CN105675609B - 一种视网膜光损伤测量装置与定量评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于定量评定光源对视网膜色素上皮细胞的光损伤的测量装置，以及一种基于视网膜光损伤测量装置的量化评价方法，该方法能够快速、有效、准确的评价视网膜光损伤的量化指标。本发明的视网膜光损伤测量装置能提供稳定的测试环境和测试条件，通过定量的评价方法能够准确有效的评定光源对视网膜色素上皮细胞的光损伤程度。本发明有效解决了目前利用视网膜色素上皮细胞系评价有无光损伤等的评价结果存在可重复性、精确性方面的重大问题，从而为相关的照明产品研发和科研提供数据支持。

Description

一种视网膜光损伤测量装置与定量评价方法

技术领域

本发明属于生物化学检测领域，具体涉及用于定量评定光源对视网膜色素上皮细胞的光损伤的测量装置和测量方法。

背景技术

为了评价不同光源对人眼视网膜的安全性，通常使用主观的反馈式调查或者动物个体进行大量的光损伤试验。这些试验中，将光照所产生的对人眼的刺激与组织损伤统称为光化学损伤试验。

在近40年来研究中，许多学者利用各种实验动物(主要是小动物)进行了大量的有关视网膜光损伤及其机制的研究。作为光损伤试验方法中应用最广的方法，已知的有例如对小动物进行高强度光照或持续光照损伤。该试验方法如下：使用小鼠或大鼠，放置于设有高强度光照的鼠笼中，一定时间之后对动物眼睛进行视功能评估，或取动物眼球固定切片后评价视网膜细胞的凋亡程度，试验时取非光照动物作为阴性对照，对所取得的判断结果进行比较，并由此评价光对动物眼睛的损伤程度。

然而，但由于实验动物是运动的个体，对接收恒定光照强度这一实验条件往往无法达到，以致其实验研究的稳定性、可重复性及科学可信度也就大大下降。此外，由于近年来的动物福利问题、欧洲等出现的强化动物实验规范，对开发不使用实验动物的光损伤试验方法用的替代法的要求强烈。

另一方面，部分研究证明体外(in vitro)培养细胞会在光照射的影响下发生细胞凋亡。目前，国内外开始关注和侧重于对体外培养视网膜细胞(光感受器细胞)进行光损伤机制及药物开发的研究。AichaLaabich等利用体外培养的牛视网膜细胞，在A2E和强光条件下使用不同黄酮醇物质研究其防护作用(Exp Eye Res 2007；85：154-165.)。GerassimosLascaratos等人利用视网膜细胞对可见光影响线粒体作用诱导神经性死亡进行了相关研究(Vision Res 2007；47：1191-1201.)。AicbaLaabicb等也利用牛原代培养的视网膜细胞，探究了藏红花原色素对蓝白光介导细胞死亡的防护作用进行了研究(InvestOphthalmol Vis Sci 2006；47：3156-3163.)。从上述研究可以看出，体外培养的视网膜细胞可以作为评估视网膜光损伤的模型。

然而，目前仍然没有一个稳定体系可以精确评价特定光源对视网膜细胞的光化学损伤程度。首先是细胞选择问题。有些研究使用了原代培养的动物视网膜感光细胞，但这类细胞在体外培养过程中无法稳定扩增，因此试验的可重复性较差；有些研究使用了视网膜色素上皮细胞株，但该类细胞在培养的不同阶段呈现完全不同的细胞生理特性，因此也导致了不同研究的结果差异性很大。

目前利用视网膜色素上皮细胞系评价有无光损伤等的评价结果存在可重复性、精确性方面的重大问题，而且在实际预测对人眼视网膜的安全性方面，这种方法也并不是总能充分令人满意，人们期望开发一套稳定的、高精度的体外光化学损伤试验装置和方法。

发明内容

为克服公知技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种视网膜光损伤测量装置与定量评价方法。该装置能提供稳定的测试环境和测试条件，通过定量的评价方法能够准确有效的评定光源对视网膜色素上皮细胞的光损伤程度，从而为相关的照明产品研发和科研提供数据支持。

