O)(OCH2CH3)或-(CH2)2-C(O)(OC(CH3)3)。在其他实施例中，R3能够是-(CH2)2-C(O)OH或-(CH2)2-C(O)(OCH2CH3)。
在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R3是-(CH2)1-2-C(O)OH。在一个实施例中，R3是-(CH2)2-C(O)OH。在一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R4是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)或苄氧基。在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)-(IV)中的任一个的化合物，其中R4是羟基或C1-C6烷氧基(如甲氧基)。优选地，R4是C1-C6烷氧基。在更优选的实施例中，R4是甲氧基。
在一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)、(II)或(IV)的化合物，其中R5是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基)。在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)、(II)或(IV)的化合物，其中R5是C1-C6烷基，比如甲基。在又一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(I)、(II)或(IV)的化合物，其中R5是卤基(C1-C6烷基)，比如三氟甲基。
在某些实施例中，所述GPBP抑制剂是式(I)、(II)或(IV)中任一个的化合物，其中：
R5是选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基和氨基(C1-C6烷基)组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫基(C1-C6烷基)；
R3是-(CH2)1-2-C(O)OH、-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-2-C(O)NH2、-(CH2)1-2-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-2-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及
R4是羟基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)或苄氧基。
在某些实施例中，所述GPBP抑制剂是式(III)中任一个的化合物，其中：
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫基(C1-C6烷基)；
R3是-(CH2)1-2-C(O)OH、-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-2-C(O)NH2、-(CH2)1-2-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-2-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及
R4是羟基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)或苄氧基。
在某些实施例中，所述GPBP抑制剂是式(I)、(II)或(IV)中任一个的化合物，其中R1是氢；R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)或甲酰基(C1-C6烷基)；R3是-(CH2)1-2-C(O)OH、-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷氧基)或-(CH2)1-2-C(O)NH2；R4是羟基或C1-C6烷氧基；以及R5是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤基(C1-C6烷氧基)。
在某些实施例中，所述GPBP抑制剂是式(III)中任一个的化合物，其中R1是氢；R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)或甲酰基(C1-C6烷基)；R3是-(CH2)1-2-C(O)OH、-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷氧基)或-(CH2)1-2-C(O)NH2；R4是羟基或C1-C6烷氧基；以及R5是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤基(C1-C6烷氧基)。
在某些实施例中，所述GPBP抑制剂是式(I)-(IV)中任一个的化合物，其中：
R，如果存在，选自N和CR5；
R5是选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基和氨基(C1-C6烷基)组成的组；
R1是氢；
R2是C1-C6烷基；
R3是-(CH2)1-2-C(O)OH；以及
R4是C1-C6烷氧基。
在某些实施例中，所述GPBP抑制剂是式(I)-(IV)中任一个的化合物，其中：
R，如果存在，选自N和CR5；
R5是选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基和氨基(C1-C6烷基)组成的组；
R1是氢；
R2是甲基；
R3是-(CH2)2-C(O)OH；以及
R4是甲氧基；
在一个实施例中，所述GPBP抑制剂是式(V)的化合物：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R选自N和CR5；
R5选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C1-C6烷基和(杂芳基)C1-C6烷基组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基或(杂芳基)C1-C6烷基；以及
R6是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-OS(O)2CF3、(芳基)C1-C6烷基或(杂芳基)C1-C6烷基。
在一个实施例中，所述式(V)的化合物为化学式(VI)：
在另一个实施例中，所述GPBP抑制剂是式(V)或(VI)的化合物，其中：
R选自N和CR5；
R5选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)和-(CH2)1-5-C(O)NH2组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；
R6是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)或-OS(O)2CF3。
在另一个实施例中，所述GPBP抑制剂是式(V)或(VI)的化合物，其中：
R选自N和CR5；
R5是选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基和氨基(C1-C6烷基)组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及
R6是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)或-OS(O)2CF3。
在一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)中的任一个的化合物，其中R1是氢。
