CN105683370B - 具有α-木糖苷酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有α‑木糖苷酶活性的分离的多肽，催化结构域，以及编码这些多肽、催化结构域的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同生产和使用这些多肽和催化结构域的方法。

Description

具有α-木糖苷酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
对生物材料保藏的参考
本申请包含对生物材料公共保藏的参考，该保藏通过引用结合在此(ATCC 8483)。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有α-木糖苷酶活性的并且属于糖苷水解酶家族31的多肽(GH31,www.cazy.org&PMID:18838391，康塔雷尔(Cantarel)等人)，尤其是被表示为BACOVA 03422的GH31α-木糖苷酶的用途。
核酸研究(Nucleic Acids Res.)2009年1月；37(数据库问题(Database issue))：D233-8.doi:10.1093/nar/gkn663。Epub 2008年10月5日。
碳水化物活性酶数据库(CAZy)：葡萄糖基因组(Glycogenomics)的专业资源。
康塔雷尔(Cantarel)BL、科蒂尼奥(Coutinho)PM、拉恩珂润(Rancurel)C、伯纳德(Bernard)T、伦巴第(Lombard)V、亨利萨特(Henrissat)B.，和编码这些多肽以及催化结构域的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同生产和使用这些多肽和催化结构域的方法。
相关技术说明
序列已知的α-木糖苷酶属于家族GH31。迄今为止，已经对三种细菌性GH31α-木糖苷酶进行了表征(CjXyl31A，拉尔斯布林克(Larsbrink)等人，2011，生物化学杂志(Biochem.J.)436:567-580；YicI，奥山(Okuyama)等人，2004，蛋白表达和纯化(ProteinExpr.Purif.)37:170-179；XylQ，夏尤(Chaillou)等人，1998，细菌学杂志(J.Bacteriol.)180:2312-2320)。在古细菌中，已经描述了一种α-木糖苷酶(XylS，莫拉奇(Moracci)等人，2000，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)275:22082-22089)。还已经描述了两种真菌性GH31α-木糖苷酶：黑曲霉α-木糖苷酶(AxlA，斯科特-克雷格(Scott-Craig)等人，2011，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)286:42848-42854)和构巢曲霉α-木糖苷酶(鲍尔(Bauer)等人，2006，美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.)130:11417-11422)。黑曲霉AxlA已经显示出当被补充至商业化纤维素酶制品时提高了一些底物的可发酵糖的产率。其作用机制被推测为在于帮助木葡聚糖水解(杰伯(Jabbour)等人，2013，生物燃料技术6：网络版(Biotechnol.Biofuels 6:online version))。
在植物中，已经描述了若干GH31α-木糖苷酶(AXyl1和芸苔属GH31，桑佩德罗(Sampedro)等人，2001，植物生理学(Plant Physiol.)126:910-920和伊格莱西亚斯(Iglesias)等人，2006，植物与细胞生理学(Plant Cell Physiol.)47:55-63；来自旱金莲(Tropaeolum majus)，克龙比(Crombie)等人，2002，普兰塔(Planta)214:406-413；来自稻(Oryza sativa)，中井(Nakai)等人，2007，生物化学杂志(J.Biochem)142:491-500)。除了这些之外，已经在多种物种中发现了另外四种α-木糖苷酶，但是它们的氨基酸或核苷酸序列从未被确定：黄曲霉MO-5α-木糖苷酶(吉川(Yoshikawa)等人，1993，生物科学、生物技术、以及生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)57:1281-1285；吉川等人，1993，生物科学、生物技术、以及生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)58:121-125)；豌豆α-木糖苷酶(奥尼尔(O’Neill)等人，1989，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264:20430-20437)；芽胞杆菌属α-木糖苷酶(宗格(Zong)等人，1989，农业生物学和化学(Agric.Biol.Chem.)53:2129-2139)；黑曲霉(吉川等人，1994，生物科学、生物技术、以及生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)58:1392-1398)。所有这些都与在此的SEQ ID NO:2的成熟蛋白具有小于50％的一致性。
在UNIPROT数据库(参考)中已经公开了许多序列，这些序列被表示为属于家族31的糖基水解酶(EC＝3.2.1.-)或简单被表示为“蛋白”。这还包括在此例证的SEQ ID NO:2和3。这些序列与SEQ ID NO:2的序列一致性范围从100％到97.8％。另外相关的序列(通过序列一致性)是在77.2％一致性以下。
因此SEQ ID NO:2被公开为具有以下参考的UNIPROT:A7LZZ5：富尔顿(Fulton)，L克利夫顿(Clifton)，S富尔顿(Fulton)，B许(Xu)，J明克斯(Minx)，P佩平(Pepin)，KH约翰逊(Johnson)，M斯如维尔朗加姆(Thiruvilangam)，P伯纳吉瑞(Bhonagiri)，V纳什(Nash)，WE马迪斯(Mardis)，ER威尔逊(Wilson)，RK提交(2007年3月)至EMBL/GenBank/DDBJ数据库，以及桑德萨那姆(Sudarsanam)，P利(Ley)，R古鲁格(Guruge)，J特恩博(Turnbaugh)，PJ马霍瓦尔德(Mahowald)，M利普(Liep)，D戈登(Gordon)，卵形拟杆菌基因组序列草案杂志(J.Draftgenome sequence of Bacteroides ovatus)(ATCC 8483)提交(2007年4月)至EMBL/GenBank/DDBJ数据库。
与SEQ ID NO:2具有在99.2％和97.8％之间的一致性的序列被披露为UNIPROT:I9STF6(拟杆菌属CL02T12CO4)、UNIPROT:D7J3T4(拟杆菌属D22)、UNIPROT:I9ADV6(Bacteroides xylanisolvens CL03T12C04)、UNIPROT:D4VSZ2(卵形拟杆菌SD CC 2a)、UNIPROT:C3QER3(拟杆菌属2_1_22)、UNIPROT:D4WF36(Bacteroides xylanisolvens SD CC1b)以及更多一些。
本发明提供具有α-木糖苷酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸在动物饲料中的用途。与作用于对硝基苯酚α-木糖苷酶或作用于木葡聚糖(xylogluco)低聚糖的非还原端上的X基序(弗里(Fry)等人，1993，植物生理学(Physiol.Plant.)89:1-3)的其他GH31α-木糖苷酶相比。SEQ ID NO:2的α-木糖苷酶(GH31α-木糖苷酶，表示为BACOVA 03422)是玉米木聚糖特异性的并且相比于CjXyl31对玉米木聚糖具有较高的比活性。
发明概述
本发明涉及具有α-木糖苷酶活性的分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；
(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高、或非常高严格条件下与(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)由一种多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:的成熟多肽编码序列具有至少97.8％序列一致性
(e)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有α-木糖苷酶活性。
本发明还涉及包含选自下组的催化结构域的分离的多肽，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸22至814具有至少97.8％序列一致性的催化结构域
(b)由在高、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸64至2442、或者(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的催化结构域；
(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸64至2442具有至少97.8％的序列一致性的一种多核苷酸编码的催化结构域
(e)(a)、(b)、(c)的催化结构域的片段，该片段具有α-木糖苷酶活性。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包含这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
本发明还涉及具有α-木糖苷酶活性并且与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性、包含SEQID NO:3的至少一个或多个(若干个)氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入的变体多肽。
本发明进一步涉及包含具有α-木糖苷酶活性的分离的多肽的组合物，这些多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；和/或
(ii)(i)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)一种变体，该变体包含SEQ ID NO:3的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)多肽的具有α-木糖苷酶活性的片段。
这些组合物可以是动物饲料组合物。本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，并且涉及重组地产生这些多肽的方法。本发明还涉及用于制备一种用于在动物饲料中使用的组合物的方法，用于提高动物饲料的营养价值的方法，以及处理蛋白以在动物饲料组合物中使用的方法。
本发明还涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至21或由其组成，该信号肽可操作地连接至编码蛋白的基因；包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体、以及重组宿主细胞；以及产生蛋白的方法。
