CN105683757A - 在尿样品中诊断结核病的方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种从受试对象的尿样品诊断结核病或感染的方法，其中对所述尿样品测试至少一种结核分枝杆菌特异性生物标志物的存在，所述生物标志物选自Rv1475c、Rv1977、Rv0014c、Rv2748c、Rv1664、Rv1161、Rv2280、Rv2694c、Rv2490c、Rv0578c、Rv1450c、Rv1522c、Rv2737c、Rv2981c、Rv0765c、Rv2126c、Rv1759c、Rv1464、Rv3202c、Rv0668、Rv3345c、Rv3775、Rv3736、Rv2455c、Rv3885c和v1235。所述方法能够区分活动性结核病与潜伏性结合感染。还提供用于所述方法的护理现场诊断装置和试剂盒。

Description

在尿样品中诊断结核病的方法

技术领域

本发明涉及尿中结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)特异性生物标志物的鉴定，且涉及利用来自患者的尿样品使用这些生物标志物来诊断活动性结核病(TB)或潜伏性结核感染(LTBI)的方法。

背景技术

结核病(TB)是主要的全球健康问题，并且为了改善病例检测，WHO已经认可GeneXpertMTB/RIF检验(1)。对于TB病区，GeneXpert是用于提高诊断的巨大进步；但是，其在设计时未考虑资源匮乏的情境。举例而言，GeneXpert需要患者产生痰(这排除了许多HIV阳性个体、一些HIV阴性人员、具有肺外TB的那些人以及儿童)，在“培养物阳性、涂片阴性”的TB患者中具有约70％的敏感性，对于诊断肺外TB具有次优的敏感性，并且昂贵(2)。例如DetermineTBLAM抗原测试(4)等其他诊断测试并没有表现得更好，并且经证明具有有限的临床影响(5,6)。此外，结核分枝杆菌的培养耗时数周，因此限制了其利用。诸如干扰素γ释放检验等其它测试对于诊断活动性TB而言具有较差的次优敏感性和较差的特异性(3)。因此，TB的不精确诊断对于在资源匮乏情境下流行的TB病的控制仍然是令人惶惑的问题。因此，亟需经设计用于在发展中国家于护理现场(POC)使用的新型TB诊断，其代表着一个主要的未满足的全球健康首要问题。

一些初期TB蛋白质组学研究涉及分析来自不同感染菌株的结核分枝杆菌(M.tb)蛋白。这提供了对该细菌蛋白质组的深入认识，并且充当用于蛋白质注释的有用地图。受该研究影响，Agranoff等(8)利用血清的蛋白质组学指纹分析来寻找能够在HIV阳性和阴性患者中区分活动性TB、潜伏性结核(LTBI)和无TB的诊断性生物标志物。在另一研究中，Kashino等(9)利用与串联质谱(MS/MS)联用的1D液相色谱(LC)来鉴定患有肺结核的患者尿中的结合分枝杆菌衍生蛋白。最近的进一步尿蛋白质组学研究发现在11/21TB患者中检测到Rv1681(推定为钼蝶呤(molybdopterin)生物合成蛋白)(10)。但是，这些生物标志物尚未得到验证，并且不能区分潜伏性TB与活动性TB。

但是，迄今为止还没有可快速且价格合理地诊断TB的可商购的护理现场测试。

发明内容

一种从受试对象的尿样品诊断结核病的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)对所述尿样品测试至少两种生物标志物的存在，所述至少两种生物标志物对于活动性结核病(TB)或潜伏性结核感染(LTBI)具有特异性；和

(ii)基于对上述尿样品中的所述生物标志物中的至少一种的检测，确定所述受试对象是否具有TB或LTBI，

其中所述生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c组成的组，并且所述方法区分TB与LTBI。

所述生物标志物可以对于TB具有特异性。

可以对所述尿样品测试至少两种生物标志物的存在，所述至少两种生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c和Rv1161组成的组。

可以对所述尿样品测试Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c和Rv1161的存在。

所述生物标志物可以对于潜伏性结核感染具有特异性。

可以对所述尿样品测试至少两种生物标志物的存在，所述至少两种生物标志物选自由Rv1759c、Rv2126c和Rv3202c组成的组。

可以对所述尿样品测试Rv1759c、Rv2126c和Rv3202c的存在。

所述生物标志物中的至少一种可以选自由Rv1664、Rv1977和Rv2490c组成的组。

所述结核病可以是肺结核。

在不用抗原刺激所述尿样品的情况下执行所述方法。

可选地是，可以使用捕获剂来检测所述样品中生物标志物的存在。合适的捕获剂包括但不限于抗体、亲和体(affybody)、锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、核酸适体、经修饰的核酸适体、肽、经修饰的肽、碳水化合物配体、合成配体和合成聚合物。

可以可选地提供指示剂来指示捕获剂与生物标志物的结合。指示剂可以是电化学指示剂、生色指示剂、光学指示剂、荧光指示剂或放射性标记指示剂。作为选择，捕获剂与生物标志物的结合可以通过电学、声学、光学或机械方法直接检测。

所述方法可以是护理现场(point-of-care)方法，并且优选是其中在1小时内甚至更优选在15分钟内检测捕获剂与生物标志物的结合的护理现场方法。

可选地，捕获剂和指示剂位于其上能放置样品的测试带检测用品或微流体装置上。

根据本发明的第二实施方式，提供根据基本如上所述的方法从受试对象的尿样品诊断结核病的测试装置，所述测试装置包含能够结合至少两种结核病生物标志物的捕获剂，所述至少两种结核病生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c组成的组。

所述测试装置可以包括在捕获剂与生物标志物结合时进行指示的指示剂。

根据本发明的第三实施方式，提供用于从受试对象的尿样品诊断结核病的试剂盒，所述试剂盒包含能够结合至少两种结核病生物标志物的捕获剂，所述至少两种结核病生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c组成的组。

所述试剂盒可以包含在捕获剂与生物标志物结合时进行指示的指示剂。

所述试剂盒还可以包含测试装置和/或执行所述诊断方法的说明书。

根据本发明的另一实施方式，提供能够与生物标志物选择性结合的捕获剂，所述生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c组成的组。

所述捕获剂可以用于上述诊断结核病方法中，或者可以用于制造上述测试装置。

附图说明

图1:(a)详述通过最终诊断类别分类的患者诊断结果的流程图，和(b)详述蛋白质组样品制备过程、液相色谱质谱分析和生物信息学分析的示意性工作流程。

图2:(a)总尿蛋白库(repertoire)，和(b)在临床上归类为活动性TB、LTBI和非TB/非LTBI的疑似TB患者中观察到的独特和重叠的M.tb蛋白。

图3:从疑似TB患者中鉴定的蛋白的基因本体(GO)富集分析，以非TB/非LTBI患者组设定为背景基因产物。利用阈值p≤0.05的David途径分析获得以下术语(term)。GO-BP：表示分子事件的运行或集合的术语。GO-CC:表示细胞的一部分或细胞外空间的术语。

图4:GO富集分析，其中：A是来自富集术语的聚簇的GO-BP蛋白(“对刺激物的响应(GO:0006955)”)，B是来自LTBI组中的术语的聚簇的GO-BP蛋白，C是来自TB和LTBI组中的术语的聚簇的GO-CC蛋白。