在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)中的任一个的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)。
在又一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)中的任一个的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、甲酰基(C0-C6烷基)、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)。
在又一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)中的任一个的化合物，其中R2能够是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)。例如，在某些实施例中，R2能够是C1-C6烷基，比如甲基、乙基或异丙基。在其他实施例中，R2能够是卤基(C1-C6烷基)，比如氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。在某些实施例中，R2能够是羟基(C1-C6烷基)。例如，羟基(C1-C6烷基)能够是羟甲基、1-羟乙基或2-羟乙基。
在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)中的任一个的化合物，其中R2是C1-C6烷基。在某些实施例中，R2是甲基。
在一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)中的任一个的化合物，其中R6是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基或-OS(O)2CF3。
在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)中的任一个的化合物，其中R6是羟基或C1-C6烷氧基(如甲氧基)。在一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)的化合物，其中R5是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基)。在另一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)的化合物，其中R5是C1-C6烷基，比如甲基。在又一个实施例中，GPBP抑制剂是如上所述参考式(V)-(VI)的化合物，其中R5是卤基(C1-C6烷基)，比如三氟甲基。
在某些实施例中，所述GPBP抑制剂是式(V)-(VI)中任一个的化合物，其中：
R5是选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基和氨基(C1-C6烷基)组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫基(C1-C6烷基)或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及
R6是羟基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)或-OS(O)2CF3。
在某些实施例中，所述GPBP抑制剂是式(V)-(VI)中任一个的化合物，其中R1是氢；R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、甲酰基(C0-C6烷基)或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；R6是羟基、C1-C6烷氧基或-OS(O)2CF3；以及R5是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基或卤基(C1-C6烷氧基)。
基于WO2011/054530的教导，本领域技术人员能实施合成本发明公开的其他GPBP抑制剂。
在一个优选的实施例中，GPBP抑制剂包括3-[4”-甲氧基-3,2’-二甲基-(1,1’；4’,1”)三联苯-2”-基]丙酸；3-[2’-甲基-4”-甲氧基-3-(三氟甲基)-(1,1’；4’,1”)三联苯-2”-基]丙酸；或它们的组合物，或它们药学上可接受的盐；或由3-[4”-甲氧基-3,2’-二甲基-(1,1’；4’,1”)三联苯-2”-基]丙酸；3-[2’-甲基-4”-甲氧基-3-(三氟甲基)-(1,1’；4’,1”)三联苯-2”-基]丙酸；或它们的组合物，或它们药学上可接受的盐组成。
所述GBPB抑制剂化合物包括其药学上可接受的盐、酯、酰胺和前药，包括但不限于本发明化学物的羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺和前药，它们在合理的医疗判断范围内适合用于接触患者的组织，而不会带来不适当的毒性、刺激、过敏反应等等，与其合理的利益/风险比相适应，且对于它们的预期用途是有效的，并且如果可能的话，还包括本发明化合物的两性离子形式。术语“盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在最终分离和纯化化合物的过程中原位制备得到，或可以通过单独使纯化的游离碱形式的化合物与合适的有机或无机酸反应并且分离由此形成的盐来制备得到。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、重硫酸盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐，等等。它们可以包括基于碱金属和碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。(参考例如BergeS.M.等人，“PharmaceuticalSalts,”1977.J.Pharm.Sci.,66:1-19，其通过引用并入本发明中。)
药学上可接受的无毒酯类抑制剂实例包括C1-C6烷基酯，其中所述烷基是直链或支链的、取代或未取代的C5-C7环烷基酯以及芳烷基酯，比如苯甲基和三苯甲基。优选的是C1-C4烷基酯，比如甲基、乙基、2,2,2-三氯乙基和四丁基。本发明的化合物的酯类可以根据常规方法制备。
药学上可接受的无毒酰胺类抑制剂实例包括衍生自氨、C1-C6烷基伯胺和C1-C6二烷基仲胺的酰胺类，其中所述烷基为直链或支链。在仲胺的情况下，所述胺还可以是含有一个氮原子的5或6元杂环的形式。优选衍生自氨、C1-C3烷基伯胺和C1-C2二烷基仲胺的酰胺。本发明的化合物的酰胺可以根据常规方法制备。
术语“前药”指的是在体内能迅速转化生成上述配方的母体化合物的化合物，例如，通过血液中的水解作用。T.Higuchi和V.Stella在A.C.S.SymposiumSeries的第14卷中的“Pro-drugsasNovelDeliverySystems”，以及1987年EdwardB.Roche编辑，AmericanPharmaceuticalAssociation和Pergamon出版的“BioreversibleCarriersinDrugDesign”中提供了深入的讨论，以上全文以引用的方式并入本文中。
本发明中使用的术语“烯基”指含2-10个碳原子(除非另有说明)和含至少1个碳-碳双键的直链或支链烃基。烯基的代表性实例包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基、2-庚烯基、2-甲基-1-庚烯基、3-癸烯基和3,7-二甲基辛烯-2,6-二烯基。
本发明中使用的术语“烷氧基”指如本发明中定义的通过氧原子连接到母体分子部分上的烷基。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。