根据本发明的一个方面，提供了一种量测装置，所述的量测装置的特征在于：包括第一温湿度调节单元1、温湿度传感器2、固定隔光板3、细胞培养皿14，第二温湿度调节单元2、测试平台6、测量箱7、第一滤光系统(第一升降轴轴71和第一滤光膜层8)、第二滤光系统(第二升降轴72和第二滤光膜层9)、测试光源放置台10、升降轴固定卡件11、测试光源101、第一减速机电机13、第二减速机电机12、控制和显示单元14、气体分析装置15。

其中测量箱整体结构为一个密闭的圆筒型，外部光线不会照入内部，密闭的圆筒可以从顶部或底部打开，进行内部结构的调整和放置。测试平台位于中上部，第一二滤光系统位于中部，测试光源放置台位于中下部。可将多个细胞培养皿4分组(测试组和对照组)放置于测试平台6上，用于定量分析视网膜细胞的光损伤程度。对照组区域会放置遮光层41完全屏蔽光源的照射。测试光源101以分布均匀的方式放置在测试光源放置台10内，并通过测试光源放置台10的控制单元14对测试光源101进行打开和关闭的控制。测试光源101可以是根据测试需求，配置不同的光源，例如LED、荧光灯、球泡灯等，如图1所示。

所述第一温湿度调节单元1包括进风机、出风机和加湿机，第二温湿度调节单元2包括一个进风机、出风机和除湿机，能依据温湿度传感器2实时采集的温湿度信号，进行温湿度的调控，保证测量箱内的温度稳定在37±1℃，湿度小于等于85％。

其中，第一滤光系统由第一滤光膜层8和第一升降轴71组成，第一滤光膜层8可衰减光强度，第一滤光膜层8固定在第一升降轴71上，可以上下升降有效调节照在培养皿4上的不同比例光照强度。第一滤光膜层可以手动进行更换不同透射比的滤光膜。第二滤光系统由第二滤光膜层9和第二升降轴72组成，第二滤光膜层9改变光谱成分，第二滤光膜层9固定在第二升降轴72上，可以调节光的不同光谱的透射比，达到评测不同光谱的目的。第二滤光膜层9可以手动进行更换不同透射光谱的滤光膜。

所述第一升降轴71位于第二升降轴72的内部，两个轴可以各自独立相对运动。第一减速机电机13驱动第一升降轴71的升降，第二减速机电机12驱动第一升降轴72的升降。

所述控制和显示单元14可以控制第一减速机电机13和第二减速机电机12的开启和关闭，可以控制测试平台10的通电开关，可以实时显示温湿度传感器2的实时温湿度，并根据温度变化控制第一温湿度调节单元和第二温湿度调节单元实时调节装置内的温湿度。控制和显示单元14可以是固定终端(台式机)和便携式(手机或Pad)终端的一种或几种的组合。

所述第一温湿度调节单元1能依据温湿度传感器2实时采集的温湿度信号，进行温湿度的调控，保证测量箱内的温度稳定在37±1°，湿度小于等于85％。所述细胞培养皿2在定量测试过程中应放置在测试平台6上。

所述测试平台6是透明结构，保证下部在测试光源放置台10所装配的测试光源101发射的光线能够透过测试平台6照射到细胞培养皿中，测试平台6上可放置多个培养皿4，并均匀排布，测试平台6上的培养皿4将分成测试组和对照组用于定量分析视网膜细胞的光损伤程度，对照组区域会放置遮光层9完全屏蔽光源的照射。

所述温湿度传感器2可以设置一个或多个放置在测试平台6上，用于监控细胞培养皿4所处的温湿度状态。

所述测试光源放置台10位于测量箱7的底部，测试时，将测试光源101均匀的分布固定在测试光源放置区台上。测试光源放置台10的中心位置设有容纳第二升降轴72穿过的通孔。

所述测量箱7为一个密闭的圆筒型箱体，能有效屏蔽外界的光照对测试光源的影响，确保照射到细胞培养皿的光刺激均来自测试光源。

所述控制和显示终端14可以是固定终端(台式机)和便携式(手机或Pad)终端的一种或几种的组合。控制和显示单元14分别与第一温湿度调节单元1、温湿度传感器2、第二温湿度调节单元5相连，接收并实时显示温湿度传感器2采集的温湿度数据，控制第一温湿度调节单元1或第二温湿度调节单元5进行温湿度调节；