本发明还提供了包含所使用的多肽的动物饲料组合物。本发明还涉及用于制备一种用于在动物饲料中使用的组合物以提高动物饲料的营养价值的方法，以及处理植物成分以在动物饲料组合物中使用的方法。
附图简要说明
图1显示YicI和SEQ ID NO:2的部分的部分比对，BoXyl31A(SEQ ID NO:2的α-木糖苷酶)以粗体字显示出活性位点残基。还在比对上用一个星号标记活性位点残基的位置。SEQ ID NO:2的Asp 400(图中no.36)和酸性/碱性Asp 473(图中no.102)分别是亲核体和酸性/碱性的。
图2显示出薄层色谱法对修饰的木聚糖显示出卵形拟杆菌GH31活性。泳道D-H：单独的木聚糖。泳道I-M：木聚糖+GH31。黑麦阿拉伯木聚糖(泳道D和H)、桦木葡糖醛酸木聚糖(泳道E和I)、燕麦木聚糖(泳道F和J)、小麦阿拉伯木聚糖(泳道G和K)。玉米糠木聚糖(泳道H和L)。泳道A是D-低聚木糖标准品X1至X6混合物(麦格酶公司(Megazyme))。泳道B和C分别是L-阿拉伯糖和L-半乳糖标准品(西格马公司(Sigma))。
通过不同酶处理释放的单糖。在图中单糖表示为如下：阿拉伯糖、半乳糖、海藻糖、葡萄糖、木糖。
图3显示出高效液相层析(HPLC)轨迹，这些轨迹显示出了GH31(BACOVA_03422)从用玉米木聚糖中释放出木糖(实例2)。
图4显示出高效液相层析(HPLC)轨迹，该轨迹显示出了加有D-木糖标准品以确认一致性的GH31(BACOVA_03422)产物(实例2)。
图5比较了作用于木葡聚糖低聚糖的GH31(BACOVA_03422)和C.japonicus GH31(ACE86259)Bo GH31和C.japonicus GH31的活性。发现GH31(BACOVA_03422)对木葡聚糖七庚糖(XXXG)的活性比Cj GH31(>50,000x)的少得多。然而，卵形拟杆菌GH31对玉米木聚糖的活性比C.japonicus GH31α-木糖苷酶多出>100倍(实例2)。
图6也显示出针对玉米糠木聚糖和木葡聚糖七庚糖(XXXG)，GH31(BACOVA_03422)和C.japonicus GH31(ACE86259)的相对比率之间的差异。卵形拟杆菌GH31α-木糖苷酶对玉米木聚糖的活性比C.japonicus GH31α-木糖苷酶多出约100倍(小图A)。两种酶对木葡聚糖七庚糖XXXG的相对比率(小图B)。卵形拟杆菌GH31α-木糖苷酶对XXXG低聚糖底物的活性比C.japonicus GH31α-木糖苷酶少约10000倍(实例2)。
图7示出(GH31)：在使用GH31α-木糖苷酶、UltraFlo L及其组合的三种不同酶处理后从玉米纤维胶中所释放的单糖。GH31当与UltraFlo L一起使用时对从玉米纤维胶中释放木糖具有协同效应(实例3和4)。
图8显示出GH31α-木糖苷酶对从脱淀粉玉米糠中释放单糖的作用。糖水平表示为曲线下面积乘以稀释因子。该图还显示了GH95α-L-半乳糖苷酶和其他酶(GH11，GH43/51)及其组合的作用(实例3和4)。
序列表的简要说明
在序列表中
SEQ ID NO:1显示出如分离自卵形拟杆菌(ATCC 8483)的α-木糖苷酶的DNA序列。
SEQ ID NO:2显示出如从SEQ ID NO:1(UNIPROT:A7LZZ5)推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示出来自卵形拟杆菌α-木糖苷酶的成熟肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示出来自拟杆菌属CL的成熟肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:5显示出来自拟杆菌属D22的成熟肽的氨基酸序列。
序列的一致性矩阵：
SEQ ID NO: 2 3 4 5
2 100 99.2 98.8 99.3
3 99.2 100 98.2 99.0
4 98.8 98.2 100 98.6
5 99.3 99.0 98.6 100
定义
α-木糖苷酶：术语α-木糖苷酶意指展示出α-木糖苷酶活性的酶(EC3.2.1.177)，该酶催化木聚糖中α-木糖单元的水解。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定α-木糖苷酶活性。在一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-木糖苷酶活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
催化结构域：术语“催化结构域”意思指一种酶的包含该酶的催化机器的区域。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中该片段具有α-木糖苷酶活性。在一个方面中，片段包含成熟肽的至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如，宿主细胞中的重组体产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于指示SEQID NO:2的氨基酸1至21为信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，该成熟多肽是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸1至793(如果用信号肽计数那么编号为22到814)。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。在一个方面中，一个成熟多肽包含成熟多肽的氨基酸数目的多达105％、110％、或115％。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-木糖苷酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，同上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至2442。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：不同的严格条件定义如下
术语“非常低严格性条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准DNA印迹程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
对于至少100个核苷酸长度的探针，术语“低严格性条件”意指按照标准DNA印迹程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
对于至少100个核苷酸长度的探针，术语“中严格性条件”意指按照标准DNA印迹程序在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有α-木糖苷酶活性的片段。在一个方面，一个子序列包含编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的核苷酸的至少85％、90％或95％。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-木糖苷酶活性的一个多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指邻近于占据一个位置的氨基酸去除一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。并且插入意指邻近于占据一个位置的氨基酸添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。
发明详述
具有α-木糖苷酶活性的多肽
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽具有α-木糖苷酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、或10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。
本发明还涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些分离的多肽具有α-木糖苷酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明进一步涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ IDNO:5的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些分离的多肽具有α-木糖苷酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少82％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少84％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少86％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少88％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少89％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料或洗涤剂中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽具有100％序列一致性。
以上实施例中的每一个不仅还涉及SEQ ID NO:2，而且涉及SEQ ID NO:4和5中任一项。因此，本发明还涉及以下各项。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少82％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少84％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少86％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少88％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少89％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料或洗涤剂中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:4的(成熟)多肽具有100％序列一致性。
和
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少82％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少84％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少86％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少88％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少89％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料或洗涤剂中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例在动物饲料中使用一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的(成熟)多肽具有100％序列一致性。
