CN105713930A - 过氧化合物和季铵化合物的协同性组合和使用方法 - Google Patents

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Abstract

使用(a)过氧化合物(PC)和(b)季铵化合物(QAC)控制发酵过程中污染性微生物的生长的方法。所述方法包括将PC和QAC加入发酵过程的一个或多个步骤中。在该方法中，可将PC和QAC加入发酵液体培养基的一种或多种组分，其包括接种物、可发酵糖和工艺用水。

Description

过氧化合物和季铵化合物的协同性组合和使用方法
本申请是申请日为2011年12月20日，申请号为201180061173.9，发明名称为“使用包含过氧化物和季铵化合物的协同性制剂降低乙醇发酵中的污染性微生物的生长”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及过氧化合物和季铵化合物的协同性组合和使用方法，尤其是在发酵过程中。
背景技术
在过去十年中，乙醇作为运输燃料的应用显著提高。美国的乙醇生产从2000年的约64亿升提高至2009年超过370亿升。乙醇工厂的数量从2000年的54个提高至2009年的170个。在拉丁美洲和欧洲已经发生了类似的生产和工厂建设的增多。在2007年，美国国会颁布了能源独立和安全法案(EnergyIndependenceandSecurityAct)(H.R.6)，其设定了到2022年1360亿升乙醇的可再生燃料标准。如果要达到这一标准，则乙醇工业将继续成长。
目前工业乙醇(例如燃料)和食用乙醇均通过发酵过程从农业(天然)原料中大规模制备，其中通过接种酵母将糖转化成乙醇和二氧化碳。许多原料可用于提供发酵糖，包括潜在的任何淀粉或纤维素材料，它们包括几乎所有植物，因为任何淀粉或纤维素可为糖前体。一些尤其适用于制备燃料乙醇的常见原料包括玉米、蜀黍、高粱、甘蔗、糖用甜菜和糖蜜。
用于乙醇生产的原料是天然产品，因此，在所述原料中可能在天然情况下存在广泛多种的微生物，诸如细菌、真菌和酵母。商业发酵过程的条件并非完全无菌，因此这些“污染性微生物”将在工艺中存在。在商业乙醇生产中，最成问题的微生物是产乳酸细菌和产乙酸细菌。这类细菌从多种来源进入该工艺，所述来源包括原材料、设备、工艺用水、空气和接种酵母，以及其它。通过随进料物质(原材料、水、空气、酵母)引入或由于利于细菌生长的条件导致的天然扩增，这类细菌的浓度可在工艺环境中提高。用于酵母生产的最佳空气环境也极度有利于这些细菌的生长。细菌产生的有机酸抑制了酵母的生长并因此降低了乙醇生产率。细菌还消耗糖和其它营养物质，所述物质意在由酵母利用来产生所期望的产物，这导致了整个工艺经济效益更低。
大量的发酵过程使用抗生素作为抗微生物组合物。这类应用已经变得不受欢迎，这是因为抗生素耐药细菌的可疑发展以及抗生素残余物在发酵副产物中的积累所致。抗生素耐药细菌是人类健康的重大问题。
乙醇生产的副产物包括在对乙醇产物蒸馏后所收集的固体。这类固体包括含可溶物的干酒糟(DDGS)和含可溶物的湿酒糟(DWGS)。很多国家和地区正在考虑能限制或消除抗生素对乙醇生产的使用的管理措施。DDGS和DWGS作为动物饲料产品进行销售。
对抗微生物处理的需求不断增长，这不仅是由于乙醇产量的增长，还由于乙醇生产设施尺度的扩张。虽然数年之前生产150-200百万升/年(MMly)的工厂被认为是大型设施，但是现在380MMly(或更多)的设施是工业标准。在分批补料工艺中，单个发酵批次的体积已有显著提高。为容纳这一增加的容积，在最大的乙醇生产设施中进入发酵系统的原料(一旦其制备用于进入发酵，通常称为“醪”)的流速已从约2000-3000升/分钟提高至4500-6000升/分钟。
WO2006/138271公开了控制水体系中的或基底上的微生物生长的方法，所述方法包括使所述体系或基底与抗微生物剂接触，所述抗微生物剂包括(a)乳过氧化物酶，(b)过氧化物源，(c)卤离子或硫氰酸盐，其中卤离子不是氯，以及(d)铵源。乳过氧化物酶在水体系中以0.01至1000ppm的范围存在；过氧化物源以0.01至1000ppm的范围提供过氧化氢；卤离子在水体系中具有0.1至10,000ppm的浓度，并且铵源在水体系中具有0至10,000ppm的浓度。
WO00/57730公开了组合物以及使用组合物作为用于食品表面的抗微生物处理的方法，该组合物包含(a)季铵化合物，(b)氧化剂，(c)卤离子来源，以及任选地(d)食品级的酸源，其用于将pH降至9或更低。卤原子占铵化合物的0.1至30重量份，占氧化剂的0.1至40重量份，并且占酸源的0至80重量份。组合物用于在稀释水组合物(包含0.1至400克/升组合物)中降低食品表面的微生物计数。
美国专利5,320,805公开了使用化学组合物作为清洁剂、卫生剂、消毒剂、杀孢子剂和杀真菌剂的方法，所述组合物包含约10重量％至约90重量％的碱性水溶性盐(其具有结晶的过氧化氢)，以及30重量％的带正电的相转移剂，其选自鏻盐、锍盐、季铵，所述组合物形成水溶的和脂溶的相转移离子对。
WO2009/0108365公开了生产基于发酵的产物的方法，其包括在有机生物杀灭剂和季铵化合物以足以降低或控制培养基中的细菌群体的量存在的情况下，使用酵母发酵包含糖的培养基。