除非另有说明，本发明中使用的术语“烷基”指含1-10个碳原子的直链或支链烃基。烷基的代表性实例包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。当“烷基”是在另外两个其他部分之间的连接基团时，那么它也可以是直链或支链的；例如包括但不限于-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CHC(CH3)-、-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
术语“亚烷基(alkylene)”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基，即-(CH2)n-，其中n是正整数，优选地为1至6、1至4、1至3、1至2或2至3。取代亚烷基链是一个或多个亚甲基氢原子被取代基取代的聚亚甲基。合适的取代基包括下面描述的取代的脂族基团中的那些取代基。亚烷基链还可以在一个或多个位置被脂族基团或取代的脂族基团取代。
本发明中使用的术语“炔基”指含2-10个碳原子和含至少1个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基的代表性实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、3-丁炔基、2-戊炔基和1-丁炔基。
本发明中使用的术语“芳基”指含至少一个苯环的苯环(即单环芳基)系统或双环系统或在双环芳环系统中仅含一个碳原子的双环芳环。双环芳基可以是薁基、萘基或稠和到单环环烷基、单环环烯基或单环杂芳基上的苯基。双环芳基通过包含在双环系统的苯基部分中的任意碳原子或任意带萘基环或薁基环的碳原子连接到母分子部分上。双环芳基的稠和单环环烷基或单环杂芳基部任选地被一个或两个桥氧基和/或硫杂基取代。双环芳基的代表性实例包括但不限于，薁基、萘基、二茚-1-基、二茚-2-基、二茚-3-基、二茚-4-基、2,3-二氢吲4-基、2,3-二氢吲唑-5-基、2,3-二氢吲唑-6-基、2,3-二氢吲唑-7-基、茚-1-基、茚-2-基、茚-3-基、茚-4-基、二氢萘-2-基、二氢萘-3-基、二氢萘-4-基、二氢萘-1-基、5,6,7,8-四氢萘-1-基、5,6,7,8-四氢萘-2-基、2,3-二氢苯并呋喃-4-基、2,3-二氢苯并呋喃-5-基、2,3-二氢苯并呋喃-6-基、2,3-二氢苯并呋喃-7-基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基、2H-吡喃-2-酮-5-基、2H-吡喃-2-酮-6-基、2H-吡喃-2-酮-7-基、2H-吡喃-2-酮-8-基、异吲哚啉-1,3-二酮-4-基、异吲哚啉-1,3-二酮-5-基、茚-1-酮-4-基、茚-1-酮-5-基、茚-1-酮-6-基、茚-1-酮-7-基、2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烷-5-基、2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烷-6-基、2H-苯并[b][1,4]恶嗪3(4H)-酮-5-基、2H-苯并[b][1、4]恶嗪3(4H)-酮-6-基、2H-苯并[b][1,4]恶嗪3(4H)-酮-7-基、2H-苯并[b][1,4]恶嗪3(4H)-酮-8-基、苯并[d]恶嗪-2(3H)-酮-5-基、苯并[d]恶嗪-2(3H)-酮-6-基、苯并[d]恶嗪-2(3H)-酮-7-基、苯并[d]恶嗪-2(3H)-酮-8-基、喹唑啉-4(3H)-酮-5-基、喹唑啉-4(3H)-酮-6-基、喹唑啉-4(3H)-酮-7-基、喹唑啉-4(3H)-酮-8-基、喹喔啉-2(1H)-酮-5-基、喹喔啉-2(1H)-酮--6-基、喹喔啉-2(1H)-酮-7-基、喹喔啉-2(1H)-酮-8-基、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮-4-基、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮-5-基、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮-6-基、和、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮-7-基在一些实施例中，双环芳基是(i)萘基或(ii)稠和了5元或6元单环环烷基、5元或6元单元环烯基或者5元或6元单环杂环基的苯环，其中该稠和的环烷基、环烯基和杂环基任选地被一个或两个基团取代，该一个或两个基团独立地是桥氧基或硫杂基。
本发明中使用的术语“卤基”或“卤素”指-Cl、-Br、-I或-F。
术语“卤代烷基”、“卤代烯基”和“卤代烷氧基”是指根据具体情况被一个或多个卤原子取代的烷基、烯基或烷氧基。
本发明中使用的“杂芳基”指含至少一个杂芳环的单环杂芳基环系统或双环系统。该单环杂芳基可以是5元或6元环。该5元环由两个双键和一个、两个、三个或四个氮原子以及任选地一个氧原子或硫原子组成。该6元环由三个双键和一个、两个、三个或四个氮原子组成。该5元或6元杂芳基通过包含在杂芳基中的任意碳原子或任意氮原子连接到母分子部分上。单环杂芳基的代表性实例包括但不限于呋喃基、咪唑基、异唑基、异噻唑基、二唑基、唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、吡咯基、四唑基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三嗪基和三唑基。双环杂芳基由稠和了苯基、单环环烷基、单环环烯基、单环杂环基或单环杂芳基的单环杂芳基组成。双环杂芳基的稠和环烷基或杂环基部任选地被一个或或两个基团取代，该一个或两个基团独立地是桥氧基或硫杂基。当双环杂芳基包含稠和的环烷基、环烯基或杂环基时，则该双环杂芳基通过包含在双环系统的单环杂芳基部中的任意碳原子或氮原子连接到母分子部分上。当双环杂芳基是与苯环稠和的单环杂芳基时，则该双环杂芳基通过包含在双环系统中的任意碳原子或氮原子连接到母分子部分上。双环杂芳基的代表性实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并二唑基、苯并氧杂噻二唑基(benzoxathiadiazolyl)、苯并噻唑基、噌啉基、5,6-二氢喹啉-2-基、5,6-二氢异喹啉-1-基、呋喃并吡啶基、吲唑基、吲哚基、异喹啉基、萘啶基、喹啉基、嘌呤基、5,6,7,8-四氢喹啉-2-基、5,6,7,8-四氢喹啉-3-基、5,6,7,8-四氢喹啉-4-基、5,6,7,8-四氢异喹啉-1-基、噻吩并吡啶、4,5,6,7-四氢苯并[C][1,2,5]二唑基和6,7-二氢苯并[C][1,2,5]二唑-4(5H)-酮基。在某些实施例中，稠和的双环杂芳基是稠和了苯环、5元或6元单环环烷基、5元或6元单元环烯基、5元或6元单环杂环基或5元或6元单环杂芳基的5元或6元单环杂芳基，其中该稠和的环烷基、环烯基和杂环基任选地被一个或两个基团取代，该一个或两个基团独立地是桥氧基或硫杂基。
所述GPBP抑制剂通常与一种或多种适合指定给药途径的辅剂联合。该抑制剂可以与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯类、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯树胶、明胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后压片或包囊以便于给药。作为替换，该抑制剂可以溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲剂。其它辅剂和给药模式是药学领域公知的。载体或稀释剂可以包括本领域中公知的延时物质，比如单独或与蜡混合的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或与蜡，或其他材料。
该GPBP抑制剂可以作为单一活性药剂给药，或它们可以与一种或多种其他用于实施本发明方法的化合物联合使用。当作为组合物联合给药时，治疗药剂可配制成在相同时间或不同时间施用的单独的组合物，或者该治疗药剂可作为单一组合物施用。