图5:对来自TB疑似者的普通人尿蛋白进行的相对定量分析：从(a)X！Tandem和(b)Omssa观察到的TB、LTBI和非-TB/非-LTBI。从比较非-TB/非-LTBI与LTBI和TB确定了统计学显著性差异(*＝p<0.05和***＝p<0.001)。经由双因素ANOVA利用Bonferroni校正评价显著性。NSAF＝标准化图谱丰度因子。

图6:M.tb蛋白的已知分子量分布的柱状图。蛋白质总数量为3999。最小质量为2,692Da。最大质量为431,440Da。平均质量为35,625Da。注意：最大分布见于15,000Da～25,000Da。

图7:源自M.tb的胰蛋白酶肽的代表性一式三份的PRM检验数据。(a)显示肽序列TDAATLAQEAGNFER(源自Rv3874)的一式三份的PRM数据。显示了9种跃迁(transition)，对应于b9(+1价)、b12(+1价)、b13(+1价)、b12(+2价)、y13(+1价)、y4(+1价)、y14(+2价)、y13(+2价)和y11(+2价)片段离子的形成。(b)显示肽序列DGDGGAGGDGGDPGAGGK(源自Rv2490c)的一式三份的PRM数据。显示9种跃迁，对应于b12(+1价)、y16(+1价)、y11(+1价)、y10(+1价)和y16(+2价)片段离子的形成。

具体实施方式

申请人已经鉴定了在尿中存在的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)特异性生物标志物。可以使用这些生物标志物(源自人和源自结核分枝杆菌的蛋白)可以从受试对象的尿样品诊断所述受试对象中的活动性TB或潜伏性TB感染。

如本文所用，术语“包括”、“包含”、“含有”和其任何变体旨在涵盖非排他性内含物，并且不排除未特别提及的其它要素。

如本文所用，“多肽”、“肽”和“蛋白质”相互替换地使用，以指任何长度的氨基酸的聚合物。

如本文所用，“标志物”和“生物标志物”相互替换地使用以指代靶分子，所述靶分子对个体中的正常或异常过程或个体中的疾病或其它状况进行指示或者是其征兆。更具体而言，“标志物”或“生物标志物”是与特定生理状态或过程(无论正常还是异常)的存在相关的解剖参数、生理参数、生化参数或者分子参数。生物标志物可以包括小分子、肽、蛋白质和核酸。

与对个体中的正常过程或者不存在疾病或其它状况进行指示或者是其征兆的该生物标志物的表达水平或表达值相比，通常将生物标志物描述为过表达、表达不足或差异性表达。因此，生物标志物的“过表达”、“表达不足”和“差异性表达”也可以是指相对于生物标志物的“正常”或“对照”表达水平的变化。

使用现有技术的蛋白质组学(综合性蛋白质鉴定方法)来鉴定与肺结核相关的尿诊断性生物标志物(11,12)。通过对从患有确定的肺结核、推定的潜伏性结核分枝杆菌感染(LTBI)和推定的非-TB/非-LTBI的患者收集的汇集尿样品和单个尿样品进行蛋白质组学分析，鉴定出指示TB疾病的10种外源性M.tb蛋白、以及21种人蛋白和7种免疫相关人蛋白的组。

在尿中鉴定为TB生物标志物的M.tb蛋白包括Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c。更优选的TB生物标志物是对于活动性TB疾病具有特异性的Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c和Rv1161，以及对于潜伏性TB感染具有特异性的Rv1759c、Rv2126c和Rv3202c。

在尿中鉴定为候选TB生物标志物的人蛋白是膜联蛋白A5(P08758)、S-抑制蛋白(P10523)、钙粘蛋白-1(P12830)、钙结合蛋白(P05937)、Cornulin(Q9UBG3)、Cubilin(O60494)、桥粒斑蛋白(Desmoplakin)(P15924)、肝配蛋白(Ephrin)A型受体4(P54764)、脂肪酸结合蛋白(P05413)、血小板糖蛋白Ibα链(P07359)、血小板糖蛋白VI(Q9HCN6)、外皮蛋白(Involucrin)(P07476)、淋巴管内皮透明质酸受体(Q9Y5Y7)、主要朊病毒蛋白(P04156)、神经节苷脂GM2活化剂(P17900)、粘结蛋白聚糖-1(Syndecan-1)(P18827)、Shroom3蛋白(Q8TF72)、小的富脯氨酸蛋白(Q9UBC9)、肿瘤坏死因子(P08138)、酪氨酸-蛋白激酶受体(P30530)和角蛋白(P02533)。

在尿中被鉴定为候选TB生物标志物的免疫相关人蛋白是IGKC、RBP4、PTGDS、ORM1、IGCL2、AMBP和SECTM1。

这些生物标志物可用于开发用于结核病的基于尿的快速护理现场诊断测试，特别是在发展中国家中。

与其它商业上可利用的方法不同，本方法能够区分活动性结核病和潜伏性结核病，这对于确定受试对象的治疗是重要的。活动性结核病是在具有活动性结核病的临床和放射性特征的受试对象中，其中生物流体或组织对于结核分枝杆菌为涂片显微镜阳性或培养物阳性的疾病状态，或者其中结核分枝杆菌能够通过核酸扩增技术检测到的疾病状态；经常存在体质性症状。潜伏性结核病感染是在人组织中存在可能的活结核分枝杆菌，但是个体无症状，并且不具有活动性疾病的临床-放射性特征。

对个体尿中一种或多种生物标志物的存在的检测例如能够用于如下目的：允许早期诊断TB，允许诊断潜伏性TB感染，检测到后即刻治疗TB，对治疗后个体中的TB的未来后果进行预后，监视治疗后的TB复发，和/或预测可能会从潜伏性感染发展至活动性疾病的对象。

非常重要的是，所述方法还可以在数分钟内提供结果，这与需要将样品温育数小时的其它测试不同。在临床背景中重要的是快速精确地诊断疾病。此外有益的是，具有能够容易地在护理现场(例如在诊疗室、诊所、医院病房，或如野外或住宅等最小资源的情境)使用的诊断方法。

为了提供综合性测试并减少假阴性结果，所述方法可以测试个体尿样品中两种以上生物标志物的组的存在。在本发明的各种实施方式中，所述组包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种等生物标志物。该组可以称为生物特征组。在一种实施方式中，检测来自所述组的一种标记足以进行TB、潜伏性TB感染的诊断。

用于检测生物标志物的任何合适方法可用于本发明中。例如，可以使用能够与生物标志物特异性结合的适体或抗体或其它捕获剂来检测来自受试对象的尿样品中一种或多种生物标志物的存在。合适的捕获剂的实例是本领域公知的，并且包括但不限于抗体、亲和体(affybody)、锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、核酸适体、经修饰的核酸适体、肽、经修饰的肽、碳水化合物配体、合成配体或合成聚合物。

通常而言，捕获剂与本发明的生物标志物的结合会通过使用合适的指示剂系统(例如当捕获剂与生物标志物结合时改变颜色的生色指示剂)而检测，从而表明患者具有活动性肺结核。合适的指示剂系统是本领域公知的，并且包括但不限于量热指示剂、电化学指示剂、生色指示剂、光学指示剂、荧光指示剂或放射性标记指示剂。作为选择，捕获剂与生物标志物的结合可以通过例如电学(例如基于单壁碳纳米管的方法)、声学(基于石英晶体微量天平的方法)、光学(表面增强拉曼散射光谱)或机械(例如基于硅悬臂-或原子力显微镜的方法)信号而直接检测。

