CN105675772A - 一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，以液相色谱-串联质谱联用检测方法检测果蔬中农药残留时，采用小体积进样：当样品为弱基质效应样品时，进样体积小于5μL；当样品为中等强度基质效应样品时，进样体积小于等于2μL；当样品为强基质效应样品时，先通过一定程度的基质稀释，再采用小体积进样。本发明通过小体积进样，无需使用大量溶剂进行稀释，降低了检测成本，降低了检测时间，提高了检测效率，不仅可以减弱基质效应，还能优化峰形从而提高仪器的方法灵敏度。

Description

一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法

技术领域

本发明涉及液相色谱-串联质谱联用检测技术领域，具体涉及液相色谱-串联质谱联用检测技术中减弱基质效应的方法。

背景技术

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用检测技术中，与目标物共流出的干扰物在离子源离子化时影响了分析物，从而产生了基质效应。主要包括：1.由于离子化时，带电液滴的表面大小和额外电量的数量(10^-5mol/L)都是有限的，所以干扰物会与目标物竞争这有限的表面和电量导致目标物离子化不完全；(2)干扰物的存在会改变分析物粘度、表面张力等物化性质而影响目标物的离子化；(3)基质中一些非挥发性物质会与目标化合物形成络合物或沉积物导致无法成功生成气态离子。基质效应按照影响效果可分为三类：ME<0，意味基质的存在抑制了分析物的响应值；ME＝0，表明基质的存在对该分析物的响应值无影响；ME>0，意味着基质的存在增强了分析物的响应。

基质效应按绝对值大小可以分为三个等级：

∣ME∣≥50％，称为强基质效应；

20％≤∣ME∣<50％，称为中等强度基质效应；

0％≤∣ME∣<20％，称为弱基质效应。

近几年，基质效应的消除和弥补方法得到广泛的研究，其中应用最多的是基质加标和基质稀释法。但是，基质稀释过程需要使用大量的有机溶剂并且耗时，标准曲线的配制不仅需要大量的空白样品，而且由于基体物质的复杂性使得标准样品的保存时间较短。液质联用检测系统中，由于增加了离子化的过程，当进样体积较大的时候，引入了更多的基质干扰物导致离子化不完全而影响方法的灵敏度，这就直接导致化合物的进样体积与响应值的线性范围变窄。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明提出一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，在减弱基质效应的同时，无需使用大量有机溶剂、不耗时。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，以液相色谱-串联质谱联用检测方法检测果蔬中农药残留时，采用小体积进样：当样品为弱基质效应样品时，进样体积小于5μL；当样品为中等强度基质效应样品时，进样体积小于等于2μL；当样品为强基质效应样品时，先通过一定程度的基质稀释，再采用小体积进样。

在传统液相色谱-串联质谱联用的检测中，一般选用5μL或10μL进行进样，所以进样体积小于5μL的进样即为本发明所指的小体积进样。

本发明通过小体积进样，无需使用大量溶剂进行稀释，降低了检测成本，降低了检测时间，提高了检测效率，不仅可以减弱基质效应，还能优化峰形从而提高仪器的方法灵敏度。

优选的，当强基质效应样品为甘蓝时，将甘蓝样品稀释10倍后，进样体积小于2.5μL。

优选的，质谱的扫描模式为多反应监测扫描模式；离子模式为电喷雾正离子源ESI⁺。

优选的，质谱的参数如下：池加速电压为4V，驻留时间，20ms；干燥气温度，325℃；干燥气流速，8L/min；雾化器压力，35psi；鞘气温度，375℃；鞘气流速，11L/min；毛细管电压，4000V；光电倍增管电压，300V。

优选的，液相色谱柱为50mm×2.1mm，1.8μm粒径，流速为0.3mL/min，运行时间为8min，柱温为35℃。

优选的，液相色谱流动相A为纯水，流动相B为甲醇。

进一步优选的，所述梯度洗脱程序为，起始时间，流动相A：B的体积比为90:10，维持0.2min；在0.2-5min内，体积比由90:10线性变化至10:90，并维持该体积至6min，6.1min时，体积比迅速变回起始体积比—90:10。