所述固定隔光板3垂直安装在测试平台6的上表面，其高度为测试平台6的上表面到圆筒结构顶部的距离，宽度为圆筒结构内直径；

所述遮光层41位于测试平台6的下方，可以完全屏蔽测试光源101从下部照射上来的光辐射。

所述气体分析装置15，用于检测二氧化碳、微颗粒物、有害气体的浓度，其安装于测试平台6内，与控制和显示单元14相连。

根据本发明的另一个方面，提供了一种基于视网膜光损伤测量装置的量化评价方法，该方法能够快速、有效、准确的评价视网膜光损伤的量化指标。

更具体地，本发明提供的光损伤试验方法包括一下步骤：

(1)第一步骤：稳定培养人视网膜色素上皮细胞，采用特定成分培养基，在细胞培养皿2中铺下细胞后持续培养3周至细胞呈现铺满(confluent)状态；

(2)第二步骤：将稳定培养细胞的培养皿2放置于光强可调、温度可控、严格模拟人眼参数的密闭测量箱7中，用测试光源8(可置换)照射稳定的时间(一般为4.5-12小时)；

(3)第三步骤：回收在所述第二步骤中光照的人视网膜色素上皮细胞，测定回收的培养细胞中的细胞活力(CellViability，CV)或与细胞凋亡相关的线粒体膜电位；

(4)第四步骤：根据第三步骤测定的数字化结果评价特定光源在特定光强条件下对细胞有无产生光化学损伤及其程度；

上述第一步骤所述的特定成分培养基是不含L-色氨酸、L-酪氨酸、叶酸、核黄素和酚红的DMEM细胞培养基；

上述第一步骤所述的细胞培养至少3周，保证其在细胞培养皿2中达到铺满(confluent)状态；

进一步的，所述人视网膜色素上皮细胞包括两类：一类是来自干细胞的视网膜色素上皮细胞；另一类是永生化的人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19型)；所述干细胞包括人类胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞；所述的视网膜色素上皮细胞已知在一种既定LED照射下会发生显著的细胞活性下降和线粒体膜电位改变，作为阳性对照组；此外，将同批培养的细胞置于无光照条件下，作为阴性对照组；

进一步的，所述的细胞活力检测方法，采用水溶性四唑盐WST-8【化学名(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐】用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目。在电子耦合试剂存在的情况下，被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜染料Formazan。甲臜染料能够溶解在组织培养基中，与活细胞数量成正比。通过检测吸光值比色，可以动态地量化活细胞的数量，从而对细胞增殖或药物毒性进行检测。

(5)第五步骤：获得测试光照细胞的细胞活力值CV_S。每次设定阴性对照(非光照)组，同样条件下同时进行活力检测后获得细胞活力值CV_C。细胞光损伤程度CV计算如公式一所示：

式中：

CV_S光照细胞(阳性组)的细胞活力值；

CV_C为非光照细胞(阴性组)的细胞活力值

n为配对测试有效样本的组数。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于提供了稳定的测试环境和测试条件，取得了以下有益效果：能够达到准确定量检测视网膜细胞光损伤程度。

附图说明

图1为本发明的测量装置矢状位剖面结构示意图。

图2为本发明的测量装置整体结构示意图

图3为本发明的测试平台上放置细胞培养皿的一种示例图。

图4为人皮肤成纤维细胞和人视网膜色素上皮细胞在光照后的CV变化结果。

图5为人视网膜色素上皮细胞的CV随光照时间的变化情况。

图6为控制和显示单元的控制部件示意图

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

如图1所示，本发明的测量装置包括：第一温湿度调节单元1、温湿度传感器2、固定隔光板3、细胞培养皿4，第二温湿度调节单元5、测试平台6、测量箱7、第一升降轴轴71、第一滤光膜层8、第二升降轴72、第二滤光膜层9、测试光源放置台10、升降轴固定卡件11、测试光源101、第一减速机电机13、第二减速机电机12、控制和显示单元14、气体分析装置15(可选配)。