该GPBP抑制剂可以制成固体形式(包括颗粒剂、粉剂或栓剂)或液体形式(例如溶液、悬浮液或乳液)。
该GPBP抑制剂可以在各种溶液中使用，并且可以进行常规的制药操作，如灭菌和/或可以包含常规的辅剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等等。
该GPBP抑制剂可以以含有常规无毒药学上可接受的载体、辅剂和媒介物的剂量单位制剂通过吸入、喷雾或直肠进行口服、局部、肠胃外给药。本文所用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌肉内或鞘内注射，或输液技术和类似方法。含GPBP抑制剂的药物组合物可以是适于口服应用的形式，例如，作为片剂、糖锭剂(troches)、锭剂(lozenges)、水性或油性悬浮液、可分散的粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊或糖浆或酏剂。
用于口服使用的组合物可根据本领域用于制备药物组合物的任意已知方法，而这类组合物可包含一种或多种选自由包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂组成的组中的试剂，以提供精致和适口的制剂。片剂可包括掺合有无毒性药学上可接受的赋形剂的活性成分，所述赋形剂适合用于片剂的制造。例如，这些赋形剂可以是，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂或崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是不包衣的，或者它们可以采用已知技术进行包衣。在一些情况下，这种包衣可以采用已知技术制造，以延迟在胃肠道中的分解和吸收，从而在更长的时间段内提供持续的作用。例如，可以采用延时材料，如单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯。
口服使用的剂型也可以硬的明胶胶囊的形式存在，其中的活性成分与惰性固体填充剂(如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或以软的明胶胶囊的形式存在，其中的活性成分与水或油介质(如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水性悬悬浮液可包括掺合了适于水性悬液制造的赋形剂的活性材料。这类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂(如卵磷脂)或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(如十七烷基乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐(hexitolanhydrides)的偏酯的缩合产物(如聚乙烯山梨醇酐单油酸酯)。所述水性悬浮液还包含一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
油性悬浮液通过将抑制剂悬浮在植物油(如落花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或在矿物油(如液体石蜡)中。所述油性悬浮液可包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂和调味剂以提供适口的口服制剂。这些组合物可通过加入一抗氧化剂(如抗坏血酸)加以保存。
适用于通过加入水制备水性悬浮液液的可分散性粉剂或颗粒剂使得能将GPBP抑制剂与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂进行掺合。合适的分散剂或湿润剂或悬浮剂通过上面所提到的来举例。例如，还可以存在额外的赋形剂、甜味剂、调味剂和着色剂。
GPBP抑制剂还可以以水包油乳剂的形式给药。油相可以是植物油或矿物油或它们的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶(例如阿拉伯胶或黄蓍胶)、天然存在的磷脂(例如大豆、卵磷脂)或衍生自脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯和偏酯(例如单油酸山梨醇酐酯)，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。所述乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可与甜味剂(如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖)一起按配方配制。这种剂型还可包括一缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。所述GPBP抑制剂组合物可以是无菌可注射的含水或含油的悬浮液形式。这种悬浮液可根据已知技术采用上述合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂按配方配制。所述无菌可注射的制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或悬浮液，例如，在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介物和溶剂之中，可采用的是水、林格氏溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，可采用常规的无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为了此目的，可采用任何无味的固定油，包括合成的单-或双甘酯。此外，可在血管注射剂的制备中使用脂肪酸，如油酸。
含GPBP抑制剂的组合物也可以以栓剂形式给药，例如用于药物的直肠给药。这些组合物可通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，其中，所述非刺激性赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，并且因此在直肠中融化以释放药物。这类材料包括可可油和聚乙二醇。
本发明的含GPBP抑制剂的组合物可以在无菌介质中肠胃外给药。根据使用的媒介物和浓度，药物可以悬浮或溶解在媒介物中。有利地是，辅剂(比如局部麻醉剂)、防腐剂和缓冲剂可以溶解在媒介物中。
可以使用大约0.01mg/kg体重/天-大约50mg/kg体重/天的剂量水平，优选地在0.1mg/kg体重/天-大约50mg/kg体重/天之间的剂量水平治疗上述疾病。可与载体材料联合制得单个剂型的GPBP抑制剂的量将根据治疗的主体以及给药的具体方式而变化。单位剂量形式通常包含大约1mg至大约500mg的抑制剂。
本发明使用的术语“药学上可接受的”指的是那些在可靠的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触，没有过度的毒性、刺激、变态反应或其他难处理的问题或并发症，具有合理的益处/风险比例或另外已经被UnitedStatesFoodandDrugAdministration(美国食品药品监督管理局)批准接受用于人或家畜的化合物、材料、组合物和/或剂型。
在本发明任意治疗方面的方法的一个实施例中，GPBP抑制剂可以与一种或多种用于治疗T2D和糖尿病并发症的其他治疗剂共同给药，包括但不限于胰岛素、二甲双胍、磺酰脲类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮、胰高血糖素样肽-1和它们的类似物、二肽基肽-4抑制剂和血管紧张素转换酶抑制剂(ACEIs)。
在另一方面，本发明提供用于诊断前驱糖尿病状态的方法，包括：