进一步优选的，样品的提取和净化的方法为，将样品放至离心管中加入提取剂，再在匀浆机上匀质后加入NaCl和无水MgSO₄，然后震荡离心，取上层清液干燥后加入流动相A和B的混合液溶解，最后将溶液过尼龙膜后进样。无水MgSO₄去除过量的水，NaCl使有机相和水相充分分离，并调节有机相离子浓度从而提高提取效率。

更进一步优选的，称5.0g样品到聚乙烯离心管中；然后加入5mL甲酸-乙腈(0.1+99.9，V/V)提取剂，在匀浆机上7000r转速下匀质2分钟；接着向离心管中加入0.8gNaCl和3.0g无水MgSO₄；在漩涡机上震荡1min(3000rpm)并且在0℃和10000rpm转速下离心10min；取1mL上层清液到玻璃试管中，然后氮吹干，加入1mL水-甲醇(50+50,v/v)溶解目标物；最后，将溶液过0.22μm尼龙膜进样。采用甲酸-乙腈(0.1+99.9，V/V)提取剂，农药的回收率最佳，采用0.8gNaCl和3.0g无水MgSO₄能够提高目标回收率。

更进一步优选的，将加入NaCl和无水MgSO₄后的离心管放入至冷水中冷却。防止无水硫酸镁遇水结块。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明不仅可以减弱基质效应，还能优化峰形从而提高仪器的方法灵敏度。

2.本发明方便快捷、回收率高、结果可靠。

3.本发明无需使用大量溶剂进行稀释，降低了检测成本，降低了检测时间，提高了检测效率。

附图说明

图1为26种化合物在四种不同的提取剂[乙腈、甲酸-乙腈(体积比0.1:99.9)、甲酸-乙腈(体积比为1:99)、乙腈-水(体积比为75:25)]下的回收率柱状图，基质是西红柿，目标化合物的添加浓度是20μg/kg；

图2为四种不同的基质效应与进样体积的关系：(A)对数关系，以10μg/kg噻虫嗪在苹果提取液为例；(B)当进样体积在0.5μL-2μL时，基质效应都在可忽略的水平，当进样体积增加到5μL时，基质效应从-18％急剧增加到-60％，曲线是在20μg/kg浓度下3-羟基克百威在苹果中的基质效应随体积的变化；(C)进样体积与基质效应几乎不相关，图以10μg/kg甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在黄瓜中为例；(D)基质效应随进样体积的增大线性增大，以20μg/kg二嗪磷在苹果中为例，R²>0.99。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。

仪器和试剂

液相色谱-三重四级杆串联质谱，型号是配有电喷雾离子化电源(ESI)和大气压化学电离源(APCI)两种离子源的安捷伦6460系列，产自于美国安捷伦科技公司(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)。电子天平的型号是AL204，从梅特勒-托利多仪器有限公司购买；漩涡机型号为MS3DS25，产自德国IKA公司；氮吹仪型号为N-EVAP^TM112；

所有的农药标准品(纯度，≥98.0％)均生产于德国的EhrenstorferGmbH(Augsburg,Germany)和美国的AccuStandard(USA)两家公司，从中国农业部环境保护科研监测所购买。所有农药的储备浓度是1000μg/L，用甲醇稀释标准品所得，储藏在-18℃的冰箱中，有限期为一年。低浓度的标样和混合标样，临用时，将储备液按照一定的比例用甲醇稀释所得。

乙腈、甲醇均是高效液相色谱级别的有机试剂，购买于赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)；所用的固体试剂如无水硫酸镁(MgSO₄)和氯化钠(NaCl)是分析纯，购买于国药集团，无水硫酸镁在使用前均在220℃温度下烘干12小时；甲酸也是分析纯购买于天津的科密欧公司；净化粉PSA产自于安捷伦公司。