对所关注生物标志物的检测可以形成集成微流体装置的一部分或侧向流“带检测(striptest)”检验用品的一部分。

还想到的是，可以开发“排除”测试，其中，检测到在LTBI患者中更普遍的生物标志物表示所述受试对象具有LTBI而不是TB。

在尿自身中检测生物标志物，不需要过夜抗原刺激(如一些其它方法所需)。

例如可将尿样品可施加至类似于妊娠测试和其它尿分析测试中通常使用的类型的带，所述带包括对生物标志物具有特异性的捕获剂和用于检测生物标志物与抗体的结合的生色指示剂。

所述带可以包括用于一种或多种生物标志物的适体或抗体或其它捕获剂。

来自该带测试的结果可以在将样品施加至带的数分钟(例如2分钟至15分钟)内获得。

还可以提供包含适体或抗体或其它捕获剂、生色指示剂和使用说明书的试剂盒。

现在通过以下非限制性实例更详细地描述本发明。

实施例

实施例1：对选择性地存在于来自活动性TB、潜伏性TB感染或非TB疾病患者的尿样品中的源自结核分枝杆菌的蛋白质的鉴定

方法

材料

乙腈和甲酸都是HPLC分析级，并且购自ThermoFisherScientific(Waltham,MA)。使用Mili-QUVPlus水纯化系统产生18.0MΩ水。二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵和碘乙酰胺(IAA)都购自SigmaAldrich(St.Louis,MO,美国)。胰蛋白酶购自Promega(Madison,WI,美国)。

尿收集和临床案例定义

尿样品收集自在南非诊所看到的患者，他们怀疑感染有TB(图1a)。从所有参与者获得知情同意书，并且该研究经过开普敦大学(UniversityofCapeTown)的健康科学人类研究伦理委员会批准。将具有HIV共感染的患者从本研究排除。基于具有与TB感染一致的临床表现、阳性M.tb培养物和阳性涂片，将明确的TB患者分类。将推定的潜伏性TB(LTBI)患者被定义为具有阴性M.tb培养物、阴性涂片、两个阳性干扰素γ释放检验测试结果(IGRA；例如QuantiFERON-TBGold-in-Tube)和结核菌素皮肤试验(TST)阳性。最后，推定的非结核病(非-TB/非-LTBI)组具有阴性M.tb培养物、阴性涂片和两个阴性IGRA。

样品制备

收集总共63个尿样品。根据临床群组(clinicalcohort)(TB(n＝21)；LTBI(n＝24)；和推定的非-TB/非-LTBI(n＝18))将尿样品分组。使用BradfordAssay检验对个体尿样品获得蛋白质浓度读数。从各患者获得相等量的蛋白质，然后基于患者组进行汇集(n_汇集＝6个患者；在各汇集样品中每个患者约10ml尿)。对于TB和非-TB/非-LTBI组，制备三个生物重复汇集物(即，每组6个患者尿样品，3个生物重复；每组总共18个患者)；对于LTBI组制备4个生物重复。然后对于所有组和生物重复将汇集的尿样品蛋白浓度标准化。另外，类似地制备一组三个个体TB患者尿样品，并将其标准化。

在15ml50kDa分子量阈值(MWCO)过滤器上将所有汇集样品或个体样品浓缩，以除去丰富的更高分子量的人蛋白-包括血清白蛋白、尿调节素和免疫球蛋白-否则这会干扰低丰度蛋白的鉴定。然后在15ml3kDaMWCO过滤器上然后在0.5ml3kDaMWCO过滤器上浓缩流动通过物，以减少体积。收集50kDa～3kDa的蛋白质，在10％SDS-PAGE凝胶上分离来自各个个体样品或汇集样品的约30μg总蛋白质。剪下来自SDS-PAGE凝胶的各泳道，切成10个切片，根据标准规程对各凝胶切片进行凝胶内胰蛋白酶消化；从凝胶切片洗脱胰蛋白酶肽，在LC-MS/MS分析之前并脱盐(图1b)。

HPLC

使用ProxeonEasyn-LCII(ProxeonBiosystems,Odense,Denmark))进行色谱分离。使用ProxeonEasyC18捕捉柱(2cm,ID100μm,5μm,C18)和分析柱(10cm,ID75μm,3μm,C18)进行梯度色谱分离。用双流动相系统(A-具有0.1％甲酸的水；B-具有0.1％甲酸的乙腈)以300nl/分钟的流速在室温运行色谱；胰蛋白酶肽用以下梯度从柱洗脱：0.00分钟/5％B；5.00分钟/0％B；120分钟/80％B。

质谱

使用LTQ-OrbitrapVelos^TMPro质谱仪(ThermoFisher,SanJose,CA)进行鸟枪蛋白质组学分析，通过来自ProxeonHPLC系统(参见HPLC)的流动注射分析(FIA)进行样品引入。在以下条件下使用正离子电喷雾电离(+ESI)：离子喷雾电压1500V，源温度200℃。对于碰撞诱导解离(CID)分析，使用氦作为碰撞气体，碰撞气体压力为1.2毫托(mTorr)且碰撞能量可变。

数据分析

使用Msconvert(默认设置,ProteoWizard,2.1版(13))产生峰列表。利用以下检索算法使用多算法数据库驱动的检索策略：X！Tandem(Cyclone2011.12.010版(14))和Omssa(15,16)。使用SearchGUI(1.11.0版；(17))解析X！Tandem和Omssa，SearchGUI是一种开源图形用户界面，用于同时配置和运行两种蛋白质组学鉴定检索引擎。使用PeptideShaker(0.19.0版；(18))来将来自X！Tandem和Omssa的数据可视化。表1显示用于各算法的过滤和检索参数。在谱图匹配检索中使用具有总共27,112个实体的人(UniProt_SwissProt；9606_1185_22Jan2012)和结核分枝杆菌H37Rv(Tuberculist；2012年1月)组合数据库；对于在PeptideShaker中的伪发现分析而言，通过将在靶数据库中的各实际序列反转而创建诱饵数据库。此处所示的结果符合蛋白质组学数据巴黎指南(19)。

表1.所用的数据库检索参数以及生物信息学算法X！Tandem和Omssa的检索总结

·^*对于各个算法，基于1％的使用诱饵数据库检索创建的伪发现率(FDR)来过滤肽谱匹配(PSM)。

·显示的各“平均”参数是来自合并的X！Tandem数据和合并的Omssa数据的平均组合列表。

结果

使用多算法数据库检索策略来分析原始质谱数据。检索总结可见于表1，其显示肽谱图匹配(PSM)、3个患者组(非-TB/非-LTBI,LTBI和TB)中鉴定的肽和蛋白质组的平均数量。PSM的平均数对于X！Tandem而言高于Omssa，因此X！Tandem鉴定出1332种肽和524种蛋白质，与之相比，Omssa鉴定出830种肽和412种蛋白质。该分析中使用的最终数据是来自用于各患者组的两种算法的合并的非冗余的、归纳的蛋白质列表(20)。图2a显示突出在三个患者组鉴定出的重叠和独特的人和M.tb蛋白的维恩图。在3个群组(对于非-TB/非-LTBI、LTBI和TB分别为455、658、566)发现平均560种蛋白。来自各患者组的数据显示在所有三个组中看到所鉴定蛋白质的约57％(319/560)。使用该数据集，解决了以下问题：(1)外源性M.tb-特异性蛋白能否在来自感染有肺结核的患者的尿中鉴定出；(2)能否鉴定出与TB感染相关的人蛋白质的组；和(3)能否观察到与结核病相关的普通人尿蛋白方面的显著变化？