(a)确定来自有患上前驱糖尿病状态风险的受试者的样本的GPBP用量；和
(b)将样本的GPBP用量与对照样本的GPBP用量相比；
其中与对照样本相比，样本的GPBP用量增加表示受试者存在前驱糖尿病状态。
如下面的实例中所示的，与野生型(WT)相比，血糖量正常的Irs2-/-小鼠(T2D模型)的GPBP循环水平显著增加。但是，在糖尿病Irs2-/-小鼠中观察到GPBP循环水平显著降低。因此，GPBP是前驱糖尿病状态的生物标记物，能在临床上用于胰岛素抵抗以及发生T2D倾向性的早期检测。
在本发明中使用的，“前驱糖尿病状态(pre-diabeticstate)”是满足了糖尿病诊断标准中的一些而不是全部诊断标准的状态。因此，前驱糖尿病状态可以包括：1)具有空腹葡萄糖耐量受损，其是一种β-细胞对口服葡萄糖负荷(oralglucosechallenge)(OGT)的响应是有缺陷的病症，或者2)具有一直升高的空腹葡萄糖(IFG)，其是一种空腹血糖高于被认为是正常的水平但并未高到足以被分类为糖尿病的病症。前驱糖尿病状态与胰岛素抵抗和增加的心血管病变风险有关。具有前驱糖尿病状态的个体其有相对较大的发生T2D的风险。在进一步的方面，本发明提供用于诊断发生T2D的倾向的方法，包括：
(a)确定来自有发生T2D风险的受试者的样本的GPBP用量；和
(b)将样本的GPBP用量与对照样本的GPBP用量相比；
其中与对照样本相比，样本的GPBP用量增加与受试者有发生T2D的倾向性有相关性。
该“增加”是与对照(比如来自正常受试者的对照样本，或在对照群中先前确定为“正常”水平GPBP的对照样本)相比任意量的GPBP增加，例如，5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％或更大。在一个实施例中，作为标准曲线参考的GPBP正常值是在血浆中小于10ng/ml。在不同的实施例中，正常GPBP范围是在血浆中为～1ng/ml至10ng/ml之间。因此，在一个实施例中，受试者经鉴定其血浆中含有超过10ng/ml的GPBP时采用根据本发明的方法治疗。确定循环GPBP量的方法是已知的(参见WO2010/009856和US7935492)。
本发明中使用的“有发生T2D的倾向性”表示与一般人群相比，上述受试者发生T2D的风险增加。
在这些实施例中，来自受试者的任何合适的样本可以如本发明公开的使用，包括但不限于血清样本。
有患前驱糖尿病状态风险和/或有发生T2D风险的受试者包括但不限于那些带有一种或多种危险因素的受试者，所述危险因素选自，包括但不限于，肥胖、久坐不动的生活方式、较差的饮食习惯(例如：脂肪过多、纤维素不足、太多简单碳水化合物等)、前驱糖尿病状态和/或T2D家族史、年龄50或更大、高血压、高胆固醇以及妊娠期糖尿病史。
在一个实施例中，检测包括：
(a)将来自受试者的血浆样本与GPBP结合分子接触，该GPBP结合分子在促进GPBP-结合分子选择性结合到GPBP的条件下结合到GPBP上；
(b)移除未结合的血浆和/或GPBP-结合分子；和
(c)检测血浆样本中GPBP-结合分子和GPBP之间的复合物形成，其中复合物形成提供了样本中GPBP的测量。
“GPBP结合分子”是选择性结合到GPBP上的肽或核酸分子，与一种或多种其他生物分子、结构、细胞、组织等不同。这种GPBP结合分子的示例性实施例包括但不限于抗体、适体或底物。本发明中使用的“GPBP底物”是结合到GPBP或保留了GPBP结合活性的GPBP片段上的GPBP生物活性靶。这种GPBP底物包括但不限于I-20(SEQIDNO:9)、GPBP-相互作用蛋白(GIPs)(SEQIDNOS:14-18)、髓鞘碱性蛋白(MBP)及其衍生物(SEQIDNOS:19-22)、朊病毒蛋白(PrP)(SEQIDNO:23)、α3NC1(SEQIDNO:24)和阿尔茨海默氏病β肽(Aβ1-42)(SEQIDNO:25)。证明这些底物的GPBP结合的示例性参考可以从美国专利No.6,579,969、7,147,855和7,326,768中找到，它们整体通过引用并入本申请中。
“血浆样本”表示血浆，一种血液的液体成分，其通过，例如，对全血进行离心去除血细胞制得。本发明中使用的“血浆样本”还包括去除了凝血因子的血清样本。
血浆样本可以来自任何合适的受试者，优选来自有患T2D或前期糖尿病风险的哺乳动物，包括但不限于人、狗、猫、马或家畜(牛、羊等)。在最优选的实施例中，所述血浆样本在人类受试者获得。
所述抗体可以是任意选择性GPBP抗体，如上所述可以是多克隆、单克隆或人源化单克隆抗体，不过优选地是单克隆抗体。
合适的促进血浆样本中GPBP-结合分子(比如抗体、适体或底物)结合到GPBP上的条件可以基于本发明教导以及下面提供的实例由本领域技术人员确定。例如，抗体-抗原结合通常取决于疏水相互作用(所谓的疏水键)；因此，能够采用高盐浓度(比如以摩尔范围)减少非特异性结合并增加特异性抗原-抗体结合。任选地，进一步的步骤可以包括提供选择性和特异性，包括但不限于一个或多个洗涤步骤，以去除未结合GPBP和/或GPBP-结合分子或者去除未结合或弱结合的血清蛋白；非特异性结合的抑制剂，以减少高浓度血清蛋白的结合，已知的含GPBP的对照样本和/或已知的未结合到GPBP的阴性对照，和/或已知的不具有GPBP的纳入血浆样本(例如：删除GPBP(ex:deletedforGPBP))。
该方法能通过标准技术测试血浆样本中GPBP的存在，所述标准技术包括但不限于ELISA、免疫荧光法和色谱法(例如，侧向流分析，其中抗体固定在表面上，对血浆蛋白进行标记并使其在适合将抗体结合到血浆中的GPBP上条件下流过所述表面)。在一个实施例中，使用耦合到流式细胞仪(BectonDickinsontechnology(BD技术公司))上的官能珠；该技术是测量生物液体或细胞/组织提取物中的蛋白水平的新兴方法。具体来说，由荧光基质制成的珠子涂覆一种或多种GPBP-特异性抗体，与血浆样本混合，进一步与标记了藻红蛋白的检测GPBP抗体一起孵育。最后，采用流式细胞仪程序分析珠子，根据基质荧光发射以及通过藻红蛋白发射(phycoerythrinemission)测量的分析物水平选择珠子。采用细胞仪能同时检测及鉴别多达30种不同类型的珠子。在另一个实施例中，使用耦合到流式细胞仪或基于CCD成像的技术(复用平台(multiplexingplatform))的微球体(xMAPtechnology(xMAP技术))。具体来说，由聚苯乙烯制成、内部染上红色和红外荧光团的微球体涂覆一种或多种GPBP-特异性抗体，与血浆样本混合，进一步与标记了生物素的检测GPBP抗体一起孵育，最后，复合物采用由藻红蛋白标记的链霉素抗生物素蛋白进行检测。接着，采用复用平台分析珠子，根据荧光发射以及通过藻红蛋白发射测量的分析物水平选择珠子。采用复用平台能同时检测及鉴别多达500种不同类型的微球体。由于涂覆了GPBP-特异性抗体的特异性官能珠或微球体能与涂覆了用于其他分析物(例如自体抗体)的结合肽的不同的珠子混合并且同时进行测量，这些方法将高灵敏度和高性能与多功能性结合到了一起。各种分析物的测量能提高GPBP确定的可能性。在一个实施例中，所述技术仅能确定GPBP存在或不存在。作为替换，所述技术可以是定量的，提供样本中关于GPBP相对含量的信息。对于定量目的，优选的是ELISAs。
可以采用标准检测技术完成免疫复合体形成的检测。例如，采用标记抗体或第二抗体实现对免疫复合体的检测。这些方法(包括选自标记)都是本领域普通技术人员已知的。作为替换，抗体能偶联到可检测物质上。术语“偶联”用于表示可检测物质是物理连接到抗体上。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉素抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的实例包括鲁米诺。合适放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