空白的蔬菜样品取自蔬菜大棚，在种植过程中未施加任何农药。实际检测样品是从山东省当地的市场购买的，取其中可食的部分用于检测。剪碎后放到塑料袋子里，冷冻在冰箱里面。

LC-MS/MS分析条件

分析过程中，质谱的仪器参数如下：扫描模式，多反应监测扫描模式(MRM)；离子模式(IonizationMode)为电喷雾正离子源ESI⁺；池加速电压(cellaccelerationvoltage)为4V；驻留时间(dwelltime)，20ms；干燥气温度(dryinggastemperature)，325℃；干燥气流速(dryinggasflow)，8L/min；雾化器压力(nebulizerpressure)，35psi；鞘气温度(sheathgastemperature)，375℃；鞘气流速(sheathgasflow)，11L/min；毛细管电压(capillaryvoltage)，4000V；光电倍增管电压(deltaEMV)，300V，采集和数据处理软件用的是安捷伦MassHunter7.0版本。

液相色谱参数如下：使用的色谱柱是产自安捷伦公司的AZORBAXSB-C18柱(50mm×2.1mm，1.8μm粒径)，流速为0.3mL/min，运行时间为8min，柱温为35℃，进样量为1μL。流动相为A：纯水，B：甲醇。梯度洗脱程序：起始时间，流动相A：B体积比为90:10该比例维持0.2min；在0.2min-5min期间，比例由90:10线性变化到10:90；维持该比例到6min；到6.1min时，迅速变回起始比例90:10。

样品提取和净化

将苹果、茄子、番茄、黄瓜、丝瓜和甘蓝从冰箱中拿出解冻，然后称5.0g样品到聚乙烯离心管中。然后加入5mL甲酸-乙腈(0.1+99.9，V/V)提取剂，在匀浆机上7000r转速下匀质2分钟。接着向离心管中加入0.8gNaCl和3.0g无水MgSO₄,为了防止无水硫酸镁遇水结块，立刻将离心管放入到冷水中冷却。在漩涡机上震荡1min(3000rpm)并且在0℃和10000rpm转速下离心10min。取1mL上层清液到玻璃试管中，然后氮吹干，加入1mL水-甲醇(50+50,v/v)溶解目标物。最后，将溶液过0.22μm尼龙膜进样。

质谱条件优化

化合物的质谱优化过程包括：首先通过全扫描模式(Massfullscanmode)确定母离子，找到具有高质荷比和高响应值的准母离子，因为它们能够裂解出较高响应的子离子。然后，在单离子扫描模式下(SIM-Scan)对影响母离子的去簇电压(Fragmentvoltage)进行优化,找到母离子最佳响应条件后，再对母离子施加一定的碰撞能使其裂解出不同的子离子，该过程是在子离子扫描模式(production-scan)下进行，选择特征性强、干扰小、响应值高的两个碎片离子为特征离子，较好的选为定量离子，另一个则为定性离子。最后，在多反应监测模式(MRM-Scan)下对定量和定性离子进行碰撞能的优化。按照该过程对26种农药的最佳分析条件进行了优化，结果见表1。

表126种目标化合物的相对分子量、保留时间和最优质谱条件

带“*”定量离子；带“a”为定量离子的碰撞能

提取溶剂的选择

用番茄空白样品按照前面的样品前处理方法做了26种目标化合物在0.02mg/kg浓度下的回收率，对四种不同的提取剂分别是乙腈、乙腈-甲酸(99.9+0.1,v/v)、乙腈-甲酸(99+1,v/v)和乙腈-水(75+25,v/v)进行对比，得到目标化合物的回收率如下图1。

从图1中可看出，当提取剂选用乙腈-甲酸(99.9+0.1,v/v)时，各化合物的回收率最理想，所以本研究最终选择该提取剂。

线性、线性范围、定量限(LOQ)和检出限(LOD)