本发明中所使用的多肽优选地包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是从N-末端和/或C-末端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有α-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的成熟多肽或由其组成。在另一个方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸22至814、SEQ ID NO:4的氨基酸22至814和/或SEQ ID NO:5的氨基酸22至814或由其组成。
在另一个实施例中，本发明涉及一种具有α-木糖苷酶活性的分离的多肽在动物饲料中的用途，该分离的多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件、或非常高严格条件下，与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,A LaboratoryManual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有α-木糖苷酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与以上描述的探针杂交并且编码出具有α-木糖苷酶活性的多肽的DNA对从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ IDNO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)它们的全长互补体；或(iv)其子序列；杂交是在非常低至非常高严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；它的成熟多肽；或它的一个片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。在另一个方面中，该核酸探针是包含在卵形拟杆菌ATCC-8483中的成熟多肽编码区域。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，高至非常高严格条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严格条件在25％甲酰胺中，对于中和中-高严格条件在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严格条件在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃(高严格条件)和在70℃(非常高严格条件)下，使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，严格条件被定义为最佳地，遵循标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390(1962))的计算所计算的Tm低约5℃至约10℃下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt’s solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及每ml 0.2mg的酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在比所计算的Tm低5℃至10℃下，在6XSCC加0.1％SDS中洗涤1次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤2次(每次15分钟)。
在另一个实施例中，本发明涉及一种用于动物饲料中的、具有α-木糖苷酶活性的分离的多肽，该分离的多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具至少97.8％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，用于动物饲料中使用。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-末端的或羧基末端的延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如德·沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。基于与其他GH31水解酶的同源性，SEQ ID NO:2的催化残基是亲核体Asp 400(图1中no.36)和酸性/碱性Asp 473(图1中no.102)(参见图1中的比对)。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409、WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包含一个裂解位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被裂解，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能和遗传学(Proteins：Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。
具有α-木糖苷酶活性的多肽的来源
本发明的具有α-木糖苷酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从…中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，从给定来源获得的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是一种革兰氏阴性细菌多肽，如拟杆菌属(Bacteroides)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽；或是一种革兰氏阳性细菌多肽，如具有α-木糖苷酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽。
在一方面，该多肽是卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、产酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)、纤细拟杆菌(Bacteroides gracilis)、口拟杆菌(Bacteroides oris)、腐败拟杆菌(Bacteroides putredinis)、酿脓拟杆菌(Bacteroidespyogenes)或普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)多肽。
在另一方面，该多肽是一种卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)多肽，例如，从卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)ATCC 8483获得的多肽。
在另一方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个方面中，该多肽是似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个方面，该多肽是不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链丝菌、或浅青紫链霉菌多肽。
该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，如假丝酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母、或耶氏酵母属多肽；或一种丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属多肽。
在另一个方面，该多肽是卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
在另一个方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株对公众来说是易于在一些培养物保藏中心得到的，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究服务专利培养物保藏所，北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
催化结构域
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸22至814具有至少97.8％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的催化结构域。在一方面，这些催化结构域包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸22至814具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该催化结构域优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸1到793或其等位基因变体或由其组成；或是其具有α-木糖苷酶活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及在非常低严格条件件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下(如上所定义)与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸64到2442、或(iii)(i)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的催化结构域(萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的催化结构域，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸64到2442具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
编码该催化结构域的多核苷酸优选包含SEQ ID NO:1的核苷酸64至2442或由其组成，或者是包含于ATCC 8483中的序列。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸22至814的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:2的氨基酸22至814的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
多核苷酸