该方法包括将检测的测试血浆样本中的GPBP水平与对照进行对比，该对照可以是比如来自已知的具有“正常”GPBP水平的血浆样本的对照，或者先前测得的来自获得血浆的受试者的血浆中的正常GPBP值。在不同的实施例中，利用重组GPBP值或参考值，所述对照提供了标准曲线。将血浆样本中的GPBP含量与对照进行对比，相对于对照，血浆样本中GPBP增加表示存在前驱糖尿病状态和/或有发生T2D的倾向。
在一个实施例中，该方法包括从人血浆中检测自然的循环GPBP。在另一个实施例中，GPBP结合分子包括抗体，比如单克隆抗体或多克隆抗体。
实例
GPBP形成了大型的多聚聚集体，其特异性的激酶活性远远高于更低分子量的聚集体(WO2000/50607)。5残基长的基序260SHCIE264(SEQIDNO:4)是关键的稳定天然GPBP多聚体组件(stabilizingnativeGPBPmultimerassembly)的区域的核心。代表260SHCIE264(SEQIDNO:4)和侧翼区(LATLSHCIELMVKR)(SEQIDNO:8)的分离的肽(Q2)有效抑制了GPBP激酶活性(WO2004/070025)。有机化合物模拟物Q2已经表现出能抑制GPBP激酶活性(WO2011/054530和美国专利No:8,586.776)。抗肿瘤剂阿霉素也已经表现出能抑制GPBP激酶活性(WO2014/006020)。抗GPBP单克隆抗体也已经表现出能抑制GPBP激酶活性(WO2012/113785)。
T2D与胰岛素抵抗和β-细胞衰竭有关。胰岛素和IGF-I通过胰岛素受体底物(IRS)蛋白的磷酸化和活化发挥它们的生物活性(Burks和White，2001)。删除小鼠的Irs2产生了外周胰岛素抵抗以及减少的β-细胞量，从而导致糖尿病(Withers等人，1998)。雄性Irs2-无效小鼠在8周大左右发生高血糖症，大部分在16周大以前死于糖尿病并发症。缺少IRS2还在雌性小鼠中引起中度肥胖症(Burks等人，2000)。糖尿病表型表现出性别二态现象，比如雌性糖尿病发展更慢，很多存活长达6个月大(Garcia-Barrado，2001)。
实验方法
图1.升高的细胞外葡萄糖水平诱导了GPBP表达。C2C12细胞在补充有2％马血清和抗菌素的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium))中分化5天。培养物用PBS(磷酸盐缓冲盐水)冲洗并在含有指定浓度的葡萄糖的补充有2％马血清的DMEM中另外孵育24小时。细胞用PBS冲洗并在50mMTris-HClpH7.0、150mMNaCl、1％TritonX-100、1mMPMSF(苯甲基磺酰氟)、10mg/mL亮肽酶素中在4℃裂解30min。如其他地方所述的，通过离心(16000xg，5min，4℃)澄清裂解物，确定上清液的总蛋白浓度(Bio-Rad)，并且近似量(50μg)的每种提取物利用抗-GPBP单克隆抗体(mAb)N27和抗-微管蛋白(Sigma)进行蛋白质印迹分析。
图2.在增加的细胞外葡萄糖浓度下，GPBP激酶抑制增强葡萄糖消耗。A,将A549细胞在含有指定浓度的葡萄糖以及10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中培养24h。然后将细胞在25mMTris-HClpH7.5、150mMNaCl、1％TritonX-100、0.1％SDS、1mMPMSF、10g/mL亮肽酶素、20mMNaF在4℃裂解30min。通过在16,000xg离心5min(4℃)澄清裂解物并确定上清液的总蛋白浓度(Bio-Rad)。近似量(50μg)的每种裂解物采用蛋白质印迹分析，使用分别购自CellSignalingTechnology、FibrostatinSL和Sigma的初次抗体以及购自Promega的HRP偶联的抗兔IgG和抗鼠IgG第二抗体，以检测在Ser318(PSer318AS160)、GPBP和微管蛋白处磷酸化的AS160蛋白。采用AmershamECLPrimeWesternBlotting检测试剂(AmershamECLPrimeWesternBlottingDetectionReagent)(GE医疗生命科学(GEHealthcareLifesciences)进行显影，并采用ImageQuantLAS4000Mini装置(GE医疗生命科学)进行图像采集。B，将A549细胞在DMEM中培养14h，该DMEM是含有指定浓度的T12并补充了10％胎牛血清和青霉素/链霉素的F-12(315mg葡萄糖/dL)。孵育后，如同A中对细胞进行裂解，并且同样地对上清液中的蛋白质浓度进行测定。利用GlucocardG+计(ArkrayFactory,Inc.)在孵育期的开始和结束时确定基质中的葡萄糖浓度，并利用相应裂解物的蛋白质浓度计算细胞的葡萄糖摄取，用于归一化目的。利用阿霉素(0.5μM)(数据未示出)能得到类似结果，阿霉素是一种不同的GPBP激酶抑制剂(WO/2014/006020)。C，将A549细胞在DMEM中孵育20h，该DMEM是不含(对照)或含有T12(50μM)并添加了10％胎牛血清和青霉素/链霉素的F-12(315mg葡萄糖/dL)，并如同A中对细胞进行裂解。如同A中的，近似量(50μg)的每种裂解物采用蛋白质印迹分析，以检测在Ser318(PSer318AS160)或微管蛋白处磷酸化的AS160蛋白。
图3.在生理学细胞外葡萄糖浓度下，GPBP激酶抑制同样增强了葡萄糖消耗。C2C12小鼠成肌细胞在补充有2％马血清和青霉素/链霉素的DMEM中10天分化成肌管，然后在添加了0.25％马血清、初始葡萄糖浓度115mg/dL、不含或含有T12(50μM))的DMEM中在指示的时间内进行孵育。利用GlucocardG+计(ArkrayFactory,Inc.)确定基质中的葡萄糖浓度。示出的是平均值±SEM(n＝2)。根据t-学生试验分析(t-Studenttestanalysis)，所示各组之间的差异是统计学上显著的。*P＝0.0152；***P＝0.0005。
图4.Irs2-/-小鼠显示出增加的胶原IV表达。收集8-12周大的雄性的野生型(WT，n＝9)小鼠、血糖量正常的Irs2-/-(Irs2-/-，n＝9)小鼠以及糖尿病Irs2-/-(n＝9)小鼠的肾脏，包埋在石蜡中，利用来自EMDMillipore的抗-IV型胶原抗体进行切片的免疫组织化学分析。当空腹血清葡萄糖水平大于120mg/dL时，认为小鼠患有糖尿病。在所示合成照片中，胶原IV表达水平用黑色范围(未表达)和白色范围(表达)表示。示出的是代表图像。初始放大：x400。
图5.Irs2-/-小鼠显示出增加的COL4A3BP表达.收集8-12周大的雄性的野生型(WT，n＝9)小鼠、血糖量正常的Irs2-/-(Irs2-/-，n＝9)小鼠以及糖尿病Irs2-/-(n＝9)小鼠的肾脏，包埋在石蜡中，利用来自FibrostatinSL的抗-GPBPmAbN26进行切片的免疫组织化学分析。当空腹血清葡萄糖水平大于120mg/dL时，认为小鼠患有糖尿病。在所示合成照片中，GPBP表达水平用黑色范围(未表达)和白色范围(表达)表示。示出的是代表图像。初始放大：x400。
图6.血糖量正常的Irs2-缺陷小鼠的循环GPBP水平得到提高。收集野生型(WT，n＝12)小鼠、血糖量正常的Irs2-/-(Irs2-/-，n＝12)小鼠以及糖尿病Irs2-/-(n＝19)小鼠(8-12周大)在被杀死时的血样，并使用基本上如在WO2010/009856中描述的以mAbN26作为捕获抗体、以mAbN27作为检测抗体的原型夹心ELISA测量循环GPBP水平。当空腹血清葡萄糖水平大于120mg/dL时，认为小鼠患有糖尿病。*P<0.05，***P<0.001。
图7.对10周大小鼠的血糖抗GPBP治疗的效果。不同组的小鼠一周一次接受腹膜注射的1μg/g体重的抗-GPBPmAbN26或小鼠IgG(Sigma)，并利用血糖测试仪每周监测空腹血糖(尾静脉)。雄性经处理的野生型(WT+mAbN26，n＝2)，野生型对照(WT+ContIgG，n＝2)，经治疗的Irs2-/-(KO+mAb26，n＝2)，Irs2-/-对照(KO+ContIgG，n＝2)。雌性经治疗的野生型(n＝2)，野生型对照(n＝2)，经治疗的Irs2-/-(n＝3)，Irs2-/-对照(n＝2)。