尽管一些方法是已知的，但是对用于解决发酵工业中含碳水化合物的原料和发酵过程中污染性微生物的改善方法存在着需求。改善的方法应优选地是无抗生素并且并不产生在发酵副产物中积累的残余物或不产生抗生素耐药细菌。该方法应在发酵工业中面对的广泛pH范围内和条件下有效。所述方法还应使用在用前具有合理储存寿命的处理。对于改善当今较大体积发酵过程的经济性也存在着需要。本发明满足这些需要。
发明内容
本发明提供了方法，其使用(a)过氧化合物(PC)和(b)季铵化合物(QAC)控制发酵过程中污染性微生物的生长。所述方法包括将PC和QAC加入发酵过程的一个或多个步骤，其中发酵过程包括(i)提供接种物、可发酵糖和工艺用水；(ii)将接种物、可发酵糖和工艺用水单独或以任何组合加入发酵容器以提供发酵液体培养基；(iii)在使接种物将可发酵糖转化成为乙醇的温度下在发酵容器中使该接种物与可发酵糖接触。任选地，将营养物质加入接种物、可发酵糖和工艺用水的一种或多种中。还可将营养物质直接加入发酵容器。可向接种物、可发酵糖或工艺用水中(在这些物质各自引入发酵容器之前)加入PC和QAC。作为另外一种选择，PC和QAC可直接加入发酵容器。
可向该工艺中分别加入过氧化合物和季铵化合物。当分别加入组分时，该组分可同时加入或以任何顺序先后加入。即，可在相同时候加入组分(同时)，或者可在加入其它组分之前加入一种组分(先后)。作为另外一种选择，所述方法还可包括将组分(a)和(b)在加入发酵过程之前进行接触。
本发明提供了控制发酵液体培养基中的反应物(在下文定义)和发酵过程的产物中的污染性微生物的生长的方法。所述方法还控制了发酵系统的组件表面上的污染性微生物的生长。所述方法由或基本上由以下步骤组成，或包含以下步骤：向反应物或发酵液体培养基中或向发酵系统的表面上或容器中加入过氧化合物和季铵化合物。
本发明还提供了组分的组合，其可用于原位清洗(CIP)应用以处理发酵过程中使用的设备表面。“CIP”在本文是指可清洗表面而无需拆解设备。
所述方法包括加入有效量的包含PC和QAC组分的组合，以控制污染性微生物的生长，而对用于发酵过程的接种物无有害影响。有效量根据组分的组合使用的方式而变化，但是可由本领域的技术人员根据本文的公开内容确定。通常以在发酵液体培养基中提供10ppm至1000ppm(以发酵液体培养基的总重量计)的PC浓度的量加入PC。通常以在发酵液体培养基中提供10至1000ppm(以发酵液体培养基的总重量计)的QAC浓度的量加入QAC。
本发明的方法还提供了在碳水化合物原料中控制至少一种污染性微生物生长的方法，其中提供可发酵糖的步骤包括提供碳水化合物原料并将所述原料接触过氧化合物和季铵化合物，其中所述原料的碳水化合物含量为至少1％并且优选地为1重量％至70重量％(以原料总重量计)，并且其中PC和QAC以有效量加入。通常以10ppm至1000ppm(以原料的总重量计)的PC量加入PC，并且通常以50ppm至500ppm(以原料的总重量计)的过氧化合物量加入QC。
具体实施方式
本发明提供了用于控制污染性微生物的生长的方法，所述方法包括、基本由以下组成、或由以下组成：向发酵过程的一个或多个步骤中加入包含过氧化合物(PC)和季铵化合物(QAC)的组分的组合。以控制污染性微生物的生长而不抑制接种酵母将可发酵糖转化成为乙醇和二氧化碳的量将PC和QAC的协同性组合加入所述方法。通常加入PC和QAC以提供发酵液体培养基中10至1000ppm(重量/重量，以发酵液体培养基的总重量计)的PC浓度以及提供发酵液体培养基中10至1000ppm(重量/重量，以发酵液体培养基的总重量计)的QAC浓度。
本发明还在提供可发酵糖的步骤中提供了在碳水化合物原料中控制至少一种污染性微生物生长的方法，所述方法包含以下、基本由以下组成或由以下组成：提供碳水化合物原料以及向所述原料中加入过氧化合物和季铵化合物。
定义
以下的术语具有如下所提供用于本文的定义。
含水介质是指基本上是水的介质，例如大于80％，优选地大于90％，更优选地大于95％的含水量。含水介质可为大于99％的水。工艺用水是含水介质的一个例子。
含水介质是指基本上是水的介质，例如大于80％，优选地大于90％，更优选地大于95％的含水量。含水介质可为大于99％的水。工艺用水是含水介质的一个例子。
碳水化合物原料是指用于制备或直接用作为可发酵糖的原料。即，碳水化合物原料是可发酵糖或包含可发酵糖的组合物或可转化成为可发酵糖的组合物。
碳水化合物原料按重量计可包含至多100％的碳水化合物。碳水化合物原料一般包含1％至70％的碳水化合物(基于原料的总重量计)，优选地2％至40％，其作为含水介质中的溶液或悬浮液。原料中的碳水化合物量和组成可根据期望的最终用途而变化。例如玉米浆，它是得自湿磨方法的碳水化合物溶液，其可包含16.5％的碳水化合物。在湿磨方法中，将玉米浸渍或浸泡，然后分成多个组分。玉米浆是已将玉米长期浸泡后获得的含水液体，在此期间从玉米固体中提取用于发酵的可溶解组分，其溶于浸泡水中。来自湿磨方法的淀粉组分按重量计可包含至多40％的碳水化合物。
碳水化合物原料可包含其它组分，它们一般行使溶液和/或悬浮液助剂的功能。例如碳水化合物原料可包含酶、表面活性剂、分散剂、消泡组合物、矿物质、痕量元素以及它们中两种或更多种的组合。这些组分以及作为助剂的其它组分是本领域的技术人员熟知的。
应用于本文微生物生长的控制是指降低和/或防止靶向的不利污染性微生物生长。如本文使用，控制微生物的生长还包括将微生物群体维持于所期望的水平、将微生物群体降低至所期望的水平(部分地降低或甚至降低至不可检出的限度，例如，零群体)和/或抑制微生物的生长。