在患者尿样品中能够鉴定出外源性M.tb蛋白

在各种患者尿样品鉴定出总共26种M.tb蛋白(图2b)。这些M.tb蛋白似乎不具有任何共同功能，并且最初发现是膜相关或定位至细胞外空间(表2)。令人惊奇地是，在所有疑似TB患者中均鉴定出M.tb蛋白。考虑该结果，使用DB工具包(21)进行BLAST分析以将所鉴定的M.tb蛋白匹配至Uniprot数据库中的人或细菌蛋白质；该分析揭示，所鉴定M.tb蛋白中的6/26可以与来自非结核分枝杆菌和/或其它放线菌的蛋白质匹配，以及与来自M.tb-复合体内的生物体的蛋白质匹配(表2)。在表2中，与除M.tb或M.tb-复合体之外的其它物种匹配的那些肽鉴定为“分枝杆菌相关”。据报道M.tb基因组在其属内非常保守(22)，因此不足为奇的是，对于这26种M.tb肽未观察到与任何人蛋白的同源性。活动性TB患者组(包括一式三份的生物重复汇集样品和三个独立的样品)独有的是，在尿样品中鉴定出8种之前未报道的M.tb-特异性蛋白和2种分枝杆菌相关蛋白。令人感兴趣的是，在TB和/或LTBI组中鉴定出PE-PGRS家族的数种亚型——它们是富聚糖的细胞壁蛋白(表2)。

表2.在来自活动性TB和LTBI患者的人尿样品中鉴定出的M.tb-特异性蛋白(包括结核分枝杆菌复合体)和分枝杆菌相关蛋白

·如果鉴定中的肽仅与在结核分枝杆菌复合体中发现的蛋白质匹配(mapped)，则将蛋白质归类为M.tb-特异性。

·如果鉴定中的肽既与在UniProt人和细菌组合数据库中发现的M.tb-特异性蛋白匹配也与其它非感染性分枝杆菌和/或其它蛋白质匹配，则将蛋白质归类为分枝杆菌相关。

·*该蛋白通过与M.tb和副瘰疬分枝杆菌(M.parascrofulaceum)都匹配的肽鉴定出。

该蛋白通过两种不同的肽鉴定出，其中一种是M.tb-特异性的，另一种是分枝杆菌相关的。

该蛋白通过与M.tb和海洋分枝杆菌(M.marinum)都匹配的肽鉴定出。

·^§该蛋白基于3种肽鉴定出，它们都是M.tb-特异性的。

·表3和4含有详细的肽统计学和同源性匹配信息。

表3.来自在以下组中的疑似TB患者的尿中鉴定出的推定M.tb生物标志物的肽：活动性TB和LTBI

表4.在疑似TB患者的尿中鉴定出的M.tb肽的BLAST分析(报道的蛋白质与通过质谱鉴定出的肽具有100％同源性匹配)

在患者尿样品中发现的蛋白质的功能分类

为了基于蛋白质的细胞区室化(CC)、分子功能(MF)和生物进程(BP)将人尿蛋白分类，进行基因本体论(GeneOntology)(GO)富集分析(23,24)。将“DatabaseforAnnotation,Visualization,andIntegratedDiscovery”(DAVID)途径分析用于GO富集分析。使用DAVID来基于可能性预测定理确定对于特定功能而言样品富集的程度，其中算法预测给定蛋白质样品会从完整蛋白质组被随机选择的可能性。在该分析中，将背景基因产物选择为推定的非-TB/非-LTBI组。

图3显示当将推定的非-TB/非-LTBI组设定为背景基因产物时富集的GO术语(term)，其包括用于TB组的10种GO-BP术语加上3种GO-CC术语，用于LTBI组的2种GO-BP术语加上2种GO-CC术语。令人感兴趣的是，对于任一组GO-MF都没有显著地富集。对于TB和LTBI组，最显著的GO-BP术语分别是“对刺激物的响应(ResponsetoStimulus)(GO:0005576)”和“免疫响应(ImmuneResponse)(GO:0006955)”，而对于这两个组最显著的GO-CC术语是“胞外区(ExtracellularRegion)(GO:0005576)”。

总计，这17种富集的GO术语包含一共1230种冗余蛋白。潜在生物标志物的该列表以下述方式向着能够预测结核病的蛋白质的更少的组(panel)减少：首先，使包含用于TB组的最显著的GO-BP术语(“对刺激物的响应(GO:0005576)”)的蛋白质聚簇(cluster)；第二，使用于LTBI组的两种GO-BP术语(“免疫响应(GO:0006955)”和“防御响应(GO:0006952)”)的蛋白质聚簇；最后，将来自TB和LTBI组的所有GO-CC术语和相应的蛋白质聚簇在一起，因为此处在术语和蛋白质方面存在显著的重叠。图4显示这些聚簇的蛋白质(clusteredprotein)的维恩图，并且揭示在“对刺激物的响应(GO:0005576)”组中的21种蛋白质对于该术语是独特的。因此推测这21种独特的人蛋白与活动性肺结核有关，并且列于表5中。GO术语和蛋白质的完整列表可见于表6中。

表5.从富集的GO-BP术语“对刺激物的响应(GO:0005576)”鉴定出的人蛋白

在活动性-Tb患者尿样品中免疫相关蛋白差异性表达

标准化图谱丰度因素(NSAF)是无标记的谱图计数方法，其能够对整个样品的蛋白丰度进行相对定量。谱图丰度通过将各蛋白的鉴定肽谱相加，将该总和标准化至蛋白长度，然后进一步标准化至给定样品中所有蛋白丰度的总和，从而计算出谱图丰度。此处，使用NSAF值来确定从TB疑似者观察到的在普通人尿蛋白中的差异性蛋白质表达的水平。ANOVA检验显示，当使用两种生物信息学算法中任一种时，TB组具有上调水平的免疫球蛋白κ链C蛋白(IGKC；登录号P01834)、视黄醇结合-4蛋白(RBP-4；登录号P02753)、α-1-酸性糖蛋白1(ORM1；登录号P02763)和Igλ-2链C(IGLC2；P0CG05；仅Omssa)，它们与非-TB/非-LTBI组相比具有统计学显著性(p≤0.05)(图5)。对于IGCK和ORM1(仅X！Tandem)，LTBI组与非-TB/非-LTBI组之间相比，也观察到统计学显著性差异(p≤0.05)。虽然当使用Omssa时发现的LTBI组与非-TB/非-LTBI之间在ORM1丰度方面的差异未达到统计显著性，但其趋势与使用X！Tandem时观察到的趋势相似。

相反，在X！Tandem数据集中，在TB组中与非-TB/非-LTBI组相比，蛋白质前列腺素-H2D-异构酶(PTGDS；登录号P41222)、分泌的跨膜蛋白1(SECTM1；登录号Q8WVN6)和α-1微球蛋白(AMBP；登录号P02760)显著地(p≤0.05)下调(图5a)；在Omssa数据集中对于PTGDS观察到相似模式的相对表达值(图5b)。