结果与讨论
在分化的成肌细胞中，与Akt增加的活化有关的GPBP表达(如Gpbp-/-)的上调揭示了细胞质GPBP下调了Akt活化(Revert-Ros等人，2011)并且使细胞在响应胰岛素时葡萄糖吸收能力降低(胰岛素抵抗)。同样地，在分化的成肌细胞中增加的细胞外葡萄糖诱导GPBP表达(图1)表明在响应增加的细胞外葡萄糖浓度(高血糖症)时GPBP细胞内水平增加也许是细胞在尝试阻止升高的细胞内葡萄糖浓度的不利影响。因此，当将A549培养暴露于增加的细胞外葡萄糖浓度时，我们观察到逐渐增加的GPBP表达，这与Akt-底物160(AS160)(诱导葡萄糖吸收的标志)较低的磷酸化状态有关。此外，GPBP激酶抑制剂化合物T12(3-[4”-甲氧基-3,2'-二甲基-(1,1'；4',1”)三联苯-2”-yl]丙酸(WO2011/054530和美国专利No:8,586.776)的增加的浓度逐渐提高了在代表T2D高血糖症条件下培养的A549细胞中葡萄糖的吸收(图2B)。所有这些表明由化合物T12形成的细胞质GPBP激酶抑制通过Akt抑制解除以及接下来的AS160的磷酸化诱导葡萄糖吸收。因此，通过蛋白质印迹法分析相应的细胞培养溶解产物揭示了化合物T12诱导了AS160的磷酸化(图2C)，其由此被推测促进了葡萄糖转运蛋白GLUT1/GLUT4向血浆膜中的转移，同时促进了葡萄糖吸收(Sano等人，2003)。总体上说，证据表明与高血糖症有关的升高的GPBP细胞质激酶活性介导了至少部分外周胰岛素抵抗。当用阿霉素(0.5μM)(数据未示出)(一种其他结构的不相关的GPBP激酶抑制剂)处理细胞培养物时，我们得到了类似的结论。(WO2014/006020)。此外，评价了在生理葡萄糖浓度中的GPBP激酶活性的作用，结果显示化合物T12还以浓度依赖方式减少了细胞外葡萄糖水平(图3)，表明在血糖量正常条件下和糖尿病条件下，细胞质GPBP激酶活性都下调了胰岛素依赖信号。
为了研究GPBP在T2D中的作用，我们首先分析了Irs2-/-小鼠肾中的GPBP和胶原IV的表达。糖尿病性肾病的特征在于肾小球中肾小球系膜基质的累积和基底膜的增厚以及肾小管肥大。这些异常与肾脏中细胞外基质蛋白(比如胶原IV)的过度产生有关。与此一致的是，临床研究已经报道糖尿病患者的泌尿系统胶原IV分泌是递增的。因此，高水平的泌尿系统胶原IV已经被提出用作发生和发展早期糖尿病性肾病的标志。在评价Irs2-/-小鼠模型的糖尿病时，我们采用了与人相同的血糖值标准；空腹水平>120mg/dL被认为患有糖尿病。我们观察到患有严重高血糖症的小鼠常常出现蛋白尿(>100mg/dL)，表明肾功能退化与高血糖水平有关。因此，我们使用免疫组织化学来评价获得自野生型(WT)Irs2+/+小鼠、血糖量正常的Irs2-/-小鼠和糖尿病Irs2-/-小鼠的肾脏中的胶原IV表达。我们观察到与WT对照肾相比，两组Irs2-/-小鼠的胶原IV表达增加，但是血糖量正常的Irs2-/-小鼠的表达高于糖尿病Irs2-/-小鼠的(图4)。鉴于当过度表达时GPBP的作用是调节胶原IV超分子结构以及触发肾小球硬化症(Revert等人，2007)，我们测试了对照和Irs2-/-小鼠肾脏部分中的GPBP表达。有趣的是，GPBP表达与胶原IV表达类似，因此与WT对照相比，GPBP在Irs2-/-小鼠肾脏中过度表达，但GPBP在血糖量正常的Irs2-/-小鼠中的表达高于糖尿病Irs2-/-小鼠中的表达(图5)。因此，这些发现表明在Irs2-/-小鼠中与前驱糖尿病状态有关的促炎细胞因子可以上调GPBP表达，其然后在显性糖尿病(炎性阶段)小鼠中降至略高的基础水平。这些结果与GPBP作为前驱促炎循环因子(pre-pro-inflammatorycirculatingfactor)(WO2012/113785)一致，该因子也对Irs2-/-小鼠模型的T2D起了作用。
为进一步评估这种可能性，我们使用了先前开发的ELISA检测循环GPBP(WO2010/009856和美国专利No:7,935.492)以测量获得自对照小鼠和两组Irs2-/-小鼠(血糖量正常的和糖尿病的)的血清样本的GPBP水平。与免疫染色结果一致，与WT小鼠相比，在血糖量正常的Irs2-/-小鼠中的GPBP循环水平显著增加(图6)。但是，在糖尿病Irs2-/-小鼠中，我们观察到GPBP水平显著降低。这些结果表明在前驱糖尿病状态中发生的GPBP上调与促炎细胞因子近似相等。因此，鉴于购得了灵敏的ELISA用于检测血清中的GPBP，我们对模Irs2-/-型中的观察表明GPBP是前驱糖尿病状态的潜在的新型生物标记物，能够临床用于胰岛素抵抗和糖尿病的早起检测。
删除Irs2使小鼠患上糖尿病是由于外周胰岛素抵抗以及减少的胰岛β-细胞量(Withers等人，1998)。但是，这种糖尿病表型表现出性别二态现象；雄性Irs2-/-小鼠常常在12周大死于糖尿病并发症，而雌性Irs2-/-小鼠糖尿病发展更温和，很多存活长达6个月大(Garcia-Barrado，2001)。另外，雌性Irs2-/-小鼠表现出高瘦素血症(hyperleptinemia)，同时发生中度肥胖症，与雄性Irs2-/-小鼠相反，雄性Irs2-/-小鼠常常比对照小鼠更瘦(Burks等人，2000)。
我们观察到的GPBP和胶原IV在血糖量正常的Irs2-/-小鼠中的上调表明这种激酶可能参与了从前驱糖尿病状态到糖尿病的发展。若实际上GPBP在该病理学中发挥了作用，可以推测GPBP抑制延迟或阻止了前驱糖尿病模型中糖尿病的发生。为验证这种可能性，采用N26(GPBP-特异性抗体，其能抑制GPBP结合到胶原IV的3NC1结构域上)治疗血糖量正常的Irs2-/-小鼠(WO2012/113785)。然后监测葡萄糖水平，作为代谢状态的指示。鉴于该糖尿病模型中存在性别二态现象，我们评价了雄性和雌性小鼠的抗-GPBP。在该研究中，当小鼠10周大时开始治疗，通过腹膜内注射一周一次以1μg/g体重施用N26。采用抗-GPBP治疗的WT雌性和雄性小鼠的空腹葡萄糖水平与那些用对照IgG治疗的类似，证明抗-GPBP治疗没有改变基础葡萄糖水平(图7)。尽管在治疗开始后一周，该治疗能够将雄性Irs2-/-小鼠的血糖维持在正常水平，在第二周高血糖症快速发生，并且不管小鼠是否接受了N26的注射都达到了相似的值；并且因此所有雄性Irs2-/-小鼠在研究开始的一个月内都死于糖尿病并发症。相反的是，采用抗-GPBP疗法治疗的雌性Irs2-/-小鼠存活长达7个月，具有正常的血糖水平，而用对照IgG治疗的雌性Irs2-/-小鼠逐渐发生高血糖症。
总的来说，数据支持前驱-促炎细胞外GPBP(pre-pro-inflammatoryextracellularGPBP)(WO2012/113785)介导了Irs2-/-模型中T2D的发病机理。这同样支持了增加的GPBP循环水平是接下来发生的会介导高血糖症和T2D的炎症的诊断特征的想法。因此，早期使用GPBP阻断抗体(前驱糖尿病)延迟了雄性高血糖症的发病并且预防了雌性高血糖症。因此，我们揭示了细胞外GPBP将是一种新型的用于检测前驱糖尿病阶段的潜在生物标志物，同时也是一种新型的用于治疗T2D的潜在治疗靶。此外，抗-GPBP抗体也成为阻碍即将发生T2D的患者的T2D检测但同时又能治疗这些患者的生物药剂的一把双刃剑。
尤其令人感兴趣的是观察到在不同的试验模型中(即肌细胞、肺腺癌A549细胞系和Irs2-/-小鼠)单独施用三种不相关的GPBP向下调节剂(即T12、阿霉素和N26)降低了细胞外葡萄糖浓度。该证据同样支持细胞外葡萄糖的降低至少部分是通过细胞质蛋白AS160的磷酸化导致葡萄糖吸收增强而完成的。这一观察结果进一步提供了证据证明细胞外GPBP调节细胞内GPBP活性介导Irs2-/-小鼠模型的T2D发病机理。
参考文献
BurksDJ，FontdeMoraJ，SchubertM，WithersDJ，MyersMJ，ToweryH，AltamuroSA，FlintCA，WhiteMF.2000.IRS-2pathwaysintegratefemalereproductionandenergyhomeostasis.Nature407：377-82.