有效量在本文是指组合加入发酵过程中的PC和QAC各自的量，以控制污染性微生物的生长，而对用于发酵过程的接种物无有害影响。可发酵 糖是乙醇发酵过程中使用的反应物以及接种物的常用营养物质。可发酵糖是糖(例如葡萄糖)或淀粉，其通过酵母的作用转化成为乙醇和二氧化碳。公式(1)说明了葡萄糖(C6H12O6)的工艺。
C6H12O6→2C2H5OH+2CO2(1)
如本文所用，可发酵糖是基本来自于任何植物来源的碳水化合物，包括糖、淀粉和/或纤维素，其通常以糖、淀粉和/或纤维素的水溶液或水悬浮液的形式提供。淀粉和/或纤维素可通过本领域中已知的方法(例如，使用酶)转化成为用于本发明的方法的可发酵糖。可发酵糖可来自淀粉来源或一种或多种纤维素物质来源，诸如玉米、高粱、小麦、木屑、蜀黍、大麦、粟、甘蔗、糖用甜菜、糖蜜、乳清、马铃薯、小麦秸秆、玉米秸秆、柳枝稷、藻类、海藻和/或其它生物来源。可发酵糖还可来自于果汁(例如葡萄、苹果)。可发酵糖或者可来自非传统的原料，诸如木材废料、蔗渣、纸材废料、和市政固体垃圾。将这些来源转化成可发酵糖的方法是本领域技术人员已知的。引用参见J.Y.Zhu等人，BioresourceTechnology(2010)第101卷(13)，第4992-5002页；以及A.L.Demain,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，(2009)，第36卷(3)，第319-332页。
可发酵糖可方便地通过使用干磨或湿磨方法而来自玉米。在干磨方法中，将玉米研磨成为粗粉并且不经分离成为其组成性组分(基本上包含纤维、淀粉、油和蛋白质)便进行加工。在湿磨方法中，将玉米浸泡或浸没入水中并随后通过机械方式分离成为其组成性组分。将来自湿磨方法或来自干磨方法的粗粉(玉米面粉)的玉米淀粉组分与水和酶混合并进行烹制以增溶淀粉。
玉米淀粉是多糖，即由单个葡萄糖单元制成的聚合物。通过酶(α-淀粉酶)将玉米淀粉转化成为较小(较短)的多糖，即，糊精。使用葡糖淀粉酶将较小的多糖转化成为葡萄糖(单糖)，由此而形成了可发酵糖。
作为玉米的替代品，可发酵糖可来自于糖蜜。糖蜜可获自包括甘蔗或糖用甜菜在内的多种来源，例如，作为制造结晶糖的工艺的副产物。糖蜜通常以糖浆而获得，在准备进行发酵中可向其中加入其它成分。这些其它成分包括甘蔗汁、甜菜汁、水和维生素或其它营养物质。是否加入一种或多种其它成分以及所加入的量应在糖蜜衍生的可发酵糖中有所变化。
作为玉米的替代品，可发酵糖可来自于甘蔗汁。甘蔗汁是使用水从甘蔗中提取的汁液。从甘蔗中对汁液的提取还通过物理压碎、水中扩散或本领域的技术人员一般熟知的其它方法实施。参见，例如H.V.Amorim等人在“TheAlcoholTextbook”(2009),NottinghamUniversityPress,Nottingham的第39-46页；以及EPAFoodandAgriculturalIndustriesHandbook,第9.10.1.1章(甘蔗)和第0.10.1.2章(糖用甜菜)，其可获自http://www.epa.gov/ttnchie1/ap42/ch09/(访问于2011年12月18日)。甘蔗汁可不经进一步加工而使用，并作为可发酵糖直接加入发酵容器中。
出于本文的目的，用于产生碳水化合物原料和可发酵糖的步骤是发酵过程的步骤。即，所述发酵过程包含产生碳水化合物原料的步骤和将淀粉和/或纤维素转化成为可发酵糖的步骤。
在发酵过程中，包括糖和淀粉在内的碳水化合物通常以约5至约40％(重量/体积)的浓度存在于发酵液体培养基中，优选地以约10至35％(重量/体积)的范围，其基于发酵液体培养基的总体积计。
如本文所用，发酵液体培养基是指在发酵过程期间在已经加入全部反应物后的发酵容器内容物，并且其通常包含可发酵糖、接种物、任选的营养物质和工艺用水。
如本文所用，发酵过程是指包括将接种物(诸如酵母)在工艺用水中接触可发酵糖和任选的营养物质以产生乙醇的工艺。发酵过程可以是分批的或连续的。此外，出于本文的目的，发酵还包括用于制备或预处理一种或多种反应物的步骤，诸如通过天然来源制备可发酵糖的工艺和酵母增殖。
接触步骤在使接种物将糖转化成为乙醇和二氧化碳的温度下实施。
当通过干磨方法使用玉米作为原料生产乙醇时，发酵过程可包括一个或多个步骤：对玉米制浆、液化、糖化、制备接种酵母(增殖)、发酵醪(接种物作用于糖以生产乙醇的实际步骤)、分离并回收所得乙醇以及任选地循环利用接种酵母废料。发酵过程可包括一个或多个步骤：制备接种酵母、通过稀释、巴氏消毒或其它方法制备汁液、发酵、分离并回收乙醇以及任选地循环利用酵母。本领域的技术人员应当了解，这些工序可根据原料有效性和工厂设计与工厂位置而变。
如本文所用，发酵系统包括组件(设备)，诸如容器和管道，发酵过程的一种或多种反应物和产物在其内和通过其存留或流通。这类设备具有可存在细菌和其它污染性(不期望的)微生物的表面。发酵系统的一部分是发酵容器—在其中进行使可发酵糖与接种物反应以生产乙醇的发酵步骤的容器。
当通过干磨方法生产乙醇时，发酵系统可包括一种或多种容器，诸如浆液槽、液化槽、糖化槽、酵母增殖槽和发酵容器。这类容器及其用途对于本领域的技术人员是已知的。参见，例如R.J.Bothast和M.A.Schlicher,AppliedMicrobiologyandBiotechnology(2005)，第67卷(1)，第19-25页。当通过湿磨方法生产乙醇时，发酵系统可包括一种或多种容器，诸如浸槽、分离槽、酵母增殖槽和发酵容器。本领域的技术人员应当了解，这些工序可根据原料有效性和工厂设计与工厂位置而变。
