CN105699295A - 利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测方法与装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测方法与装置。所述的定量检测装置包括光声荧光信号激发源发生器、衰减片、光纤耦合器、单模光纤、可调谐准直器、显微物镜、柱状中空超声耦合器、光电倍增管、滤波器、放大器、双通道并行采集卡、超声耦合杯、样品台、二维电动平台、电磁信号屏蔽金属盒、二向色镜、反射镜、滤光片、避光筒、带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机。本发明可同时获得生物组织的多个参数，最重要的是通过将所得到的光声荧光信号做统计计算后做比可以定量该组织pH的分布。本发明的图像分辨率可达到0.1～2μm。同时结合了荧光灵敏度高，光声分辨率好，光声图像和荧光图像的对应性好。

Description

利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测方法与装置
技术领域
本发明属于一种无损测试测量技术，特别涉及一种利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测方法与装置。
背景技术
pH值是生命体征的一个特殊的表现，由于目前的技术还无法达到同时的光声荧光测量pH的技术，通过光激发可以测量较深组织的光声信号，由于光声信号的灵敏度不高，因此我们同时也检测了组织所发出的荧光信号，这就弥补了光声信号灵敏度低的缺点，为此们发明了这种光声荧光对生物组织pH值得测量装置与方法
这两种方法结合成像可以以获得组织的很多参数，但是单一的光声或者荧光不能获得组织的pH的分布，而两者做比值以后和样品的pH值有很大的关联性，因此我们利用合格特性来定量组织的pH值。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用光声荧光信号比值测定pH值的方法，包括如下步骤：
(1)脉冲激光通过衰减片后通过光纤耦合器将光耦合到单模光纤中去，光纤的另一端连接可调谐准直器，然后出射的光经过显微物镜聚焦后落在样品上，同时激发产生光声信号和荧光信号；
(2)光声信号穿过超声耦合液后被柱状中空超声耦合器接收，然后通过滤波器和放大器放大；荧光信号依次通过二向色镜、反射镜和滤光片后被光电倍增管接收；两路信号被双通道并行采集卡同时采集，再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像重建软件的计算机中；
(3)样品与盛放超声耦合液的超声耦合杯一起放置于二维电动平台上，由装有电机控制软件的计算机控制其移动；每采集完一次光声信号和荧光信号，电动平台移动一步，以对样品进行逐点扫描，用于重建二维图像；
(4)采集完全部的信号后，通过最大值投影算法重建出样品的光声和荧光图像，并通过程序提取成像部分分别做统计进行比值计算，测定pH值。
步骤(1)中所述的脉冲激光为光声荧光信号激发源发生器输出的脉冲激光；
所述的脉冲激光的波长为650～2500nm，脉宽为20ns，重复频率为20HZ～200kHZ。
步骤(1)中所述的单模光纤是数值孔径为0.12、光纤接头为FC、光纤芯径为62.5μm的单模光纤；
步骤(1)中所述的可调谐准直器是焦距为4.6mm、透光的波长范围为650～1050nm的可调谐准直镜；
步骤(2)中所述的超声藕合液为水。
步骤(2)中所述的柱状中空探测器的主频为10MHz。
步骤(3)中所述的电动平台移动的最小步距为1μm；
步骤(4)中所述的最大值投影算法是通过Matlab软件自行编写。
步骤(4)中所述的程序为用MATLAB编写的程序。将所得数据利用程序读取以后，会得到所成像区域的信号平均值以及误差值，最后将所得到的数值做比可以得到与pH对应的荧光光声比值。
所述的样品为生物组织，测量目标为定量pH值；所用的检测探针为DiIlRB-S探针；该探针是由合作单位合成，可参考文献“Multi-parametricimagingoftheinvasivenesspermissiveacidicmicroenvironmentinhumangliomaxenografts”。
利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置，是根据上述方法构建的。所述的定量检测装置包括光声荧光信号激发源发生器、衰减片、光纤耦合器、单模光纤、可调谐准直器、显微物镜、柱状中空超声耦合器、光电倍增管、滤波器、放大器、双通道并行采集卡、超声耦合杯、样品台、二维电动平台、电磁信号屏蔽金属盒、二向色镜、反射镜、滤光片、避光筒、带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机。
所述的柱状中空超声耦合器置于显微物镜的正下方，且显微物镜与柱状中空超声耦合器共焦点；
所述的超声耦合杯位于样品台正上方，柱状中空超声耦合器和光电倍增管置于超声耦合杯的正上方，其中，光电倍增管在柱状中空超声耦合器的上方；
所述的样品台固定在二维电动平台上；
所述的光声荧光信号激发源发生器、衰减片、光纤耦合器、单模光纤、可调谐准直器、显微物镜依次连接。
所述的二向色镜、反射镜、滤光片、光电倍增管依次连接；
所述的柱状中空超声耦合器、滤波器、放大器依次电气连接；
所述的光声荧光信号激发源发生器、光电倍增管、二维电动平台、放大器、双通道并行采集卡与带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机依次电气相连；
所述的放大器的放大倍数为70dB，带宽为50KHz～500MHz；