BurksDJ，WhiteMF.2001.TheroleofIRSproteinsinbetacellphysiology.Diabetes456：120-125.
CawoodTJ，BashirM，BradyJ，MurrayB，MurrayPT，O′SheaD.2010.UrinarycollagenIVandπGST：potentialbiomarkersfordetectinglocalizedkidneyinjuryindiabetes--apilotstudy.Am.J.Nephrol.32：219-25.
Garcia-BarradoMJ，Iglesias-OsmaMC，Moreno-ViedmaV，PastorMansillaMF，GonzalezSS，CarreteroJ，MoratinosJ，BurksDJ.2011.DifferentialSensitivityToAdrenergicStimulationUnderliesTheSexualDimorphismInTheDevelopmentOfDiabetesCausedByIrs-2Deficiency.BiochemPharmacol.81：279-88.
RevertF，MerinoR，MonteagudoC，MaciasJ，PeydróA，AlcácerJ，MuniesaP，MarquinaR，BlancoM，IglesiasM，Revert-RosF，MerinoJ，SausJ.2007.IncreasedGoodpastureantigen-bindingproteinexpressioninducestypeIVcollagendisorganizationanddepositofimmunoglobulinAinglomerularbasementmembrane.Am.J.Pathol.171：1419-30.
Revert-RosF，López-PascualE，Granero-MoltóF，MacíasJ，BreyerR，ZentR，HudsonBG，SaadeddinA，RevertF，BlascoR，NavarroC，BurksD，SausJ.Goodpastureantigen-bindingprotein(GPBP)directsmyofibrilformation：identificationofintracellulardownstreameffector130-kDaGPBP-interactingprotein(GIP130).JBiolChem.286：35030-43.
SanoH，KaneS，SanoE，CP，AsaraJM，LaneWS，GarnerCW，LienhardGE.2003.Insulin-stimulatedphosphorylationofaRabGTPase-activatingproteinregulatesGLUT4translocation.JBiolChem.278：14599-602.
WithersDJ，GutierrezJS，ToweryH，BurksDJ，RenJM，PrevisS，ZhangY，BernalD，PonsS，ShulmanGI，Bonner-WeirS，WhiteMF.1998.DisruptionofIRS-2causestype2diabetesinmice.Nature.391：900-4.

Claims (19)

1.用于治疗2型糖尿病的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的古德帕斯丘抗原结合蛋白(GPBP)抑制剂，以治疗2型糖尿病。
2.用于限制2型糖尿病发生的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，以限制2型糖尿病的发生。
3.用于治疗前驱糖尿病状态的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，以治疗前驱糖尿病状态。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者与对照相比具有增加的循环GPBP。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者患有前驱糖尿病状态。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPBP抑制剂包括抗-GPBP单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗-GPBP单克隆抗体是人源化单克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPBP抑制剂包括下式的化合物：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R选自N和CR5；
R5选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C2-C6烷基和(杂芳基)C1-C6烷基组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C1-C6烷基或(杂芳基)C1-C6烷基；
R3是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基或(杂芳基)C1-C6烷基；以及
R4是羟基、卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH、-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基或(杂芳基)C1-C6烷基。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPBP抑制剂包括具有下式的化合物：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R选自N和CR5；
R5选自由氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)和-(CH2)1-5-C(O)NH2组成的组；
R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)或(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)；
R2是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)或-(CH2)1-5-C(O)NH2；
R3是C1-C6烷基、卤基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、硫烷基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫烷基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及
R4是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤基(C1-C6烷氧基)、苄氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH或-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPBP抑制剂包括3-[4”-甲氧基-3,2’-二甲基-(1,1’；4’,1”)三联苯-2”-基]丙酸；3-[2’-甲基-4”-甲氧基-3-(三氟甲基)-(1,1’；4’,1”)三联苯-2”-基]丙酸；或它们的组合物，或它们药学上可接受的盐。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPBP抑制剂包括(3-[4”-甲氧基-3,2’-二甲基-(1,1’；4’,1”)三联苯-2”-基]丙酸，或其药学上可接受的盐。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPBP抑制剂包括一种或多种选自由下述组成的组中的抑制剂：
(a)对GPBP有选择性的抗体或适体；
(c)对GPBPmRNA有选择性的抑制性核酸；
(d)包括通式X1-SHCIX2-X3(SEQIDNO:1)的氨基酸序列的肽，
其中X1是序列ATTAGILATL(SEQIDNO:2)的0-10位氨基酸；
X2是E或Q；以及
X3是序列LMVKREDSWQ(SEQIDNO:3)的0-10位氨基酸；
(e)包括选自由SHCIE(SEQIDNO:4)、SHCIQ(SEQIDNO:5)、ILATLSHCIELMVKR(SEQIDNO:6)、ILATLSHCIQLMVKR(SEQIDNO:7)和LATLSHCIELMVKR(SEQIDNO:8)组成的组中的氨基酸序列的肽；以及
(f)I-20:
RDEVIGILKAEKMDLALLEAQYGFVTPKKVLEALQRDAFQAKSTPWQEDIYEKPMNELDKVVEKHKESYRRILGQLLVAEKSRRQTILELEEEKRKHKEYMEKSDEFICLLEQECERLKKLIDQEIKSQEEKEQEKEKRVTTLKEELTKLKSFALMVVDEQQRLTAQLTLQRQKIQELTTNAKETHTKLALAEARVQEEEQKATRLEKELQTQTTKFHQDQDTIMAKLTNEDSQNRQLQQKLAALSRQIDELEETNRSLRKAEEE(SEQIDNO:9)。
13.用于诊断前驱糖尿病状态的方法，包括：
(a)确定来自有患上前驱糖尿病状态风险的受试者的样本的GPBP用量；和
(b)将样本的GPBP用量与对照样本的GPBP用量相比；
其中与对照样本相比，样本的GPBP用量增加表示受试者存在前驱糖尿病状态。
14.用于诊断发生2型糖尿病的倾向的方法，包括：
(a)确定来自有发生2型糖尿病风险的受试者的样本的GPBP用量；和
(b)将样本的GPBP用量与对照样本的GPBP用量相比；
其中与对照样本相比，样本的GPBP用量增加表示受试者有发生2型糖尿病的倾向性。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述检测包括：
(a)将来自受治疗者的血浆样本与GPBP结合分子接触，该GPBP结合分子在促进GPBP结合分子选择性结合到GPBP的条件下结合到GPBP上；
(b)移除未结合的血浆和/或GPBP结合分子；和
(c)检测血浆样本中GPBP结合分子和GPBP之间的复合物形成，其中复合物形成提供了样本中GPBP的测量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括从人血浆中检测自然的循环GPBP。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述GPBP结合分子包括抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述GPBP是GPBP-1。
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