接种物是有目的地加入工艺来将原料(输入)转化成为所期望的产物(输出)的任何微生物。出于本文的目的，接种物是能够将可发酵糖转化成为乙醇的微生物。酵母是用于乙醇发酵的常用接种物。酵母是能够在有氧(具有氧气)或无氧(缺乏氧气)环境中生存并且生长的微生物。接种物还可选自能够将可发酵糖转化成为乙醇的真菌和藻类。例如，可使用产乙醇细菌作为接种物通过纤维素生产乙醇。当根据本文所述方法使用时，接种物细菌并非如产乳酸和产乙酸细菌那样受到稳定的二氧化氯和过氧化合物的不利影响。
以下的讨论针对接种物是酵母的工艺。
出于本文的目的，接种酵母是针对反应系统中的特定转化而特意选择的酵母。例如，针对在酵母增殖中产生额外酵母(诸如用作为面包酵母)而选择接种酵母；针对用于产生酶的特定营养物质的代谢而选择接种酵母。在这一具体的应用中，针对发酵可发酵糖来产生所期望质量和提高量的乙醇而选择接种酵母。接种酵母一般是由于它们完全发酵有效糖的能力、对高水平渗透胁迫、高温和高浓度乙醇的耐受而被选择的。酵母常用于乙醇发酵。酵母是能够在有氧(具有氧气)或无氧(缺乏氧气)环境中生存并且生长的微生物。用于本发明的方法的合适接种酵母包括但不限于啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae(S.cerevisiae))、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum(S.uvarum))、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe(S.pombe))和克鲁维酵母属(Kluyveromycessp)。
可将接种酵母作为接种物引入发酵容器，所述接种物是接种酵母的活化形式。即，在将接种酵母引入发酵容器前，通过在增殖槽中将酵母起始培养物接触营养组合物来增殖酵母(增加其量)以产生接种酵母。营养组合物包含一种或多种可发酵糖、酶、额外的营养物质和水以生长或活化酵母。增殖槽是与发酵容器相分离的容器并且在适当的温度条件下运行(例如68-104℉，20-40℃)。各个接种物应具有增殖的优选温度。例如，30-32℃(86-90℉)的温度可能特别适合于增殖。虽然据了解酵母增殖可在发酵过程中于发酵容器内进行，但是酵母在增殖槽中的活化提供了高度活性的接种酵母。由此而将高度活性的酵母引入发酵容器。这类酵母增殖技术对于本领域的技术人员是已知的。参见，例如E.Bellissimi等人，ProcessBiochemistry(2005)，第40章(6)，第2205-2213页；以及M.Knauf等人，SugarIndustry(2006)，第131章，第753-758页。
对于连续发酵过程，通常没有单独的酵母增殖槽。在连续工艺中酵母可进行或可不进行循环利用。当无可用的循环利用时，酵母在称为主发酵的阶段连续生长并生产乙醇。当有可用的循环利用时，诸如在使用糖蜜或甘蔗汁作为可发酵糖的原料时的常见情况，通过与其它发酵组分相分离来循环利用酵母(通常使用离心)并且其通常在分离的槽(一般称为酵母循环利用槽)内使用酸来调理酵母细胞用于新的发酵循环。作为另外一种选择，可从发酵液体培养基中分离酵母，随后进行干燥并且固化为副产物。此类步骤是本领域技术人员熟知的。参见，例如E.A.N.Fernandes等人，JournalofRadioanalyticalandNuclearChemistry(1998)第234章(1-2)，第113-119页；以及L.C.Basso等人，FEMSYeastRes.(2008)vol.，第1155-1163页。
相对于细菌，酵母具有中等至缓慢的发酵速度。为补偿其代谢率，在大规模工业乙醇生产中可能需要大量的酵母一般以通常约1×105至1×107细胞/克发酵液体培养基的量将接种酵母加入发酵过程。本领域的技术人员应当了解，这一量可根据所使用的发酵过程而变。
醪在本文用于指包含可发酵糖的组合物。醪包括在水中的混合谷物或其它可发酵碳水化合物的混合物，其在从可发酵糖与水的混合至任何调至和糖化之前直至完成发酵的任何阶段用于乙醇生产，如Jacques,K.A.,Lyons,T.P.,Kelsall,D.R,“TheAlcoholTextbook”,2003,423-424,NottinghamUniversityPress,UK中所定义。
微生物在本发明的上下文中分两种，即期望的和污染性的(非期望的)微生物。期望的微生物具有消耗营养物质以将可发酵糖转化成为乙醇的能力。期望的微生物包括接种物，诸如酵母，啤酒糖酵母，其用于葡萄糖发酵成为乙醇和二氧化碳。其它期望的微生物在其它生物精炼方法中使用。期望的微生物通常不存在于碳水化合物原料中。当期望的微生物存在于碳水化合物原料中时，所存在的存活细胞的数量通常过低而不能有利地与所述原料中还存在的其它微生物进行竞争。
污染性微生物是与接种物进行竞争并且消耗可发酵糖和营养物质的微生物。污染性微生物产生非期望的产物并且/或者以远低于接种物所产生的速度来产生乙醇。
污染性微生物包括细菌、真菌、野生的或污染的酵母以及能够代谢碳水化合物原料组分以维持微生物生存的其它微生物。污染性微生物污染碳水化合物原料、消耗原料以作为支持其生长食物来源、进行增殖并且因此而耗尽了原料。
污染性微生物如酵母污染菌常存在于工业和食用乙醇生产中，并且能够引起严重的污染事件，导致发酵过程中的乙醇产量降低。这些不良微生物可通过可发酵糖(原料)、工艺用水、空气、操作人员和大量的其它来源而引入所述工艺。