本发明还涉及编码本在此描述的多肽、催化结构域的分离的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods andApplication)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由拟杆菌属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以在呈现为SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的聚核苷酸的基础上来构建。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
由郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子与细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990描述了可用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’-末端可以包含对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化裂解或自动催化裂解前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标记可以是在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO00/24883中的方法来完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、右旋糖酐、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP 238023，约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474，和克里斯坦森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。酵母可以使用以下各文献中所描述的程序转化：贝克尔(Becker)和古伦特(Guarente)，在艾本尔森J.N.(Abelson,J.N.)和塞蒙M.I.(Simon,M.I.)编辑，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司，纽约；埃托(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；及辛伦(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
生产方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包含(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一方面，该细胞是拟杆菌属细胞。在另一方面，该细胞是卵形拟杆菌细胞。在另一方面，该细胞是卵形拟杆菌细胞ATCC 8483。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包含(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，一种使用对硝基-苯酚-□-d-木糖的酶测定可以被用来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面中，回收包含该多肽的发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
α-木糖苷酶活性的除去或降低
本发明还涉及产生亲本细胞的突变体的方法，该方法包含破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，这导致突变体细胞比在相同条件下培养的亲本细胞产生的多肽少。
可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该多核苷酸的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选方面，将该多核苷酸失活。例如，待修饰或失活的多核苷酸可以是活性必需的编码区或其部分，或编码区的表达所需的调节元件。这种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活因子。
该多核苷酸的修饰或失活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。所述诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适宜的物理或化学诱变剂、通过使用适宜的寡核苷酸、或通过对DNA序列PCR产生诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，邻-甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，诱变一般是在适宜条件下在所选的诱变处理试剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。
该多核苷酸的修饰或失活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调控元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或除去核苷酸从而形成终止密码子的引入、起始密码子的除去、或开放读码框的改变。此类修饰或失活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管原则上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。
便利的消除或降低多核苷酸的表达的方法的实例是基于基因替换、基因缺失、或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷的核酸序列替换内源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标记。在一方面，用例如在此描述的那些选择性标记来破坏该多核苷酸。
本发明还涉及抑制具有α-木糖苷酶活性的多肽在细胞中的表达的方法，这些方法包含向该细胞给予或在其中表达一种双链RNA(dsRNA)分子，其中该dsRNA包含本发明的多核苷酸的一个子序列。在一个优选方面中，该dsRNA长约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个双核苷酸。
该dsRNA优选是一个小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一个优选方面，该dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选方面，该dsRNA是用于抑制翻译的微小RNA。
本发明还涉及此类双链RNA(dsRNA)分子，包含用于抑制该多肽在细胞中的表达的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsRNA可以进入一个细胞并且导致相似的或相同的序列的单链RNA(ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当细胞被暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地被一种叫做RNA干扰(RNAi)的过程所降解。
本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一方面，可以使用这些dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用dsRNA分子选择性降解RNA的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；以及6,515,109。
本发明进一步涉及在编码该多肽的多核苷酸或其控制序列或编码该多肽的沉默基因中包含破坏或缺失的亲本细胞的突变体细胞，这导致与亲本细胞相比，该突变体细胞产生的多肽少或不产生多肽。
这些多肽缺陷的突变体细胞作为用于原生和异源多肽的表达的宿主细胞尤其有用。因此，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，包含(a)在有益于产生该多肽的条件下培养该突变体细胞；并且(b)回收该多肽。术语“异源多肽”是指对该宿主细胞来说不是原生的多肽，例如天然蛋白的变体。该宿主细胞可以包含多于一个拷贝的编码该原生或异源多肽的多核苷酸。
可使用本领域已知的方法进行培养和目的产物的纯化。
本发明用于生产基本上不含α-木糖苷酶的产物的方法在真核多肽的生产中特别有利，尤其是真菌蛋白，例如酶。α-木糖苷酶缺陷的细胞还可用于表达药学感兴趣的异源蛋白，例如激素、生长因子、受体等。术语“真核多肽”不仅包括原生多肽，还包括经过氨基酸替代、缺失或添加的修饰或用以增强活性、热稳定性、pH耐受性等的其他此类修饰的多肽，例如酶。
在另一个方面，本发明涉及通过本发明的方法生产的基本上不含α-木糖苷酶活性的蛋白产物。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的一种发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制品。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含耗尽的细胞培养基、胞外酶、以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包含一种第一有机酸组分(包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包含至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。
在一个方面中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的α-木糖苷酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。
在一个方面，该组合物包含具有α-木糖苷酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；和/或
(ii)(i)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)一种变体，该变体包含SEQ ID NO:3的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；和
(e)(a)、(b)、(c)或(d)多肽的具有α-木糖苷酶活性的片段。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少86％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少88％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少89％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是一种组合物，该组合物包含一种分离的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有100％序列一致性。