所述的放大器优选为多级级联放大器；
所述的显微物镜的放大倍数为4倍、10倍、20倍、40倍，成像质量只与放大倍数有关，倍数越高则质量越好。
所述的双通道并行采集卡的型号可以为PCI2400(NI公司生产)，但其他型号，例如研华采集卡也可以用。
所述的二维电动平台由步进电机和移动平台构成，通过电机旋转带动移动平台前后移动，二维电动平台由两个这种电动平台组成，可以实现前后左右四个方向移动。
所述的步进电机固定于电磁信号屏蔽金属盒内部；步进电机在运行过程中会产生噪声信号，因此为了使得信噪比更好，本发明使用了电磁信号屏蔽金属盒，达到了较好的屏蔽电磁信号的作用。
所述的采集控制软件和图像重建软件均为Labview软件，程序自行编写；
所述的电机控制软件为Labview软件，程序自行编写；
所述的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置的光声和荧光同时成像的图像分辨率可以达到0.1～2μm。
本发明的原理是，本发明通过脉冲激光器同步输出脉冲激光和触发信号，脉冲激光经过单模脉冲激光传导光纤传输，出射光通过显微物镜聚焦在样品上激发出光声荧光信号，两种信号同时被双通道并行的采集卡采集，然后通过带有采集控制软件和数据存储软件的计算机存储。最后这些数据通过自己编写的MATLAB程序采用最大值投影算法重建图像，然后再提取对应区域的光声荧光信号统计做比即可得到该样品的pH值。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明实现了光声成像，荧光成像两种生物组织成像方法的一体化，简化了检测程序，降低检测难度，可以实现两种成像方法的单独工作或同时工作。
(2)本发明可以同时获得生物组织的多个参数，最重要的是通过将所得到的光声荧光信号做统计计算以后做比可以定量该组织pH的分布。
(3)本发明同时结合了荧光灵敏度高，光声分辨率好，光声图像和荧光图像的对应性好。
附图说明
图1是本发明的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置的结构示意图；其中，1为光声荧光信号激发源发生器；2为衰减片；3为光纤耦合器；4为单模光纤；5为可调谐准直器；6为显微物镜；7为二维电动平台；8为样品台；9为超声耦合杯；10为柱状中空超声耦合器；11为滤波器；12为放大器；13为二向色镜；14为反射镜；15为滤光片；16为光电倍增管；17为避光筒；
18为带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机。
图2是实施例2得到的光声荧光图像，(a)为DiIlRB-S的光声图像，(b)为DiIlRB-S的荧光图像。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置的结构示意图，如图1所示。
该定量检测装置包括1为光声荧光信号激发源发生器；2为衰减片；3为光纤耦合器；4为单模光纤；5为可调谐准直器；6为显微物镜；7为二维电动平台；8为样品台；9为超声耦合杯；10为柱状中空超声耦合器；11为滤波器；12为放大器；13为二向色镜；14为反射镜；15为滤光片；16为光电倍增管；17为避光筒；18为带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机。
所述的光声荧光信号激发源发生器1、光电倍增管16、二维电动平台7、放大器12、与带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机依次电气相连18；
所述的柱状中空超声耦合器10和光电倍增管16置于超声耦合杯9的正上方，其中，光电倍增管16在柱状中空超声耦合器10的上方；
衰减片2固定在光学支架上数量可增可减，通过调整光纤耦合器3可以使得耦合效率发生一定的改变(一般不建议做调整)，将柱状中空超声耦合器10固定在显微物镜6的正下方，且共焦点；所述的超声耦合杯9位于样品台8正上方，固定在二维电动平台7上，二维电动平台7带动样品台8和超声耦合杯9一起移动并扫描；超声耦合杯9中装入超声耦合液水用于光声信号传播；所述的光声荧光信号激发源发生器1输出的脉冲激光通过衰减片2后通过光纤耦合器3将光耦合到单模光纤4中去，光纤的另一端连接可调谐准直器5，然后出射的光经过显微物镜6聚焦后落在样品上，同时激发产生光声信号和荧光信号；光声信号穿过超声耦合液后被柱状中空超声耦合器10接收，然后通过滤波器11和放大器12放大；荧光信号依次通过二向色镜13、反射镜14和滤光片15后被光电倍增管16接收；两路信号被被双通道并行采集卡同时采集，再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像重建软件(Labview)的计算机18中；
二维电动平台7由装有电机控制软件(Labview)的计算机控制其移动；每采集完一次光声信号和荧光信号，电动平台移动一步，采集完全部的信号后，通过最大值投影算法(通过Matlab软件自行编写)重建出样品的光声和荧光图像，并通过程序提取成像部分分别做统计进行比值计算，测定pH值。
所述的二维电机平台7中的步进电机固定于电磁信号屏蔽金属盒内部；步进电机在运行过程中会产生噪声信号，因此为了使得信噪比更好，本发明使用了电磁信号屏蔽金属盒，达到了较好的屏蔽电磁信号的作用。
所述的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置的光声和荧光同时成像的图像分辨率可以达到0.1～2μm。
实施实例2：应用实施例1对pH的定量成像的方法如下：
(1)将滴有一定pH的DiIlRB-S探针装入毛细管中，毛细管两端用黑胶泥封住，将其放在样品台上。