污染性微生物如细菌(包括乳酸菌(乳杆菌属的菌种))利用葡萄糖原料生成产物如乙酸和乳酸，它们不仅消耗原料并因此阻止原料转化成期望的产物，而且不利地影响生物精制过程中期望的微生物。例如，乙酸和乳酸不利地影响啤酒糖酵母将葡萄糖转化成乙醇的速率。其它污染性细菌包括片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)和梭菌属(Clostridium)。
营养物质是指支持接种酵母或其它接种物微生物的生长和/或存活的元素，例如营养物质可以是碳、氮、氧、硫、磷、镁和多种微量元素(诸如金属)的来源。碳源可以是醇，诸如甲醇，或是烃类，诸如辛烷。碳源还可以是可发酵糖。氮源可以是尿素、氨、铵盐或硝酸盐。诸如硫酸镁这样的盐可提供镁和硫。磷可以作为钠盐或钾盐来供应，而氧可通过将空气引入所述工艺来供应。可使用其它形式的气态氧，诸如纯氧或氧/氮混合物。其它元素可直接加入或可天然存在于工艺组分中。
如本文所用，过氧化合物是指包含至少一个氧氧单键的化合物。优选的过氧化物选自氢过氧化物、有机过氧化物、无机过氧化物和释放过氧的化合物。
氢过氧化物是通式R-O-O-H的化合物，其中R是氢或具有1至20个碳原子的直链烷基、支链烷基或环状烷基自由基，并且任选地可间以一个或多个氧和/或羰基基团。氢过氧化物的例子包括但不限于过氧化氢、过氧乙酸、叔丁基氢过氧化物、氢过氧化枯烯和乙醚氢过氧化物。
有机过氧化物是具有通式R1-O-O-R2的化合物，其中R1和R2各自独立地为具有1至20个碳原子的直链烷基、支链烷基和/或环状烷基自由基，并且可任选地间以一个或多个氧和/或羰基基团。有机过氧化物的例子包括但不限于，过氧化苯甲酰和过氧化二叔丁烷。
无机过氧化物是包含O2 2-阴离子并且具有通式M2O2或M1O2的化合物，其中M是碱性金属并且M1是碱土金属。无机过氧化物的例子包括但不限于过氧化钠、过氧化钙和过氧化钡。
释放过氧的化合物也适用于本发明。更具体地，释放过氧的无氮化合物在本文定义为能够在加入水体系后释放过氧化氢或其它含氧自由基的任何无氮物质。释放过氧的化合物的例子包括过碳酸盐、过硼酸盐和过氧化物的碱金属、碱土金属和过渡金属化合物，以及它们的合适混合物。优选的释放过氧的化合物包括但不限于过碳酸钠、过硼酸钠、过氧化钠、过氧化钙、过氧化酶和过氧化锌。
优选地，用于本发明的过氧化物是过氧化氢，本文称之为“HP”。HP可以在水中以33重量％至37重量％的浓度商购获得。商购获得的HP还可包含添加剂。添加剂包括稳定剂，诸如磷酸或其它矿物酸，以及抑制剂，诸如焦磷酸盐和锡酸盐化合物。
防腐和保存是指处理碳水化合物原料以防止污染性微生物(诸如细菌)对碳水化合物的反应或消耗。保存在至少一个月的时长上提供稳定的碳水化合物原料，其不发生实质的改变，诸如由于微生物代谢导致的碳水化合物的反应或消耗。改变的一个量度是保存原料的微生物群体。当恰当保存时，碳水化合物原料不发生大于1log10CFU/ml或1log10CFU/g的原料中的微生物群体增加。通常微生物群体用log10CFU/ml(用于液体原料)和log10CFU/g(用于固体/半固体原料)表示。log10CFU/g的表达方式也可用于液体原料。
对于保存，变化的第二种度量是基于所述原料中特定酸类的浓度。酸是产生自污染性细菌对碳水化合物的反应和/或消耗的产物。例如，已知污染碳水化合物原料的某些细菌通过消耗碳水化合物而产生乳酸和乙酸。碳水化合物原料中提高浓度的乳酸和乙酸可用于显示原料是否适当地保存。当适当保存时，碳水化合物原料中的乳酸浓度低于0.60％(重量/体积)，并且碳水化合物原料中的乙酸的浓度低于0.30％(重量/体积)。
本领域的技术人员还应理解，可使用其它的改变的量度。例如，检测到非期望化合物(例如来自碳水化合物原料代谢的产物)的存在可指示改变。检测方法可包括分光光度测定法、色谱法以及本领域的技术人员已知的其它方法。其它量度可包括碳水化合物原料的物理性能如比重或粘度的改变。
季铵化合物(QAC)具有通式R4N+X-并且是一类阳离子有机氮化合物，其中X是卤素。R选自饱和及不饱和的烷基、芳基、烷芳基、苯基、烯丙基和烷基苯基基团，其可以任何组合连接在一起。QAC是基于季铵阳离子和卤素阴离子的盐，其中阳离子不依赖溶液pH而永久性保持带电。R可以是相同的，或是对应于二到四种明显不同的部分。R可以是任何类型的烃类：饱和、不饱和、芳族、脂肪族、支链或正链，其具有1-24个碳原子。R还可以是基于1-8个碳原子的烷基酰氨基亚烷基、羟基亚烷基或烷氧基亚烷基基团，其中烃类或亚烷基链可间以一个或多个杂原子，杂原子选自氮、硫和磷。R还可包含另外的官能团和杂原子。与四个有机基团共价成键的氮原子携带正电荷，其由阴离子“X”所平衡。杂环物(在其中氮原子通过单键与两个碳原子成键并通过双键与一个碳原子成键)也被认为是季铵化合物。QAC的例子包括(1)碘化甲基吡啶(2)十八烷基苄基二甲基氯化铵，以及(3)氯化二(氢化牛脂烷基)二甲基铵，其中烷基基团R可以是相同的或者不同的，并且具有14至18个碳原子，其在下文示出。
季铵化合物还包括可质子化的氮的来源。季铵化合物或可质子化的氮的多种来源可用于本发明，其包括胆碱、卵磷脂、甜菜碱和胺氧化物。
可用于本发明的季铵化合物可选自烷基二甲基苄基氯化铵；二辛基-二甲基氯化铵；二癸基二甲基氯化铵；二烯丙基-二甲基氯化铵；二正癸基-二甲基氯化铵；十六烷基氯化吡啶苄索氯铵；以及它们的混合物。
反应物是指接种物、可发酵糖、任选的营养物质以及发酵液体培养基中的其它任选组分。出于本文的目的，反应物还包括工艺用水。