在一方面，该组合物包含SEQ ID NO:3的成熟氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有α-木糖苷酶活性的片段。在另一个方面，该组合物包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在一个另外的方面，该组合物包含SEQ ID NO:3的成熟多肽或由其组成。在另一个方面，该组合物包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至160、SEQ ID NO:2的氨基酸5至154或SEQ ID NO:2的氨基酸10至149或由其组成。在另一个方面，该多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1至160、SEQ ID NO:3的氨基酸5至154或SEQ ID NO:3的氨基酸10至149或由其组成。
本发明还涉及包含分离的多肽的组合物，这些分离的多肽具有α-木糖苷酶活性并且是由以下多核苷酸编码，这些多核苷酸在高严格条件、或非常高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列和/或(ii)(i)的全长互补链杂交(J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(MolecularCloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
本发明进一步涉及包含分离的多肽的组合物，这些多肽与SEQ ID NO:3的多肽相差不多于一百个氨基酸残基，例如相差九十个氨基酸、相差八十个氨基酸、相差七十个氨基酸、相差六十个氨基酸、相差五十个氨基酸、相差四十个氨基酸、相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明还涉及包含变体的组合物，这些变体包含SEQ ID NO:3或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入。在SEQ ID NO:3中具有氨基酸取代、缺失和/或插入的位置总数不多于100，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、40、50、60、70、80、90或100。优选地，这些氨基酸变化具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代、插入或缺失；典型地一个至约30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。
就SEQ ID NO:3而言，以上表明的实施例对应地施用于如下组合物，这些组合物包含由SEQ ID NO:2所提供的多肽或由其组成。
就SEQ ID NO:3而言，以上表明的实施例对应地施用于如下组合物，这些组合物包含由SEQ ID NO:4所提供的多肽或由其组成。
就SEQ ID NO:3而言，以上表明的实施例对应地施用于如下组合物，这些组合物包含由SEQ ID NO:5所提供的多肽或由其组成。
组合物可以包含本发明的α-木糖苷酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、蛋白酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
可以例如通过微生物(如细菌或真菌)或通过植物或通过动物产生另外的一种或多种酶。这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该α-木糖苷酶可以根据本领域中已知的方法稳定化。
这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
本发明的α-木糖苷酶在动物饲料中的用途
术语动物包括所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如，动物，如绵羊、山羊、和牛，例如，肉牛、奶牛和牛犊。在具体实施例中，动物为非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如，猪(包括，但不限于，小猪，成长猪，和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；和鱼(包括但不限于，鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物意思指适于或者意在由动物摄入的任意化合物、制品、混合物或组合物。在根据本发明的用途中，可在饮食之前，之后或同时向动物饲喂α-木糖苷酶。优选后者。
在具体实施例中，明确限定了向饲料中添加的α-木糖苷酶或包括在饲料添加剂中的α-木糖苷酶。明确限定意指如通过大小排阻色谱法(参见WO01/58275的实例12)确定的，α-木糖苷酶制品至少为50％纯。在其他具体实施例中，如通过此方法确定的，α-木糖苷酶制品为至少60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少95％纯。
明确限定的α-木糖苷酶制品是有利的。例如，对于一般来说实质上不受其他蛋白酶或其他蛋白干扰或污染的α-木糖苷酶而言，正确配料于饲料容易地多。术语正确配料具体是指获得一致和恒定结果的客观性，并且根据所需要的效果能够得到优化剂量。
然而，为了在动物饲料中使用，α-木糖苷酶不必那么纯；它可例如包括其他酶，在此情况下它可被定义为α-木糖苷酶制品。
该α-木糖苷酶制品可以(a)直接添加至饲料(或者直接用于蛋白处理过程)，或者(b)它可以用于一种或多种随后添加至饲料(或者用于处理过程中)的中间组合物，如饲料添加剂或者预混物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始α-木糖苷酶制品的纯度。
具体地说，使用生产方法即可获得纯度为上述数量级的α-木糖苷酶制品，然而，当通过传统的发酵方法生产α-木糖苷酶时，要想获得所述α-木糖苷酶制品却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。此α-木糖苷酶制剂当然可以与其他酶混合，以获得具有两种或更多种具有不同或类似活性的、经纯化的酶的制品。
该底物蛋白可以是动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或者它可为植物蛋白。
底物来源优选地是植物来源。在此用到的术语植物蛋白指包括至少一种得自或来源自植物蛋白的任何化合物、组合物、制剂或混合物，其中所述蛋白包括经修饰蛋白或蛋白衍生物。在具体实施例中，这些植物蛋白的蛋白含量至少为10％、20％、30％、40％、50％或60％(w/w)。
植物蛋白可以源自包含半乳糖细胞壁成分的植物蛋白源，例如豆类和谷物(巴赫克努森(Bach Knudsen)，K.E.(1997)，用于动物饲养中的植物材料的碳水化物和木质素含量(Carbohydrate and lignin contents of plant materials used in animalfeeding)，动物饲料科学与技术(Animal Feed Science and Technology)67:319-338)，例如，来自蝶形花科(豆科)，十字花科，藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。在具体实施例中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆。在另一个具体实施方案中，植物蛋白源是来自一种或多种藜科植物，例如甜菜、糖甜菜(sugar beet)、菠菜或奎奴亚藜的材料。植物蛋白源的其他实例为油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。大豆为优选的植物蛋白源。植物蛋白源的其他实例是谷物，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦、高粱、具有可溶物的干酒糟(DDGS)和微藻。
在处理过程的具体实施例中，所讨论的这种或这些种α-木糖苷酶影响(或对其发挥作用或施加水解或降解影响)包含蛋白源的细胞壁结构的木糖苷酶，从而增加营养素释放。该释放不仅局限于蛋白还包括其他营养素例如储存在植物细胞内的淀粉、脂肪以及低分子量的糖。为了达到此目的，一般将蛋白或蛋白源悬浮于溶剂，例如含水溶剂，如水中，并适当关注所讨论的酶的特征，以调节pH和温度值。例如，可在能使实际α-木糖苷酶的活性为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在能使实际α-木糖苷酶的活性为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少90％的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶解反应直至获得所需结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。
在本发明处理过程的另一个具体实施例中，α-木糖苷酶作用被维持，这意味着例如将α-木糖苷酶加入这些植物蛋白，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适当的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论使用何种其他方式延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。
在一个实施例中，处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白，即这些植物蛋白源是在摄入之前被水解的。
术语改善动物饲料的营养价值指的是提高饲料中的营养的可利用性。在本发明中，改善营养价值具体指的是改善饲料的蛋白部分的可利用性，从而导致蛋白提取的增加，较高的蛋白产量，和/或蛋白利用的改善。当饲料的营养价值增加时，蛋白和/或氨基酸消化率增加，并且该动物的生长速率和/或体重增加量和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)可被改善。
可将任何形式的α-木糖苷酶添加至饲料中，所述形式有：作为相对纯的α-木糖苷酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即动物饲料添加剂，如所谓的动物饲料预混物。
在另一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混物。
除本发明的α-木糖苷酶外，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种水溶性维生素、和/或至少一种微量矿物质、和/或至少一种大量矿物质。
另外，可任选的，饲料添加剂成分是着色剂，例如，类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素；稳定剂；生长改进添加剂以及芳香化合物/风味剂，例如，甲氧甲酚，茴香脑，癸-、十一-和/或十二-内酯，紫罗酮，鸢尾酮，姜辣素，哌啶，亚丙基苯酞(propylidenephatalide)，亚丁基苯酞(butylidene phatalide)，辣椒素和/或丹宁酸；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸(PUFA)；活性氧生成种类；另外，可以使用一种支持物，该支持物可以包含例如按重量计40％-50％的木纤维、按重量计8％-10％的硬脂、按重量计4％-5％的姜黄粉、按重量计4％-58％的迷迭香粉、按重量计22％-28％的石灰石、按重量计1％-3％的胶(例如阿拉伯胶)、按重量计5％-50％的糖和/或淀粉、以及按重量计5％-15％的水。