以分析物的进样浓度(μg/L)为横坐标，以在质谱上采集的分析物的定量离子响应值为纵坐标进行了线性回归，选取了1,5,10,50,100,200和500μg/L七个浓度点完成基质加标曲线，结果见表1，在156个目标化合物-基质组合中(26种化合物×6种基质)其中69％的组合线性范围比较宽，在1-500μg/L范围内均有良好的线性关系。13.1％的组合在较低浓度时线性范围不是很好，所以只在5-500μg/L浓度范围内，有较好的线性相关，与此相似，还有近3％的组合在10-500μg/L才能获得较好的线性关系。还有一些组合，在较高浓度时反而得不到良好的线性关系，其中约9.5％的组合线性范围在1-200μg/L，约3％的组合在1-100μg/L范围内才能有较好的线性相关性。还有些极个别的组合在低浓度和高浓度时，线性关系都不行，如啶虫脒-甘蓝、除虫脲-甘蓝、鱼藤酮-茄子和辛硫磷-茄子组合，线性范围是5-200μg/L。不管线性范围是多少，线性相关性系数数R²均大于0.99，具体数据见表2所示。

分析物-基质组合的定量限结果见表2，所有目标物的定量限均远低于欧盟等各国规定的最大残留限量值。

表226种化合物在甲醇溶剂和6种基质中的线性方程，R²和线性范围

()中的为甘蓝基质稀释10倍后的定量限和检出限。

重复性(RSD)和回收率(R)

利用优化好的QuEChERS前处理方法，对6种空白样品进行添加回收实验，添加浓度为10μg/kg，50μg/kg，100μg/kg，每个添加水平做五次平行，得出本检测方法的回收率(R)结果见表3。从结果中可看出方法的回收率几乎都在70％-120％之间，除了二甲戊灵在甘蓝基质中的提取富集率低于60％。一般分析方法的重复性用相对标准偏差来衡量，对同一天的五次平行样品和连续五天做同一样品分析进行了标准偏差验证，结果见表4。从表中可看出intra-dayRSDs均低于10％，inter-dayRSDs均低于20％。

表326种化合物在6种基质中的回收率(10,50,and100μg/kg)。

表4化合物在基质中的日间和日内重复性。

方法的实际样品验证

通过分析从山东省济南市场购买的6种样品进行方法的应用性验证，按照前面的实验方法对每种基质(苹果、黄瓜、茄子、丝瓜、甘蓝和番茄)做五次平行检测。

在26种分析物中，23种农药被检测出来，含量从1.15μg/kg到148μg/kg不等，苹果中检测出来的化合物最多，有9种，其次是甘蓝中检出8种、黄瓜检出7种、丝瓜和茄子均含5种、番茄含4种分析物。所有检测出来的目标物含量均低于中国的最小残留限量。具体结果见表5。

表5实际样品的农药残留检测结果

基质效应的测定

基质效应较精确的计算方法是利用目标化合物在基质提取液和在纯溶剂中的线性方程斜率来求得，具体的计算公式如下：

利用该方法计算不同化合物在不同基质中的基质效应时，首先需要用溶剂(甲醇)和空白基质提取液当溶剂配置不同浓度的标准样品。标样浓度为1,5,10,50,100和500μg/L五个浓度，进样量为1μL，得出的基质效应如表6

表626种农药在六种基质中的基质效应

基质效应与进样体积的关系

从表6中可以看到，同一种化合物在不同的基质中，基质效应差距很大，按照大部分的化合物在不同样品中的基质效应强弱，将样品分为三类：苹果和番茄归为弱基质效应样品(∣ME∣<20％)；黄瓜、丝瓜和茄子归为中等强度基质效应样品(20％≤∣ME∣<50％)；甘蓝归为强基质效应样品(∣ME∣≥50％)。

对七个进样体积分别是0.5μL，1μL，2μL，4μL，5μL，8μL，10μL进行了线性研究，得出每种化合物在番茄基质中的进样体积线性范围见表7。

表726种分析物在番茄基质中进样体积的线性范围，线性方程和相关系数，进样浓度是10μg/kg。

分别各选具有弱基质效应的苹果样品、中等强度基质效应的黄瓜样品和强基质效应的甘蓝样品研究进样体积与基质效应的关系。由于研究的是一个浓度下不同进样体积的基质效应，我们按照如下方程式2来计算基质效应