生长控制方法
本发明用于控制一种或多种污染性微生物的生长的方法，所述方法包括以下步骤、基本由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向发酵过程的一个或多个步骤中加入组分(a)过氧化合物(PC)和(b)季铵化合物(QAC)的组合。
组分PC和QAC可分别加入发酵过程。当分别加入时，PC和QAC可同时(在相同时候)或以任何顺序先后(在不同时候)加入一个或多个不同的工序。
组分PC和QAC可分别加入或与任何反应物(诸如接种物、可发酵糖或工艺用水)在将反应物和组分引入发酵容器之前加以组合加入。
作为另外一种选择，所述方法还可包括将组合物的组分PC和QAC在加入发酵过程之前进行接触。优选地，组分PC和QAC在加入之前接触并且由此而作为单一组合物加入发酵过程。
发酵过程可以是分批的或连续的。在分批发酵中，优选地在加入可发酵糖之前，更优选地在加入任何反应物之前，将所述组分PC和QAC作为单一组合物(在加入前进行接触)加入或分别加入发酵容器。在连续发酵过程中，可在酵母增殖步骤或进行接触的步骤将组分PC和QAC作为单一组合物加入发酵容器。如果成系列地使用了超过一个发酵容器，优选地将组分加入系列中的第一发酵容器或主发酵容器。
优选地在产生显著量的乙醇之前或产生与污染性细菌生长相关联的显著量的有机酸之前将PC和QAC加入所述工艺。“显著量的乙醇”是指发酵液体培养基中的乙醇量不超过10重量％，其以发酵液体培养基的总体积计。“显著量的有机酸”是指发酵液体培养基中的有机酸量不超过0.3重量％，其以发酵液体培养基的总体积计。优选地在发酵过程早期加入PC和QAC，诸如在接种酵母增殖期间，或紧随接种酵母引入发酵容器之后。
在另一个实施例中，在将接种物引入发酵容器之前将PC和QAC加入发酵过程。在这一实施例中，可将PC和QAC加入可发酵糖或工艺用水或兼而引入两者(在将这些反应物任一个引入发酵容器之前)并且在将接种物引入发酵容器之前将合并的PC/QAC/可发酵糖和/或PC/QAC/工艺用水引入该发酵容器。例如，可将PC和QAC加入提供可发酵糖的一个或多个步骤，诸如湿磨或干磨方法的一个或多个步骤。
当发酵过程包括基于甘蔗或基于(糖用甜菜)糖蜜的可发酵糖时，通常具有系列的发酵容器，其具有第一发酵容器、第二发酵容器或甚至第三发酵容器或更多的发酵容器以作为系列容器，其中作为发酵循环一部分发酵液体培养基连续地转移进入的各个发酵容器。在这一实施例中，优选地PC和QAC优选地加入第一发酵容器。
作为另外一种选择，在使用甘蔗或糖用甜菜或糖蜜作为可发酵糖的发酵过程中，在将可发酵糖与接种物接触之前将PC和QAC加入可发酵糖中。可在可发酵糖的储存期间加入PC和QAC。本文将在储存期间加入PC和QAC的这一步骤设想为提供可发酵糖的工艺步骤，其在将可发酵糖引入发酵容器之前进行。优选地，在将可发酵糖引入发酵容器之前加入PC和QAC，例如，在将工艺用水和营养物质加入该发酵容器之后。
还可在加入反应物之前将PC和QAC加入空发酵容器。
在另一替代方案中，对于甘蔗或糖蜜为可发酵糖并且在完成各个发酵循环后对接种物循环利用的分批工艺中，可在开始发酵过程的随后批次之前将PC和QAC加入酵母处理阶段(酵母增殖)。即，PC和QAC分别地、同时地或作为合并的组合物加入酵母再循环利用物流，其通常称为酵母膏。
在一个实施例中，将PC和QAC加入工艺用水。本文将向工艺用水中加入PC和QAC的这一步骤设想为提供工艺用水的工艺步骤，其在将工艺用水引入发酵容器之前进行。工艺用水包括任何水，其通过外部来源或从发酵过程其它部分进行循环利用而引入所述发酵过程。
在基于糖蜜的发酵过程中，工艺用水包括用于在发酵前稀释进料的糖蜜的水、作为酵母制备工艺部分而加入的水或从此前的发酵步骤循环利用的水(包括酵母再循环利用物流)。
在干磨发酵过程中，工艺用水包括加入浸槽、浆液槽、酵母增殖或发酵容器。工艺用水还可是干磨分批发酵过程中的再循环利用物流，其中再循环利用物流是在发酵完成后产生的物流，并且常称为回流或工艺冷凝物。干磨发酵过程的这些阶段对于本领域的技术人员是熟知的。参见，例如R.J.Bothast和M.A.Schlicher,AppliedMicrobiologyandBiotechnology，如前文引用。
发酵过程可在接触步骤后进一步包括或替代性地包括将PC和QAC加入该接触步骤的产物(其产物包含乙醇)，将乙醇从所述产物中分离。作为另外一种选择，发酵过程还可在接触步骤后包括将乙醇从剩余的产物中分离，其中所述剩余的产物被送入例如发酵池或酒糟水槽，并且向发酵池或酒糟水槽加入SCD和PC。
将过氧化合物(PC)和季铵化合物以提供有效量的量加入所述发酵过程，从而使组合有效地控制一种或多种污染性微生物的生长。通常PC以提供10ppm至1000ppm(以发酵液体培养基的总体积计)的重量浓度的量加入。优选地，PC以提供50ppm至200ppm(以发酵液体培养基的总体积计)的PC重量浓度的量加入。更优选地，PC以提供50ppm至100ppm(以发酵液体培养基的总体积计)的PC重量浓度的量加入。通常QAC以在发酵液体培养基中提供10至1000ppm(以发酵液体培养基的总重量计)的QAC重量浓度的量加入。优选地QAC以提供50至500ppm(以发酵液体培养基的总体积计)的QAC浓度加入。更优选地QAC以提供100至200ppm(以发酵液体培养基的总体积计)的QAC浓度加入。
保存方法