讨论

初始的尿蛋白质组学研究显示，例如尿调节素和白蛋白(据报道分别为总尿蛋白质组的60％和20％(25))等高分子量的高丰度人蛋白，遮掩了低丰度蛋白的信号，导致鉴定出约50种蛋白(数据未显示)。但是，注意到M.tb蛋白的平均分子量仅为约20kDa(图6)，发现简单地利用分子量截留过滤(molecularweightcutofffilter)来除去高丰度的较高分子量的人蛋白使得能够在三个患者组鉴定出平均560种蛋白，并将其定量。对于无标记的定量尿蛋白质组学分析(27)，该图可完全与由Mann等设定的约600种蛋白鉴定的基准相当，虽然某种程度上少于报道了在人尿样品中约1,500种蛋白质的非定量蛋白质组学分析(26)。令人感兴趣的是，能够被鉴定出“CoreUrinaryProteome”(26)，其为一组20种蛋白质，据报道所述蛋白质总是存在于健康个体的尿中，因此充当针对其它公开尿蛋白质组学研究的有用参照检验。

使用该实验途径，在各种患者尿样品中鉴定出26种M.tb蛋白，其中10种对于TB组是独特的，6种对于LTBI组是独特的(表2；图2)。考虑到在潜伏感染过程中受感染在巨噬细胞内的结核分枝杆菌的代谢状态的持续不确定性(27)，在来自LTBI患者中观察到独特的M.tb肽也是合理的。但是，注意到在LTBI患者尿中独特地鉴定出的此类肽的数量低于在活动性TB患者中独特性地发现的肽的数量，这符合预期。另外，PE-PGRS蛋白家族的不同亚型在TB和LTBI患者组中独特地鉴定，在两个组中共有一种亚型。该蛋白家族由超过10种不同的同源物组成，所述同源物主要是M.tb细胞壁组分或由其分泌；此类PE-PGRS蛋白的时间表达模式(28)，与该家族的抗原性多样性结合，能够使该家族充当触发针对新型M.tb感染的起始适应性免疫响应的诱饵(29)。重要的是，由于在本研究中该蛋白家族中的数种肽已经在活动性TB和LTBI患者尿样品中鉴定出，它们可能代表着除了对活动性TB组具有独特性的10种M.tb蛋白之外的其它令人感兴趣的生物标志物候选物。

在假设的非-TB/非-LTBI组中鉴定出三种独特的M.tb蛋白是预料不到的，但还重要的是注意到目前对于预测LTBI没有可信赖的测试。例如，Rangaka等报道了IGRA对于预测活动性TB疾病都不理想，更遑论LTBI(3)。因此可能的是，非-TB/非-LTBI组中的一些患者事实上确实具有潜伏性TB感染；需要进一步的工作来评价该可能性。但是，在活动性TB和推测的LTBI患者尿样品中选择性鉴定出的M.tb蛋白代表着重要的观察结果，并且值得对于其作为用于活动性结核病感染的候选尿生物标志物进行研究。例如，令人讶异的是，在所有4种LTBI汇集样品中以及在6种TB样品的2种中都观察到源自M.tb蛋白Rv2981c(肽序列：VDFFLTDDGPVINEINTMPGFTTISMYPR(SEQIDNO:1))的相同肽，但是在非-TB/非-LTBI样品中都没有观察到，这表明该肽可能代表比IGRA更为直接的用于LTBI的量度(表3)。类似地，在发现蛋白质组学实验中，在6种TB样品的4种中鉴定出来自Rv0765c(肽序列：GCVVVNMEIQPEAPLR(SEQIDNO:2))的相同肽，但是在所有4种LTBI样品中均未鉴定出。同样地，在4种LTBI样品中的3种以及6种TB样品中的1种中鉴定出来自Rv1235(肽序列：VTIGGLNLAVAK(SEQIDNO:3))的相同肽。在所有情况下，需要进一步的验证研究来确定在来自更大群组的TB疑似者的个体尿中也观察到此处鉴定的26种M.tb蛋白质的频率。但是，令人鼓舞的是，初始数据对于这些蛋白质中的至少3种：Rv0765c、Rv1235和Rv2981c，已经以高频率给出了强启示。

GO富集分析(23,24)旨在基于三个规定的本体论术语：GO-BP、GO-CC和GO-MF聚集蛋白质。此处，观察到17种显著富集的GO术语，其在数据集中共含有1230种冗余蛋白质(图4)。使用该数据集，从最显著的GO富集术语“对刺激物的响应(GO:0005576)”挖掘出一组21种人蛋白。因此合理的是，使用这组21种人蛋白可以实现TB疾病状态的区分；但是，需要进一步的研究来确定该组的真实区分能力。

在TB组中显著富集的另外的GO术语可以产生能够区分结核病的另外的蛋白质组。例如，术语“稳态过程”占据针对活动性TB患者的富集GO-BP术语的列表的首位(图3)，这令人感兴趣，因为通常认为尿蛋白不会被稳态控制，因为尿蛋白在该生物液中不具有生理作用，并且可以根据膳食、环境、疾病和/或其它因素而改变(30,31)。因此，在活动性TB患者尿中参与稳态过程的蛋白质的过度呈递(over-representation)表明在感染位置出现稳态，并且表示该促炎性响应可以在尿中被追踪。在该背景下，Shabanna等指出，在鼠类TB模型中，缺乏稳态趋化因子在敲弱小鼠模型中延迟肉芽瘤形成和保护免疫性(32)。该GO-BP术语在此处研究的其它疑似TB患者组中未观察到富集，并且似乎是尿中观察到的稳态控制的第一指示。

分析进一步鉴定了7种免疫相关人蛋白(IGKC、RBP4、PTGDS、ORM1、IGCL2、AMBP和SECTM1)，其中6种在活动性TB尿样品中差异性表达(图5)。许多这些蛋白之前已经观察到与TB感染相关。例如，两个相关研究表明，RBP4是TB感染的标志物，在感染有牛分枝杆菌(M.bovis)的牛血清中发现RBP4的水平升高(33)，在人全血上清液中观察到RBP4差异性表达(34)。另外，SECTM1已经显示是CD7的同源蛋白(cognate)，是在T细胞、NK细胞和前B细胞上发现的蛋白质，而SECTM1的功能未能良好地确定(35)，SECTM1同源蛋白已经报道在TB感染中在体外刺激在人NK细胞上的CD25、CD54和CD69的上调。此外，还观察到AMBP的血清水平在具有亚临床牛分枝杆菌感染的牛中水平升高。虽然在来自具有细菌性脑膜炎的患者的CSF样品中已经报道了PTGDS的水平降低(36)，据申请人所知之前在PTGDS和TB之间没有建立关联。

基于这些分析，据假设免疫相关蛋白IGKC、RBP4、PTGDS、AMBP、ORM1、IGCL2和SECTM1可以共同使用来诊断患者尿样品中的TB病。例如，观察到在活动性TB患者中与其它两个患者组相比RPB4的丰度显著增加可以为用于TB的新型“纳入(rule-in)”测试的基础，而在活动性TB患者中与LTBI患者相比PTGDS的丰度显著减少可以为用于TB的“排除(rule-out)”测试提供基础(图5)。但是，重要的是首先确定此类生物标志物是否能够区分TB和其它呼吸疾病，例如哮喘、肺气肿、肺炎或结节病。