(2)光声荧光激发光源发生器采用泵浦波长可调谐激光器，输出波长范围为650～1200nm，该探针的吸收峰在680nm，因此使用该波长的光激发样品产生光声荧光信号。
(3)毛细管中的样品被脉冲激光照射后产生荧光信号和光声信号，光声信号穿过超声耦合液后被柱状中空超声耦合器(主频为10MHz)接收，然后通过滤波器和放大器放大；荧光信号依次通过二向色镜、反射镜和滤光片后被光电倍增管接收；两路信号被双通道并行采集卡同时采集，再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像重建软件(Labview)的计算机中。
(4)对所采集的数据利用MATLAB程序，所采用的的数据处理方法为最大值投影算法，对其光声信号和荧光信号进行成像如图2。对所成的像的对应区域做统计学分析，得到平均值，并对相对应的部分做比值，由此可以定量出pH值。其中，比值统计也是通过MATLAB程序实现的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置，其特征在于：该装置包括光声荧光信号激发源发生器、衰减片、光纤耦合器、单模光纤、可调谐准直器、显微物镜、柱状中空超声耦合器、光电倍增管、滤波器、放大器、双通道并行采集卡、超声耦合杯、样品台、二维电动平台、电磁信号屏蔽金属盒、二向色镜、反射镜、滤光片、避光筒、带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机；
所述的柱状中空超声耦合器置于显微物镜的正下方，且显微物镜与柱状中空超声耦合器共焦点；
所述的超声耦合杯位于样品台正上方，柱状中空超声耦合器和光电倍增管置于超声耦合杯的正上方，其中，光电倍增管在柱状中空超声耦合器的上方；
所述的光声荧光信号激发源发生器、衰减片、光纤耦合器、单模光纤、可调谐准直器、显微物镜依次连接；
所述的二向色镜、反射镜、滤光片、光电倍增管依次连接；
所述的柱状中空超声耦合器、滤波器、放大器依次电气连接；
所述的光声荧光信号激发源发生器、光电倍增管、二维电动平台、放大器、双通道并行采集卡与带有采集控制软件和图像重建软件以及电机控制软件的计算机依次电气相连。
2.根据权利要求1所述的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置，其特征在于：所述的光声荧光信号激发源发生器输出的脉冲激光的波长为650～2500nm，脉宽为20ns，重复频率为20HZ～200kHZ。
3.根据权利要求1所述的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置，其特征在于：所述的放大器的放大倍数为70dB，带宽为50KHz～500MHz。
4.根据权利要求1所述的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置，其特征在于：所述的放大器为多级级联放大器。
5.根据权利要求1所述的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置，其特征在于：
所述的二维电动平台由步进电机和移动平台构成，通过电机旋转带动移动平台前后移动，二维电动平台由两个这种电动平台组成，实现前后左右四个方向移动；
所述的步进电机固定于电磁信号屏蔽金属盒内部。
6.根据权利要求1所述的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置，其特征在于：
所述的采集控制软件和图像重建软件均为Labview软件；
所述的电机控制软件为Labview软件。
7.运用权利要求1～6任一项所述的利用光声荧光信号比值测定pH值的定量检测装置的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)脉冲激光通过衰减片后通过光纤耦合器将光耦合到单模光纤中去，光纤的另一端连接可调谐准直器，然后出射的光经过显微物镜聚焦后落在样品上，同时激发产生光声信号和荧光信号；
(2)光声信号穿过超声耦合液后被柱状中空超声耦合器接收，然后通过滤波器和放大器放大；荧光信号依次通过二向色镜、反射镜和滤光片后被光电倍增管接收；两路信号被双通道并行采集卡同时采集，再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像重建软件的计算机中；
(3)样品与盛放超声耦合液的超声耦合杯一起放置于二维电动平台上，由装有电机控制软件的计算机控制其移动；每采集完一次光声信号和荧光信号，电动平台移动一步，以对样品进行逐点扫描，用于重建二维图像；
(4)采集完全部的信号后，通过最大值投影算法重建出样品的光声和荧光图像，并通过程序提取成像部分分别做统计进行比值计算，测定pH值。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的单模光纤是数值孔径为0.12、光纤接头为FC、光纤芯径为62.5μm的单模光纤；
步骤(1)中所述的可调谐准直器是焦距为4.6mm、透光的波长范围为650～1050nm的可调谐准直镜。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的柱状中空探测器的主频为10MHz；
步骤(3)中所述的电动平台移动的最小步距为1μm；
步骤(4)中所述的最大值投影算法是通过Matlab软件自行编写；
步骤(4)中所述的程序为用MATLAB编写的程序。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：
所述的样品的检测探针为DiIlRB-S探针。
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