作为本发明用于在发酵过程中控制污染性微生物生长的一个实施例，可加入PC和QAC以作为提供可发酵糖中的步骤。更具体地，根据本文定义，发酵过程包括产生和储存碳水化合物原料的工序，其中碳水化合物原料包括可发酵糖或其用于制备可发酵糖。因此，提供可发酵糖的步骤可包括将碳水化合物原料与PC和QAC接触。因此，本发明的方法还适用于在碳水化合物原料的储存中防止降解。
原料中的碳水化合物含量为至少1重量％，并且优选地在1重量％-70重量％的范围内(以原料总重量计)。过氧化合物和季铵化合物以有效量加入。通常以10ppm至1000ppm的过氧化合物的量(基于原料总重量计)加入过氧化合物，并且通常以50ppm至500ppm的季铵化合物的量(以原料的总重量计)加入季铵化合物，其中本文以ppm来表示的全部量是以重量/重量为基础的。优选地，过氧化合物以100ppm至1000ppm，更优选地以100ppm至500ppm，并且最优选地以100ppm至200ppm的过氧化合物的量(以原料的总重量计)加入。优选地，以提供100ppm至500ppm季铵化合物的原料中浓度(以原料的总重量计)，更优选地100ppm至200ppm季铵化合物浓度(以原料的总重量计)的量加入季铵化合物。
在该方法中，将有效量的PC和QAC与的碳水化合物原料接触以保护碳水化合物不发生非期望的微生物生长，并因此防止所述原料的劣化。原料劣化可通过存在的污染微生物群体或微生物代谢物浓度如有机酸进行测定，所述微生物代谢物一般指示原料中非预期的或非期望的微生物活性。因此在加入PC和QAC后基本上防止了储存或运输原料中的微生物增殖。
令人惊讶地是，根据本发明处理的碳水化合物原料在至少一个月内保持稳定。“稳定”在本文是指加入的PC和QAC保存碳水化合物原料，其中上文将“保存”定义为通过污染微生物防止碳水化合物的反应或消耗。稳定的碳水化合物原料不发生大于1log10CFU/ml或1log10CFU/g的原料中微生物群体增加。CFU是菌落形成单位的缩写，它是原料中的微生物群体的量度。CFU用于测定每单位体积或每单位质量样品中存活的微生物细胞的数量或样品的微生物污染程度。改变的第二个量度是保存原料的pH。适当保存的原料的pH不应改变超过0.5个pH单位。然而，如上文所述，pH改变可能不足以在所有情况下监控碳水化合物原料的保存。
碳水化合物原料如上文所定义。
在本发明中，PC和QAC的组合作为防腐剂用于碳水化合物原料以阻止污染性微生物活性以及碳水化合物原料的随后劣化，其作为提供可发酵糖的步骤进行。污染微生物包括细菌和酵母污染菌，它们分别公开于WO2007/149450和提交于2009年5月18日的美国专利公开申请12/467,728中。组合抑制某些细菌的生长，所述细菌引起碳水化合物的非期望分解，例如单糖分解成有害的酸并且还选择性地降低酵母污染菌的活性。
实例
实例1
通过使用3份水稀释1份糖蜜来制备发酵液体培养基，如基于糖蜜的发酵过程中所实践。通过在deMann-Rogosa-Sharpe(MRS)液体培养基(可获自DifcoLaboratories,Inc.,Sparks,MD)中在32℃下在振荡保温箱中生长各个细菌的过夜培养物并随后合并液体培养基来制成混合培养物，从而制备了三种乳酸细菌(LAB)菌种(短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei))的混合物。通过在酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)液体培养基(可获自DifcoLaboratoriesInc.,Sparks,MD)上生长过夜培养物而制备了啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(接种酵母)的独立过夜培养物。使用LAB混合物接种一份糖蜜培养基以产生约1×106菌落形成单位数(CFU)/ml培养基。使用酵母接种单独的一部分以产生约6×105CFU/ml。使用过氧化氢(HP)、季铵化合物(二癸基二甲基氯化铵)或两者的组合处理所接种的糖蜜培养基部分，如下文所述：
LAB
1.对照(无处理)
2.100ppmQAC
3.150ppmQAC
4.75ppmHP
5.100ppmHP
6.75ppmHP/100ppmQAC
7.75ppmHP/100ppmQAC
8.100ppmHP/100ppmQAC
9.100ppmHP/150ppmQAC
接种酵母(酿酒酵母菌)
1.对照(无处理)
2.100ppmQAC
3.150ppmQAC
4.100ppmHP/100ppmQAC
在32℃下在振荡保温箱内孵育经处理的样品，随后在磷酸缓冲盐(PBS)中制备系列稀释物，此后将所述稀释物涂布于MRS琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上以用于存活计数测定。在32℃下孵育所述平板48小时。结果在下文示出：
LAB
**-计数低于检出限
酿酒酵母菌(接种酵母)
数据显示，QAC和HP的组合在降低糖蜜培养基中的LAB群体上比单个处理自身更为有效。例如，100ppmHP和100ppmQAC的组合导致了LAB降低至不可检出的水平；100ppmQAC自身并不降低LAB群体，而100ppmHP自身仅仅将存活LAB群体降低了约1logCFU/ml。类似浓度的QAC和HP对于接种酵母的存活率并不具有任何显著的影响，甚至在将两种处理结合时。
实例2