本发明的饲料或饲料添加剂还可以包含至少一种选自以下项的其他酶：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如，像α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
在具体实施例中，本发明的饲料或饲料添加剂还包含一种蛋白酶(EC3.4)。
在具体实施例中，本发明的饲料或饲料添加剂还包含一种植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)。
在具体实施例中，本发明的饲料或饲料添加剂还包含一种木聚糖酶(EC3.2.1.8)。
本发明的饲料或饲料添加剂还可以包含至少一种益生菌或直接饲喂微生物(DFM)，该益生菌或直接饲喂微生物任选地与选自以下项中的一种或多种其他酶一起：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如，像α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC3.2.1.6)。
可以将DFM添加至动物饲料中，这样使得DFM的每日剂量在1x 105CFU和1x1013CFU之间，优选地在1x 106CFU和1x 1012CFU之间，更优选地在1x 107CFU和1x 1011CFU之间并且甚至更优选地在5x 107CFU和1x1010CFU之间。可替代地，可以将DFM添加至动物饲料中，这样使得DFM在饲料中的浓度在1x 103CFU/g饲料和1x 108CFU/g饲料之间，优选地在5x103CFU/g饲料和1x 107CFU/g饲料之间，更优选地在1x 104CFU/g饲料和5x106CFU/g饲料之间并且甚至更优选地在2.5x 104CFU/g饲料和1x 106CFU/g饲料之间。
该直接饲喂微生物可以是一种来自以下属的一种或多种中的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉杆菌属、丙酸菌属、双歧杆菌属、梭菌属以及巨球形菌属或其任何组合，优选来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、屎肠球菌、肠球菌属、以及片球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌、嗜酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、路氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius ssp.salivarius)、埃氏巨球形菌、丙酸杆菌属并且更优选来自以下枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；2084(NRRL B-500130)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-50105)；BS 18(NRRLB-50633)；以及BS 278(NRRL B-50634)。
在具体实施例中，这些其他酶被明确定义(如上针对定义的)。在具体实施例中，本发明的饲料或饲料添加剂还包含一种木聚糖酶(EC 3.2.1.8)。
抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、Tritrpticin、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫肽、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和Ovispirin如Novispirin(罗伯特莱勒(Robert Lehrer)，2000)、菌丝霉素(Plectasins)以及他汀类，包含在WO 03/044049和WO 03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillusgiganteus)和黑曲霉的肽，连同其保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO02/090384中披露的。
多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚麻酸。
活性氧生成种类的实例为化学品，如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶或合成酶。
通常，脂-溶性维生素和水溶性维生素、以及微量矿物质形成了一种所谓的旨在添加到饲料中的预混物的部分，而大量矿物质通常被分开地添加到饲料中。这些组合物的任一者，当富含本发明的α-木糖苷酶时，都是本发明的动物饲料添加剂。
在具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂以0.01％至10.0％，更具体0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。
下文列出了这些组分的非-排他性实例：
脂溶性维生素的实例是维生素A，维生素D3，维生素E和维生素K，如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸酯，例如Ca-D-泛酸酯。
微量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
大量矿物质的实例为钙、磷和钠。
在WO 01/58275的表A中，列出了这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)。营养需求指的是应在饮食中提供指定浓度的这些组分。
在可替代的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275中的表A所详细说明的单个组分中的至少一种。至少一种指的是一种或两种或三种或四种等直至所有十三种，或直至所有15种单个组分中的任一种，一种或多种。更具体地，该至少一种单独成分以在表A的第四栏或第五栏或第六栏说明的饲料内浓度范围提供的量包括在本发明的添加剂内。
在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选使得其饲料内浓度落入下表1中所限定的范围之内(分别对于小猪饮食和肉仔鸡饮食)。
表1：一般性维生素建议
维生素 小猪饮食 肉仔鸡饮食
维生素A 10,000-15,000IU/kg饲料 8-12,500IU/kg饲料
维生素D3 1800-2000IU/kg饲料 3000-5000IU/kg饲料
维生素E 60-100mg/kg饲料 150-240mg/kg饲料
维生素K3 2-4mg/kg饲料 2-4mg/kg饲料
维生素B1 2-4mg/kg饲料 2-3mg/kg饲料
维生素B2 6-10mg/kg饲料 7-9mg/kg饲料
维生素B6 4-8mg/kg饲料 3-6mg/kg饲料
维生素B12 0.03-0.05mg/kg饲料 0.015-0.04mg/kg饲料
烟酸(维生素B3) 30-50mg/kg饲料 50-80mg/kg饲料
泛酸 20-40mg/kg饲料 10-18mg/kg饲料
叶酸 1-2mg/kg饲料 1-2mg/kg饲料
生物素 0.15-0.4mg/kg饲料 0.15-0.3mg/kg饲料
氯化胆碱 200-400mg/kg饲料 300-600mg/kg饲料
本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食的特征如WO 01/58275，表B第2-3栏所示。鱼食可被表征为该表B第4栏中所示的。此外，这类鱼食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO 01/58275相当于US 09/779334，将其列入本文作为参考。
根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且此外还包含至少一种在此所要求保护的α-木糖苷酶。
此外，或可替代地(对于以上指出的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量的含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275，表B，范围2、3、4或5(R.2-5)中的任何一个中。
粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)X6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.，1984，官方分析方法(Official Methodsof Analysis)第14版，官方分析化学家集(Association of Official AnalyticalChemists)，华盛顿特区)。
可代谢能量可根据NRC出版物猪的营养需求(Nutrient requirements inswine)，第九次再版1988，国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会。美国国家科学院出版社，华盛顿特区，第2-6页和欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table ofEnergy Values for Poultry Feed-stuffs)，斯克得霍特(Spelderholt)家禽研究与推广中心，7361DA贝克贝亨，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen公司，瓦赫宁恩(Wageningen)，ISBN 90-71463-12-5计算。
完整的动物饮食中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量根据如Veevoedertable1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde wanvoedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6,8219pk Lelystad，ISBN 90-72839-13-7计算。
在具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物蛋白。
本发明的动物饲料组合物还可以包含动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(DriedDistillers Grains)，通常量为0-30％。
在又另外具体的实施例中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％玉蜀黍、和/或0-80％高粱、和/或0-70％小麦、和/或0-70％大麦、和/或0-30％燕麦、和/或0-40％大豆粉、和/或0-25％鱼粉、和/或0-25％肉和骨粉、和/或0-20％乳清。
可将动物饮食制成例如糊状饲料(非丸状)或丸状饲料。通常，混合碾磨的饲料并根据所讨论的这些种类的说明添加充足量的必需维生素和矿物质。以固体或液体酶配制品的形式添加酶。例如，对于糊状饲料，在成分混合步骤前或期间可添加固体或液体酶配制品。对于丸状饲料，在饲料成分步骤前或期间还可添加该(固体或液体)α-木糖苷酶/酶制品。典型地，在造粒步骤之后添加液体α-木糖苷酶/酶制剂。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物。