实施例2:对患者尿样品中存在的区分活动性TB、潜伏性TB感染和非-TB/非-LTBI疾病的源自结核分枝杆菌的蛋白质组的鉴定

整理来自于实施例1的关于在汇集的尿样品和个体尿样品中观察到源自个体M.tb蛋白的胰蛋白酶肽的频率的数据，并将其示于表7，从中表面看起来没有观察到一种M.tb蛋白存在于来自给定组的每个样品中而在所有其它样品中不存在(例如，在所有活动性TB患者尿样品中存在，但是在所有LTBI和非-TB/非-LTBI样品中不存在)。需要注意的是，在各种尿样品观察到具有最高频率的蛋白质显示，在三个患者组之间区分相对不良。例如，Rv0765c在5个TB样品中的4个(由2个汇集样品中的2个和3个个体样品中的2个组成)中观察到，但是在3个非-TB/非-LTBI样品中的2个中也观察到。类似地是，Rv1235在4个LTBI样品中的3个中观察到，但是在1个TB样品和1个非-TB/非-LTBI样品中也观察到。同样，Rv2981c在所有4种LTBI样品中观察到，但是在2个TB样品中也观察到。因此，这些频繁观察到的M.tb蛋白没有精确地将活动性TB与LTBI或非-TB-非-LTBI病区分开。

表7.在疑似TB患者的尿中观察到M.tb蛋白的频率(在该表中，“Y”表示“观察到”，空白表示“未观察到”)

但是，对表7的更近一步检查显示，在患者尿样品中观察到的M.tb蛋白生物标志物的组确实为3个组中的患者之间提供区分。因此，例如，使用由Rv0014c、Rv0578c、Rv1161、Rv1664、Rv1977、Rv2280、Rv2490c、Rv2694c和Rv2748c组成的生物标志物组，通过在尿样品中观察到来自该组的至少一种M.tb蛋白，鉴定出了所有5个TB样品(TB1、TB2、TB96、TB188和TB88)，而不是LTBI或非-TB/非-LTBI样品。此外，通过多个M.tb蛋白生物标志物来鉴定个体样品，增加了将样品指认为活动性TB组的置信度(例如通过来自该组的3种M.tb蛋白分别鉴定样品TB1和TB2)。

类似地，使用由Rv2126c、Rv1759c、Rv0668、Rv3345c、Rv1464和Rv3202c组成的生物标志物组，通过在尿样品中观察来自该组的至少一种M.tb蛋白而能够鉴定所有4种LTBI样品，而不是无TB或非-TB/非-LTBI样品。此外，通过多个M.tb蛋白生物标志物鉴定个体样品，增加了将样品指定至LTBI的置信度(例如通过来自该组的2种M.tb蛋白分别鉴定样品LTBI3和LTBI4)。

因此，该实施例清楚地说明，通过测试尿样品的对活动性TB病或潜伏性TB感染具有特异性的至少两种M.tb蛋白生物标志物的存在，可以基于检测尿样品中至少一种所述生物标志物而确定受试对象是否具有TB病或LTBI。

实施例3:在患者尿样品中对源自结核分枝杆菌的蛋白的靶向鉴定

样品制备

从召集自3个大约相等大小的患者组的64个个体TB疑似者收集尿样品：同实施例1，患者组是活动性TB、LTBI和非-TB/非-LTBI；所有患者都是HIV阴性的。基本上如实施例1所述，将来自个体尿样品(每个样品10ml)的蛋白质首先通过15ml50kDa分子量阈值(MWCO)的过滤器而分级分离，然后使用15ml3kDaMWCO过滤器然后0.5ml3kDaMWCO过滤器将滤液浓缩。使用胰蛋白酶通过过滤器辅助样品制备(FASP)法根据文献策略(37)将来自各样品的蛋白质(约30μg)蛋白水解。对于各个体样品回收胰蛋白酶肽，并在LC-MS/MS分析之前脱盐。然后汇集来自64个样品中每个的相同量的肽以形成参照标准物。

关于汇集的参照标准物的平行反应监视检验

使用基于质谱的“平行反应监视”(PRM)检验(38)来确定在更大集合(n＝64)的个体TB疑似者尿样品中于实施例1鉴定的各M.tb蛋白的出现频率。简言之，在PRM检验中，确定各完整胰蛋白酶肽(“前体离子”)的质荷比(m/z)，以及在质谱仪中前体离子的高能碰撞解离(HCD)后产生的至多10个片段离子。观察到的前体离子的片段化模式允许确认胰蛋白酶肽的序列(即身份)，而测定的片段离子的合计离子强度允许进行胰蛋白酶肽的相对和绝对定量(38)。本文各前体离子-片段离子对称为PRM检验“跃迁(transition)”。

使用软件包Skyline(39)，针对140种胰蛋白酶肽开发了PRM检验，所述140种胰蛋白酶肽源自在实施例1中鉴定出的26种M.tb蛋白的组。使用配备有Ultimate3000RSnanoUPLC(Dionex)和纳米喷雾源(ThermoScientific)的Q-ExactiveOrbitrap质谱仪(ThermoScientific)，对上述汇集的参照标准物计划并一式三份地进行所有PRM检验。在使用纳米柱(50cm,ID75μm,5μm珠；C18)进行质谱之前进行胰蛋白酶肽的梯度色谱分离。用双流动相系统(A-具有0.1％甲酸的水；B-具有0.1％甲酸的乙腈)以300nl/分钟的流速在室温进行色谱；胰蛋白酶肽用以下梯度从柱洗脱：0.00分钟/5％B；5.00分钟/0％B；180分钟/80％B。以约1500V的喷射电压和200℃的源温度进行阳离子电喷雾。对于更高能量的碰撞诱导解离(CID)，使用氦作为碰撞气体，碰撞气体压力为1.2毫托且碰撞能量固定。所有获得的质谱数据在Skyline(39)中分析。

对在所有64个TB疑似者尿样品中使用的PRM检验的组的削减

基于对汇集的参照标准物获得的起始PRM检验数据，将26种M.tb蛋白的组(起初由140种胰蛋白酶肽代表)削减至13种M.tb蛋白(由17种胰蛋白酶肽代表)的更小组(表8)，所述13种M.tb蛋白在所有3个技术性重复中在汇集参照标准物中以最高置信度被鉴定出。用于2种肽的代表性PRM数据示于图7。

表8.在汇集的TB疑似尿参照标准物中通过PRM检验以高置信度鉴定出的M.tb蛋白

对个体TB疑似者尿样品进行的PRM检验

然后对10个个体TB疑似者尿样品一式三份地进行用于源自这些17种M.tb蛋白的胰蛋白酶肽的PRM检验，数据在Skyline中分析(39)。表9显示该PRM分析的结果。此处，该表中的数值不反映在各样品中观察到的各肽的相对量。反而，该表中的数值反映在PRM检验中在各样品的所有三个技术性重复中对于各肽观察到的跃迁的值，表示为在PRM检验中每个肽靶向的跃迁的总值的百分比(即，值为1意味着在该样品的所有三个技术性重复中观察到所有的靶向跃迁)。在表9中，将>0.85(即，在给定样品的所有三个技术性重复中观察到所有靶向跃迁的>85％)的值视为该样品中的该特异性肽鉴定为阳性。