综合考虑找寻一个最佳进样体积既可以保证进样器的再现性也能较好的保证基质效应减小到忽略的水平。在78种化合物/基质组合中(26种化合物×3种基质)，得出四种体积与基质效应的关系，如图2，各分析物在三种基质中的基质效应随体积的关系类型总结在表8和表8续中。

表8不同化合物在苹果、黄瓜、甘蓝基质和甘蓝10倍稀释后，基质效应与进样体积的方程，相关系数R²以及临界体积。

表8续

注释：x代表进样体积；y代表基质效应；线性类型见图2

临界体积与基质稀释

从表7-8可看出，进样体积越小基质效应越弱，但是考虑到液相色谱注射器的灵敏度问题，我们将能使基质效应减弱到可以忽略的水平(|ME|≤20％)的最大进样体积定义为临界体积。对于具有弱基质效应的样品苹果和具有中等强度基质效应的样品黄瓜，几乎每种化合物都有其临界体积，在弱基质效应的苹果中，临界体积通常都大于1μL小于等于5μL；在中等强度基质效应的黄瓜样品中，绝大多数化合物的临界体积分布在1μL左右；而对于强基质效应的甘蓝样品，有很大一部分化合物没有临界体积。因此为了研究出相似的规律，对强基质效应的甘蓝样品进行了10倍稀释，得出的临界体积和线性方程结果见表8续。对甘蓝稀释后的方法定量限的测定结果见表2，从表2中可看出，基质的稀释几乎没有影响化合物的检出限和定量限。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，以液相色谱-串联质谱联用检测方法检测果蔬中农药残留时，采用小体积进样：当样品为弱基质效应样品时，进样体积小于5μL；当样品为中等强度基质效应样品时，进样体积小于等于2μL；当样品为强基质效应样品时，先通过一定程度的基质稀释，再采用小体积进样。

2.如权利要求1所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，当强基质效应样品为甘蓝时，将甘蓝样品稀释10倍后，进样体积小于2.5μL。

3.如权利要求1所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，质谱的扫描模式为多反应监测扫描模式；离子模式为电喷雾正离子源ESI⁺。

4.如权利要求3所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，质谱的参数如下：池加速电压为4V，驻留时间，20ms；干燥气温度，325℃；干燥气流速，8L/min；雾化器压力，35psi；鞘气温度，375℃；鞘气流速，11L/min；毛细管电压，4000V；光电倍增管电压，300V。

5.如权利要求1所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，液相色谱柱为50mm×2.1mm，1.8μm粒径，流速为0.3mL/min，运行时间为8min，柱温为35℃。

6.如权利要求1所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，液相色谱流动相A为纯水，流动相B为甲醇。

7.如权利要求6所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，所述梯度洗脱程序为，起始时间，流动相A：B的体积比为90:10，维持0.2min；在0.2-5min内，体积比由90:10线性变化至10:90，并维持该体积至6min，6.1min时，体积比迅速变回起始体积比—90:10。

8.如权利要求6所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，样品的提取和净化的方法为，将样品放至离心管中加入提取剂，再在匀浆机上匀质后加入NaCl和无水MgSO₄，然后震荡离心，取上层清液干燥后加入流动相A和B的混合液溶解，最后将溶液过尼龙膜后进样。

9.如权利要求8所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，称5.0g样品到聚乙烯离心管中；然后加入5mL甲酸-乙腈体积比为0.1:99.9的提取剂，在匀浆机上7000r转速下匀质2分钟；接着向离心管中加入0.8gNaCl和3.0g无水MgSO₄；在漩涡机上3000rpm下震荡1min，并且在0℃和10000rpm转速下离心10min；取1mL上层清液到玻璃试管中，然后氮吹干，加入1mL水-甲醇体积比为50:50的溶剂溶解目标物；最后，将溶液过0.22μm尼龙膜进样。

10.如权利要求9所述的一种液质联用检测技术中减弱基质效应的方法，其特征是，将加入NaCl和无水MgSO₄后的离心管放入至冷水中冷却。