饮食中最终的酶浓度是在0.01-200mg酶蛋白/kg饮食范围内，例如在0.5-25mg酶蛋白/kg动物饮食的范围内。
当然，应该以有效量，即足以改善饲料的蛋白水解、蛋白和氨基酸消化性、和/或改善营养价值的量使用α-木糖苷酶。目前考虑以下述量(剂量范围)中的一种或多种给予酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或0.10-10-所有这些范围都是每kg饲料中α-木糖苷酶蛋白的mg数(ppm)。
为了测定每kg饲料中α-木糖苷酶蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化α-木糖苷酶，并且使用相关试验(参见α-木糖苷酶活性，底物和分析)测定经纯化的α-木糖苷酶的比活性。还使用相同试验测定所述饲料组合物的α-木糖苷酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中α-木糖苷酶蛋白的mg数计的剂量。
使用相同的原理测定饲料添加剂中的α-木糖苷酶蛋白mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用α-木糖苷酶的样品，可由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化α-木糖苷酶)。
信号肽
本发明还涉及一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1到21或由其组成。这些多核苷酸可以进一步包含一个编码蛋白的基因，该蛋白可操作地连接到该信号肽。该蛋白优选地对于该信号肽来说是外源的。在一方面，编码该信号肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1至63。
核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产α-木糖苷酶的方法
本发明还涉及包含编码本发明的α-木糖苷酶的这类多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
本发明还涉及产生α-木糖苷酶的方法，所述方法包含：(a)培养包含这种多核苷酸的重组宿主细胞；并且(b)回收该蛋白。
该蛋白对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的。术语“蛋白”在此不意图是指一种特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽及多肽。术语“蛋白”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白还包括杂合多肽和融合多肽。
优选地，该蛋白是一种激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告基因。例如，该蛋白可以是一种α-木糖苷酶、水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
优选地，该蛋白是一种α-木糖苷酶。
该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
菌株
在此参考微生物菌株卵形拟杆菌(ATCC 8483)的公开可得的保藏物，该保藏物由艾格丝(Eggerth)于1933保藏于ATCC(艾格丝(Eggerth)AH，加尼翁(Gagnon)BH.人类粪便拟杆菌属(The bacteroides of human feces.)细菌学杂志(J.Bacteriol.)25:389-413,1933)。
实例1：
质粒的构建和蛋白质生产
为了生产蛋白质构建体，从卵形拟杆菌ATCC8483基因组DNA使用适合的引物通过PCR来扩增编码卵形拟杆菌GH31(BACOVA 03422；登录号A7LZZ5)和GH95(BACOVA_03438；登录号A7M011)的DNA序列。将GH31克隆进BamHI和HindIII消化的pRSET_A载体中(英杰公司(Invitrogen))。将该扩增的、编码GH95的DNA片段克隆进NdeI和XhoI限制的pET21a中(诺瓦根公司(Novagen))。
通过将重组大肠杆菌(BL21；诺瓦根公司)接种到在2L烧瓶中、补充有氨比西林(50μg/mL)的LB培养基(1L)中并且在37℃下伴随摇动(200rpm)直到OD600到达0.4来生产可溶的重组蛋白。添加异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷至1mM的终浓度，来诱导蛋白质生产，并且将该培养物在37℃下再孵育5h。在5000g/10min/4℃下通过离心(固定角)收获细胞，再悬浮于每升培养物包含300mM NaCl(缓冲液A)的20mM Tris-HCl(pH 8.0)的10mL中，并且通过超声处理来破裂。在15000g/30min/4℃下通过离心澄清细胞裂解物之后，使用Talon树脂(科隆达公司(Clontech))通过固定化金属亲和层析纯化多肽。将蛋白用包含150mM咪唑的缓冲液A进行洗脱(GH31，图3；和GH95，图4)。用包含150mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)透析卵形拟杆菌GH31。将卵形拟杆菌GH95在50mM Na2PO4缓冲液(pH7.5)中进行透析。
以SEQ ID NO:1提供BACOVA 03422的经克隆的DNA序列并且推导氨基酸序列为SEQID NO:2。以SEQ ID NO:3提供该成熟氨基酸序列。
实例2：
BACOVA_03422GH31的生物化学表征
所使用的碳水化物的来源：
小麦和黑麦阿拉伯木聚糖和低聚木糖是来自麦格酶公司(Megazyme)(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland))。桦树和燕麦木聚糖以及所有的单糖都来自西格马公司(Sigma)。玉米糠木聚糖由凯文·希克斯(Kevin Hicks)和马达夫·亚达夫(Madhav Yadav)博士友好提供(USDA)。
薄层色谱(TLC)：
通过TLC初步评估GH31酶对一系列修饰的木聚糖的活性。用0.5μM的各种酶孵育来自黑麦、小麦、桦树、燕麦和玉米糠的木聚糖(最终1％w/v)。在50mM K2PO4、120mM柠檬酸(pH6.5)中进行反应。将多糖用酶在37℃下孵育5h。然后将样品以1cm间隔上样到TLC板上，并且在各自2ul的上样后使用吹风机进行干燥。然后将TLC板置于1L的含有运行缓冲液(处于2:2:1的丁醇/乙酸/水)的玻璃缸中，至深度0.5cm并且用玻璃板密封。当该流动缓冲液到达距板顶约1cm时，取出该板，用吹风机进行干燥并且在苔黑素硫酸试剂(硫酸/乙醇/水3:70:20v/v，苔黑素1％)中沉浸几秒，并且在120℃下干燥直到糖显色(约5-10min)。
卵形拟杆菌GH31，BACOVA_03422的活性
TLC分析揭示了BACOVA_03422GH31对来自小麦、黑麦、燕麦或桦树的修饰的木聚糖没有活性，但是该酶从与D-木糖共同迁移的玉米糠木聚糖释放出单一产物(图2)。
高效液相层析(HPLC)：
使用配有CARBOPACTMPA-100保护柱的分析型CARBOPACTMPA-100阴离子交换柱(戴安公司(Dionex))，将HPLC用来量化由GH31水解的玉米木聚糖的产物。完全自动化系统具有100μl的环大小，1.0ml/min的流速，约2000psi的压力，并且通过脉冲安培检测(PAD)检测糖。该PAD设置为E1＝+0.05、E2＝+0.6和E3＝-0.6。所使用的洗脱条件为0-5分钟100mMNaOH、5-15min具有0-75mM乙酸钠梯度的100mM NaOH和15-25min包含75mM乙酸钠的100mMNaOH。每次运行的前后，将该柱用500mM乙酸钠洗涤10分钟，并且然后用500mM氢氧化钠洗涤5分钟并且然后用100mM氢氧化钠平衡10min。
在包含1mg/ml BSA的50mM PC缓冲液(pH 6.5)中进行酶反应。计算最终反应体积以允许4-8等分试样从各个反应中进行分析，该反应通过添加适当稀释的酶(终体积的1/100)开始。通过煮沸等分试样10min终止反应。通过VG层析服务器(费森斯仪器公司(FisonsInstruments))使用XChrom V.2.04软件收集并分析数据。
HPLC分析被用来进一步调研从玉米糠木聚糖中所释放的卵形拟杆菌GH31产物，并且量化产物释放的速率。数据(图3)揭示了酶从具有对应于D-木糖标准品的保留时间的玉米木聚糖中释放单一主要产物。为了确认GH31酶释放木糖，该样品加有D-木糖标准品并且使用HPLC来分析(图4)。因为来自GH31的酶靶向α-D-糖苷键并且相对于来自X2-X6的β-连接的D-低聚木糖没有观察到活性(未显示)，所以这些数据揭示了BACOVA_03422对玉米糠木聚糖具有α-D-木糖苷酶活性。
然后将卵形拟杆菌酶GH31(BACOVA_03422)的活性与之前表征的、来自C.japonicus(ACE86259)的、对木葡聚糖低聚糖具有活性的GH31α-木糖苷酶进行比较。结果(图5和6)显示出，尽管C.japonicus酶能够从玉米糠木聚糖中释放木糖，但是卵形拟杆菌GH31对相同量的多聚底物的活性多出约100倍，证实了对玉米木聚糖的α-木糖苷酶活性不是GH31酶的一般性质。
实例3：
玉米脱淀粉和玉米纤维胶(CFG)提取
脱淀粉玉米
107kg预碾磨玉米(<1.0mm)在53℃下与253kg水混合。将该混合物加热至95℃并且用1M NaOH将pH调节至6.2。添加1.12kg Termamyl 120L并且将该反应在约90℃保持3hr。3hr后，添加冷水至总反应重量为600kg。用Westfalia倾析器，CA-225-110，在4950rpm下，600L/小时流速下完成液固分离。使固体纤维部分再浆化并且用水分离两次至总重量为600kg，随后如以上所描述的进行分离。将最后的纤维部分分为较小部分并且冷冻干燥3-4天。
玉米纤维胶提取
将20g脱淀粉玉米与0.8g的NaOH和0.8g的Ca(OH)2一起添加至200mL煮沸的MilliQTM水中。将该混合物在96℃下保持1小时，并且然后在6000g下离心20min。
该上清液看上去是乳状的并多脂的，并且因此用己烷通过摇动提取脂肪(1份己烷比4份玉米纤维胶)。在静置时间后，通过移液管去除该己烷。
第二次提取(CFG2)是通过将球粒溶解于200mL 1M NaOH中进行的。将该混合物在96℃下保持1小时，并且然后在6000g下离心20min，并且用4M HCl将上清液调节至pH 6。
使用旋转蒸发仪(rotavap)浓缩两个CFG部分，并且以90％的终浓度在EtOH中沉淀。来自0.1M NaOH的球粒从此后称为CFG1。由于1M NaOH提取物(CFG2)中的高pH，使用3kDa透析膜在水龙头滴水的情况下将该部分在具有去离子水的2L计量用筒上透析过夜。
在应用试验之前，CFG1和CFG2二者在25000g下离心25min并且通过0.44μm针筒式滤器进行过滤。用Mettler Toledo HR73确定在CFG2部分中的干物质。
酶的玉米纤维胶水解
使用CFG2部分进行酶水解(见上文)。
该400μL测定在40℃下在摇动的艾本德(Eppendorph)恒温混匀仪，在1200rpm下进行17hr并且通过在97℃下加热10min停止该反应。该测定设置可发现于表1中。平行进行七个不同反应，并且在各自样品中的酶可以发现于表2中。
表2.