从表9显见，在10个样品中任一个中仅可再现地观察到在这些PRM检验中所靶向的M.tb蛋白的子集。另外显见的是，在所有10个样品中没有可再现地观察到1个在这些PRM检验中所靶向的M.tb蛋白，这在由活动性TB、LTBI和非-TB/非-LTBI患者样品组成的双盲群组中是所预期的。

但是，从表9显然看出，在这些靶向的PRM检验中，使用包含Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c和Rv1161(它们之前各自仅在活动性TB患者样品中观察到，而在LTBI或非-TB/非-LTBI中未观察到)的6种M.tb蛋白生物标志物的组，基于在这些样品的每一个中通过PRM检验鉴定出来自该组的3种以上独特的M.tb蛋白生物标志物的事实，10个样品中的6个可以被鉴定为可能的TB病(表10)。但是，值得注意的是，将给定样品鉴定为可能的TB病的来自该组的M.tb蛋白生物标志物的特定集合视样品的不同而变化，因此证实了这种基于组的手段的效力。

另外，显而易见的是，基于在各样品中通过PRM检验观察到1种以上独特的M.tb蛋白生物标志物的事实，包含Rv1664、Rv1977和Rv2490c的3种M.tb蛋白的较小生物标志物组，将相同的6种样品鉴定为可能的TB病(表10)。

表10.通过三种以上独特的“仅TB”蛋白质鉴定的来自PRM检验的样品

因此，该实施例清楚地说明，通过测试尿样品的对活动性结核病具有特异性的至少两种M.tb蛋白生物标志物的存在，可以基于检测尿样品中的至少一种生物标志物而确定受试对象是否可能具有结核病。

参考文献:

1.WHO.RapidImplementationoftheXpertMTB/RIFdiagnostictest.2011；Avaliableat:http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241501569_eng.pdf.

2.TheronG,PeterJ,VanZyl-SmitR,MishraH,StreicherE,MurrayS,DawsonR,WhitelawA,HoelscherM,SharmaS,PaiM,WarrenR,DhedaK.EvaluationoftheXpertMTB/RIFassayforthediagnosisofpulmonarytuberculosisinahighHIVprevalencesetting.Am.JRespirCritCareMed2011；184:132–40.

3.RangakaMX,WilkinsonKA,GlynnJR,LingD,MenziesD,Mwansa-kambafwileJ,FieldingK,WilkinsonRJ,PaiM.Predictivevalueofinterferon-γreleaseassaysforincidentactivetuberculosis:asystematicreviewandmeta-analysis.LancetInfectDis2012；12:45–55.

4.PeterJ,GreenC,HoelscherM,MwabaP,ZumlaA,DhedaK.Urineforthediagnosisoftuberculosis:currentapproaches,clinicalapplicability,andnewdevelopments.CurrOpinPulmMed2010；16:262–70.

5.PaiM,MinionJ,SteingartK,RamsayA.Newandimprovedtuberculosisdiagnostics:evidence,policy,practice,andimpact.CurrOpinPulmMed2010；16:271–84.

6.KeertanD,MortenR,GrantT,JonathanP,CheongYW.Point-of-carediagnosisoftuberculosis-past,presentandfuture.Respirology2013；18:217-232.

7.RosenkrandsI,WeldinghK,JacobsenS,Veggerby-HansenC,FlorioW,GianetriI,AndersonP.MappingandidentificationofMycobacteriumtuberculosisproteinsbytwo-dimensionalgelelectrophoresis,microsequencingandimmunodetectionProteomicsand2-DE.Electrophoresis2000；21:935–948.

8.AgranoffD,Fernandez-ReyesD,PapadopoulosMC,RojasSa,HerbsterM,LoosemoreA,TarelliE,SheldonJ,SchwenkA,PollokR,RaynerCFJ,KrishnaS.Identificationofdiagnosticmarkersfortuberculosisbyproteomicfingerprintingofserum.Lancet2006；368:1012–21.

9.KashinoSS,PollockN,NapolitanoDR,RodriguesV,Campos-Netoa.IdentificationandcharacterizationofMycobacteriumtuberculosisantigensinurineofpatientswithactivepulmonarytuberculosis:aninnovativeandalternativeapproachofantigendiscoveryofusefulmicrobialmolecules.ClinandExpImmunol2008；153:56–62.

10.PollockNR,MacoveiL,KanunfreK,DhimanR,RestrepoB,ZarateI,PinoPa,Mora-GuzmanF,FujiwaraRT,MichelG,KashinoSS,Campos-NetoA.ValidationofMycobacteriumtuberculosisRv1681proteinasadiagnosticmarkerofactivepulmonarytuberculosis.JClinMicrobiol2013；doi:10.1128/JCM.03192-12.

11.MehaffyMC,Kruh-GarciaN,DobosKM.ProspectiveonMycobacteriumtuberculosisproteomics.JProteRes2012；11:17–25.

12.ZhangL,LowrieD,ZhouH.Proteomicprogressinstudyingtuberculosisfrom2010to2011.JournalofBiophysicalChemistry2011；02:395–400.

13.KessnerD,ChambersM,BurkeR,AgusD,MallickP.ProteoWizard:opensourcesoftwareforrapidproteomicstoolsdevelopment.Bioinformatics(Oxford,England)2008；24:2534–6.

14.CraigR,BeavisRC.TANDEM:matchingproteinswithtandemmassspectra.Bioinformatics(Oxford,England)2004；20:1466–7.

15.GeerLY,MarkeySP,KowalakJa,WagnerL,XuM,MaynardDM,YangX,ShiW,BryantSH.Openmassspectrometrysearchalgorithm.JProteRes2004；3:958–64.

16.BarsnesH,HuberS,SickmannA,EidhammerI,MartensL.OMSSAParser:anopen-sourcelibrarytoparseandextractdatafromOMSSAMS/MSsearchresults.Proteomics2009；9:3772–4.

17.VaudelM,BarsnesH,BervenFS,SickmannA,MartensL.SearchGUI:Anopen-sourcegraphicaluserinterfaceforsimultaneousOMSSAandX！Tandemsearches.Proteomics2011；11:996–9.

18.BarsnesH,VaudelM,ColaertN,HelsensK,SickmannA,BervenFS,MartensL.compomics-utilities:anopen-sourceJavalibraryforcomputationalproteomics.BMCBioinformatics2011；12:70.

19.BradshawR,BurlingameA,CarrS,AebersoldR.ReportingProteinIdentificationData.MolCellProteom2006.Avaliableat:http://www.mcponline.org/content/5/5/787.full.pdf.

20.NesvizhskiiAI,AebersoldR.Interpretationofshotgunproteomicdata:theproteininferenceproblem.MolCellProteom2005；4:1419–40.

21.MartensL,VandekerckhoveJ,GevaertK.DBToolkit:processingproteindatabasesforpeptide-centricproteomics.Bioinformatics(Oxford,England)2005；21:3584–5.

22.McGuireAM,WeinerB,ParkST,WapinskiI,RamanS,DolganovG,PetersonM,RileyR,ZuckerJ,AbeelT,WhiteJ,SiskP,StolteC,KoehrsenM,YamamotoRT,Iacobelli-MartinezM,KiddMJ,MaerAM,SchoolnikGK,RegevA,GalaganJ.ComparativeanalysisofMycobacteriumandrelatedActinomycetesyieldsinsightintotheevolutionofMycobacteriumtuberculosispathogenesis.BMCGenomics2012；13:120.