在本实例中，过氧化氢(HP)和氯化季铵化合物用于棋盘式测定法以确定其相互作用针对发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)是否具有协同性。棋盘式测定法用于分析化合物之间的相互作用，其通过以趋升浓度将它们混合以测定所述化合物是否协同性、叠加性或反协同性地作用。(参见，M.Najjar,D.Kashtanov,M.Chikindas,LettersinAppliedMicrobiology,第45卷，(2007)13-18)。在32℃下将发酵乳杆菌(L.fermentum)在MRS液体培养基(deManRogosaandSharpbroth,DifcoLaboratories,Inc.,Sparks,MD)中过夜培养。随后稀释培养物并且重悬浮于调节为pH4.8的新鲜MRS液体培养基中。使用标准的平板计数来测定重悬浮的培养物中的细菌数量。样品稀释(1:10)于无菌的磷酸缓冲液(Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MO)中并且涂布于MRS平板表面。随后将重悬浮的培养物(150μl)填入96孔板(Becton,DickinsonandCo.,FranklinLakes,NJ)的孔内。随后在下文“棋盘式”平板图中示出的浓度下加入过氧化氢(HP)(VWRScientificProducts,Bridgeport,NJ)和二癸基二甲基氯化铵(DDAC)季铵化合物(Bardac2250DDAC,LonzaInc.,Allendale,NJ)。封盖所述平板并且在32℃下孵育24小时。在孵育后，移取所述平板并且使用酶标仪(PowerWave,BioTekInstrumentsInc.,Winooski,VT)在600nm下测定各孔的光密度。根据光密度，对各孔计分以测定是否存在对生长的无抑制(NI)、部分抑制(PI)或完全抑制(CI)。结果提供于表1中。
为测定在HP和所述季铵化合物之间是否发生了任何协同活性，使用以下公式测定抑制浓度比值(FIC)：
FIC＝[HP]/MICHP+[DDAC]/MICDDAC
其中[HP]和[DDAC]分别为导致部分抑制的HP和Bardac2250的浓度，并且MICHP和MICDDAC分别是HP和DDAC的最低抑制剂浓度。当所得的FIC为<1.0时，测定了所述两种抗微生物剂的协同性。
对于上文的棋盘测定法，FIC测定为0.42，这显示了HP和DDAC季铵化合物之间针对发酵乳杆菌的相互作用的协同效应。因此，实例2表明过氧化氢和季铵化合物的组合使发酵过程中灭活细菌所需要的组分的剂量降低。

Claims (10)

1.控制发酵过程中污染性微生物生长的方法，包括将组分(a)过氧化合物和(b)季铵化合物加入发酵过程的一个或多个步骤中，其中所述发酵过程包括(i)提供发酵容器；(ii)提供接种物、可发酵糖和工艺用水；(iii)将所述接种物、可发酵糖和工艺用水单独或以任何组合引入发酵容器以提供发酵液体培养基；以及(iv)在所述接种物将所述可发酵糖转化成乙醇的温度下，在所述发酵容器中使所述接种物与所述可发酵糖接触。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括将营养物质加入所述接种物、可发酵糖和工艺用水的一种或多种中，或直接加入所述发酵容器中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述接种物为酵母种菌，所述酵母种菌通过使酵母起始培养物与营养物质组合物在增殖槽中接触而产生。
4.根据权利要求1所述的方法，其中以所述发酵液体培养基的总重量计，过氧化合物以提供按重量计10ppm至1000ppm的过氧化合物浓度的量加入，并且以所述发酵液体培养基的总重量计，所述季铵化合物以提供10ppm至1000ppm的浓度的量加入。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述过氧化合物选自氢过氧化物、有机过氧化物、无机过氧化物或释放过氧的化合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述季铵化合物选自烷基二甲基苄基氯化铵；二辛基-二甲基氯化铵；二癸基二甲基氯化铵；二烯丙基-二甲基氯化铵；二正癸基-二甲基氯化铵；十六烷基氯化吡啶鎓；苄索氯铵；以及它们的混合物。
7.控制碳水化合物原料中至少一种污染性微生物生长的方法，所述方法包括使所述原料与过氧化合物和季铵化合物接触，其中以所述原料总重量计，所述原料的碳水化合物含量为至少1重量％。
8.根据权利要求7所述的方法，其中以所述原料的总重量计，所述过氧化合物以10ppm至1000ppm的过氧化合物的量加入，并且以所述原料的总重量计，所述季铵化合物以50ppm至500ppm的季铵化合物的量加入。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵过程还包括在步骤(iv)后，将过氧化合物和季铵化合物加入所述接触步骤的产物中，所述接触步骤的产物包含乙醇。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵过程还包括在步骤(iv)后，从所述接触步骤的产物中分离所述乙醇以提供剩余产物，所述接触步骤的产物包含乙醇，其中将所述剩余产物进料到发酵池或酒糟水槽中，所述发酵过程还包括将所述过氧化合物和季铵化合物加入所述发酵池或酒糟水槽。
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