μL
CFG22.3％DM 350
0.25M柠檬酸钠pH 6 20
酶<sup>a</sup> 10
MilliQ 到400
a 10μL/酶。酶剂量：GH31，0.7g/L；GH95，0.7g/L；UltraFlo L 8％(v/v)
表2.
样品 样品中的酶
1 GH31*
2 GH95**
3 GH31+GH95
4 UltraFlo L+GH31
5 UltraFlo L+GH95
6 UltraFlo L+GH31+GH95
7 UltraFlo L
*GH31是在本申请中披露并要求保护的α-木糖苷酶
**GH95是披露于与本申请同时提交的同时待决专利申请中的α-L-半乳糖苷酶
UltraFlo L是来自诺维信公司(Novozymes A/S)的商业产品。
产生的单糖的HPLC分析
在戴安公司(Dionex)ICS-5000上通过高效阴离子交换层析用脉冲安培检测(HPAEC-PAD)使用CarboPac-20保护柱和分析住分析这些上清液。通过Chromeleon版本6.8控制该系统。相对从0.0002-0.02g/L的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的6点标准曲线量化所释放的单糖。使用表3中的程序注射25μL的每个样品。使用氦通过鼓泡将洗脱剂脱气10min并且该洗脱剂具有如下组分：A，MilliQ水；B，0.5M NaOH；C，0.5M NaOAc；D，60mMNaOAc。以1:50稀释样品1-3并且以1:200稀释样品4-7，在注射前两者都在水中。
表3.使用0.5mL/min的流速的PA-20洗脱程序
GH31从玉米纤维胶中释放木糖。GH31似乎加强了通过UltraFlo L实现的水解。
显示于图7和8中的数据明确证实了GH31可以被用来帮助降解玉米木聚糖连同从玉米木聚糖中释放特异性单糖。
实例4：
材料与方法
底物
a)经碾磨的玉蜀黍(碾磨谷粒以通过0.5mm筛)
b)将工业制备的脱淀粉玉蜀黍(IPDM)-碾磨的玉蜀黍用淀粉酶(来自诺维信公司的)在92℃-95℃下处理1.25小时，并且然后进行离心。将残余物用自来水(温度13℃)洗涤3次，并且最后在使用前进行冷冻干燥。从107kg的起始材料中获得64.5kg(在冷冻干燥前)，产生约20kg风干材料。
c)将NaOH处理的IPDM:IDPM用0.2M NaOH在室温下搅拌6h。在6h后将pH调节至5.5，并且在实验室用丙酮干燥前用自来水洗涤5次。从上述的研究中，已经查明该玉蜀黍的NaOH处理从经碾磨的玉蜀黍中去除乙酸和阿魏酸。
方法和方案
在玻璃试管中，在40℃下，使用NaAc缓冲液(pH 5)孵育样品4h。将它们离心；针对样品h-m的木糖测定(作为木糖的可溶木聚糖的确定)，收集上清液(表4)。使用戴安公司实施方法，针对单糖和低聚糖含量分析上清液的小等分试样(表1，样品h-m)。
使用针对不可溶性纤维的NSP方法，针对单糖分析从a-g中剩余的样品(表4)。
200mg脱淀粉玉米(DC)FFS-2013-00063/碱处理的脱淀粉玉米FFS-2013-00064
条件
4.9/4.8ml NaAc-缓冲液incl Ca++pH 5
100/200ul酶
在40℃下，4小时
表4.
表5.GH31对从脱淀粉玉米糠中释放的单糖的作用。糖水平表示为曲线下面积乘以稀释因子。
生物材料
在此参考微生物菌株卵形拟杆菌(ATCC 8483)的公开可得的保藏物，该保藏物由艾格丝(Eggerth)于1933保藏于ATCC(艾格丝(Eggerth)AH，加尼翁(Gagnon)BH.人类粪便拟杆菌属(The bacteroides of human feces.)细菌学杂志(J.Bacteriol.)25:389-413,1933)。
在此描述的和要求的本发明并非是要用在此公开的特定方面来限定范围，因为这些方面的用意是要作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (13)

1.一种具有α-木糖苷酶活性的分离的多肽在动物饲料和动物饲料组合物中的用途，该多肽包含的催化结构域包含Asp400和Asp 473，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少95％序列一致性的多肽；
(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入，其中该多肽相差不超过三十个氨基酸；和
(e)(a)、(b)、(c)、或(d)多肽的具有α-木糖苷酶活性的片段，其中该片段包含成熟肽的至少90％的氨基酸。
2.如权利要求1所述的用途，其中该多肽包含与SEQ ID NO:2的第22-814位氨基酸具有至少97.8％序列一致性的催化结构域。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中该多肽由以下各项组成：SEQ ID NO:2，SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:2的成熟多肽，SEQ ID NO:4的成熟多肽，SEQ ID NO:5的成熟多肽，或者其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至793，SEQ IDNO:4的氨基酸1至793或SEQ ID NO:5的氨基酸1至793。
5.一种包含具有α-木糖苷酶活性的分离的多肽的组合物，该组合物用于动物饲料或动物饲料添加剂；该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；和/或
(ii)(i)的全长互补链；
(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性；
(d)一种包含SEQ ID NO:3的成熟肽的一个或多个氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体，其中该多肽相差不超过三十个氨基酸；和
(e)(a)、(b)、(c)或(d)多肽的一种具有α-木糖苷酶活性的片段，其中该片段包含成熟肽的至少90％的氨基酸。
6.如权利要求5所述的组合物，其中该多肽包含SEQ ID NO:2的成熟肽或由其组成。
7.如权利要求5或6所述的组合物，其处于颗粒或微颗粒的形式。
8.如权利要求1至7中任一项指出的至少一种多肽在以下各项中的用途在动物饲料中；
在动物饲料添加剂中；
在用于动物饲料的组合物的制备中；
用于改善动物饲料的营养价值；
用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白；
用于增加动物饮食中的蛋白的水解程度。
9.一种用于改善动物饲料的营养价值的方法，其中向该饲料中添加至少一种如权利要求1至7中任一项指出的多肽。
10.一种动物饲料添加剂，包含
至少一种如权利要求1-6中任一项指出的多肽；和
至少一种脂-溶性维生素，和/或
至少一种水-溶性维生素，和/或
至少一种微量矿物质。
11.如权利要求10所述的动物饲料添加剂，其中该动物饲料包含一种或多种另外的酶，其中这些另外的酶选自下组，该组由以下各项组成：淀粉酶；植酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；以及β-葡聚糖酶，或其任何混合物。
12.如权利要求10或11所述的动物饲料添加剂，其包含至少一种益生菌或直接饲喂微生物(DFM)。
13.一种动物饲料，具有50至800g/kg的粗蛋白含量并且包含如权利要求1至7中任一项指出的至少一种多肽。
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