23.HuangDW,ShermanBT,LempickiRa.Bioinformaticsenrichmenttools:pathstowardthecomprehensivefunctionalanalysisoflargegenelists.NucleicAcidsRes2009；37:1-13.

24.HuangDW,ShermanBT,LempickiRa.SystematicandintegrativeanalysisoflargegenelistsusingDAVIDbioinformaticsresources.NatProtoc2009；4:44-57.

25.SchrierR,(Editor)SK.SystemicDiseaseandtheKidney.In:SawayaBP,editor.Wiley,John&Sons,Incorporated；1999.

26.NagarajN,MannM.QuantitativeAnalysisoftheIntra-andInter-IndividualVariabilityoftheNormalUrinaryProteomeresearcharticles.JProteRes2011；10:637–645.

27.Baenaa,PorcelliSa.EvasionandsubversionofantigenpresentationbyMycobacteriumtuberculosis.TissueAntigens2009；74:189–204.

28.MukamolovaGV,TurapovO,MalkinJ,WoltmannG,BarerMR.Resuscitation-promotingfactorsrevealanoccultpopulationoftubercleBacilliinSputum.Am.JRespirCritCareMed2010；181:174–80.

29.BrennanMJ,DeloguG.ThePEmultigenefamily:a“molecularmantra”formycobacteria.TrendsMicrobiol2002；10:246–9.

30.LiQ,FanK,LiR,DaiJ,WuC,ZhaoS,WuJ.Acomprehensiveandnon-prefractionationontheproteinlevelapproachforthehumanurinaryproteome:touchingphosphorylationinurine.RapidCommunMassSpe2010；24:823–832.

31.MarimuthuA,O’MeallyRN,ChaerkadyR,SubbannayyaY,NanjappaV,KumarP,KelkarDS,PintoSM,SharmaR,RenuseS,GoelR,ChristopherR,DelangheB,ColeRN,HarshaHC,PandeyA.Acomprehensivemapofthehumanurinaryproteome.JProteRes2011；10:2734–43.

32.KhaderSa,Rangel-MorenoJ,FountainJJ,MartinoCa,ReileyWW,PearlJE,WinslowGM,WoodlandDL,RandallTD,CooperAM.Inamurinetuberculosismodel,theabsenceofhomeostaticchemokinesdelaysgranulomaformationandprotectiveimmunity.JImmunol2009；183:8004–14.

33.SethM,LamontEa,JanagamaHK,WiddelA,VulchanovaL,StabelJR,WatersWR,PalmerMV,SreevatsanS.Biomarkerdiscoveryinsubclinicalmycobacterialinfectionsofcattle.PloSOne2009；4:e5478.

34.TanakaT,SakuradaS,KanoK,TakahashiE,YasudaK,HiranoH,KaburagiY,KobayashiN,HangNTLe,LienLT,MatsushitaI,HijikataM,UchidaT,KeichoN.Identificationoftuberculosis-associatedproteinsinwholebloodsupernatant.BMCInfectDis2011；11:71.

35.LymanSD,EscobarS,RousseauaM,Armstronga,FanslowWC.IdentificationofCD7asacognateofthehumanK12(SECTM1)protein.TheJournalBiolChem2000；275:3431–7.

36.TumaniH,ReiberH,NauR,PrangeHW,KauffmannK,M,FelgenhauerK.Beta-traceproteinconcentrationincerebrospinalfluidisdecreasedinpatientswithbacterialmeningitis.NeurosciLett1998；242:5–8.

Claims (25)

1.一种从受试对象的尿样品诊断结核病的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)对所述尿样品测试至少两种生物标志物的存在，所述至少两种生物标志物对于活动性结核病(TB)或潜伏性结核感染(LTBI)具有特异性；和

(ii)基于对所述尿样品中的所述生物标志物的至少一种的检测，确定所述受试对象是否具有TB或LTBI，

其中所述生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c组成的组，并且所述方法区分TB与LTBI。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物标志物对于TB具有特异性。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，对所述尿样品测试至少两种生物标志物的存在，所述至少两种生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c和Rv1161组成的组。

4.如权利要求3所述的方法，其中，对所述尿样品测试Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c和Rv1161的存在。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物对于潜伏性结核感染具有特异性。

6.如权利要求1或5所述的方法，其中，对所述尿样品测试至少两种生物标志物的存在，所述至少两种生物标志物选自由Rv1759c、Rv2126c和Rv3202c组成的组。

7.如权利要求6所述的方法，其中，对所述尿样品测试Rv1759c、Rv2126c和Rv3202c的存在。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物标志物中的至少一种选自由Rv1664、Rv1977和Rv2490c组成的组。

9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述结核病是肺结核。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，在不用抗原刺激所述尿样品的情况下执行所述方法。

11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，使用捕获剂来检测所述样品中的所述生物标志物的存在。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述捕获剂选自由抗体、亲和体、锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、核酸适体、经修饰的核酸适体、肽、经修饰的肽、碳水化合物配体、合成配体和合成聚合物组成的组。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中，使用指示剂来指示所述捕获剂与所述生物标志物的结合。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述指示剂是电化学指示剂、生色指示剂、光学指示剂、荧光指示剂或放射性标记指示剂。

15.如权利要求11或12所述的方法，其中，所述捕获剂与所述生物标志物的结合通过电学、声学、光学或机械方法而直接检测。

16.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，所述方法是护理现场方法。

17.如权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，所述捕获剂和指示剂位于其上能放置所述样品的测试带检验用品或微流体装置上。

18.一种根据权利要求1～17中任一项所述的方法从受试对象的尿样品诊断结核病的测试装置，所述测试装置包含能够结合至少两种结核病生物标志物的捕获剂，所述至少两种结核病生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c组成的组。

19.如权利要求18所述的测试装置，所述测试装置还包含在捕获剂与生物标志物结合时进行指示的指示剂。

20.一种用于从受试对象的尿样品诊断结核病的试剂盒，所述试剂盒包含能够结合至少两种结核病生物标志物的捕获剂，所述至少两种结核病生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c组成的组。

21.如权利要求20所述的试剂盒，所述试剂盒还包含在所述捕获剂与所述生物标志物结合时进行指示的一种或多种指示剂。

22.如权利要求20或21所述的试剂盒，所述试剂盒还包含权利要求18或19所述的测试装置和/或执行权利要求1～17中任一项所述的诊断方法的说明书。

23.一种能够与生物标志物选择性结合的捕获剂，所述生物标志物选自由Rv1664、Rv1977、Rv2490c、Rv2694c、Rv2748c、Rv1161、Rv2280、Rv1759c、Rv2126c、Rv3202c、Rv1450c、Rv3775、Rv3885c、Rv0765c、Rv1235、Rv2981c、Rv1475c、Rv0014c、Rv0578c、Rv1522c、Rv2737c、Rv1464、Rv0668、Rv3345c、Rv3736和Rv2455c组成的组。

24.如权利要求23所述的捕获剂，所述捕获剂用于权利要求1～17中任一项所述的诊断结核病的方法中。

25.如权利要求24所述的捕获剂，所述捕获剂用于制造权利要求18或19所述的测试装置。