如图2所示，本发明的测量箱7整体结构为一个密闭的圆筒型，外部光线不会照入内部，密闭的圆筒可以从顶部或底部打开，进行内部结构的调整和放置。测试平台位于中上部，第一二滤光膜层位于中部，测试光源放置台位于中下部。

细胞培养皿4中铺下细胞后持续培养3周至细胞呈现铺满(confluent)状态后，将多个细胞培养皿4分组放置于测试平台6上，细胞培养皿数量为双数个(图3所示为6个)，分为两组，测试组和对照组，用于定量分析视网膜细胞的光损伤程度。对照组区域会放置遮光层41完全屏蔽光源的照射。

测试光源101以分布均匀的方式放置在测试光源放置台10内，并通过测试光源放置台10的控制单元14对测试光源101进行打开和关闭的控制。测试光源101可以是根据测试需求，配置不同的光源，例如LED、荧光灯、球泡灯等，如图1所示。

第一温湿度调节单元1包括进风机、出风机和加湿机，第二温湿度调节单元2包括一个进风机、出风机和除湿机，能依据温湿度传感器2实时采集的温湿度信号，进行温湿度的调控，保证测量箱内的温度稳定在37±1℃，湿度小于等于85％。

第一滤光系统由第一滤光膜层8和第一升降轴71组成，第一滤光膜层8可衰减光强度，第一滤光膜层8固定在第一升降轴71上，可以上下升降有效调节照在培养皿4上的不同比例光照强度。第一滤光膜层可以手动进行更换不同透射比的滤光膜。

第二滤光系统由第二滤光膜层9和第二升降轴72组成，第二滤光膜层8改变光谱成分，第二滤光膜层9固定在第二升降轴72上，可以调节光的不同光谱的透射比，达到评测不同光谱的目的。第二滤光膜层72可以手动进行更换不投透射光谱的滤光膜。

第一升降轴71位于第二升降轴72的内部，两个轴可以各自独立相对运动。第一减速机电机13控制第一升降轴71的升降，第二减速机电机12控制第一升降轴72的升降。第一和第二升降轴通过升降轴固定卡件11固定于圆筒的正中部，测试光源放置台10下方具有安装固定卡件的固定隔板，固定隔板为圆盘结构，其边缘与圆筒内壁固定连接。卡件11固定在安装座的中央位置。

所述固定隔光板3垂直安装在测试平台6的上表面，其高度为测试平台6的上表面到圆筒结构顶部的距离，宽度为圆筒结构内直径；

对照组区域放置遮光层41以完全屏蔽光源的照射；所述遮光层41粘贴在测试平台6的下表面。

进一步地，本发明还可安装气体分析装置15，用于检测二氧化碳、微颗粒物、有害气体的浓度，其安装于测试平台6内，与控制和显示单元14相连。

如图6所示，控制和显示单元14可以控制第一减速机电机13和第二减速机电机12的开启和关闭，并通过减速机电机控制升降轴的上下位移，通过已经设置好的光源参数、滤光膜参数，以及第一升降轴71与第二升降轴72相对位置自动计算得出照到测试平台上的光参数信息。所述光参数信息为光源的照度参数，计算照度参数的方法如公式二所示：

式中：

E为光照度；

I为光源辐射强度；

T₁为第一滤光膜层的透射率，T₂为第二滤光膜层的透射率；

k为环境系数，一般为1；

d₁为培养皿到第一滤光膜层的垂直距离，d₂为第一滤光膜层到第二滤光膜层的垂直距离，d₃为第二滤光膜层到测试光源的垂直距离。

控制和显示单元14可以控制测试平台10的通电开关，可以实时显示温湿度传感器2的实时温湿度，并根据温度变化自动调控第一温湿度调节单元1和第二温湿度调节单元5实时调节装置内的温湿度。控制和显示单元14可以是固定终端(台式机)和便携式(手机或Pad)终端的一种或几种的组合。

根据本发明的另一个方面，提供了一种基于视网膜光损伤测量装置的量化评价方法，该方法能够快速、有效、准确的评价视网膜光损伤的量化指标。

更具体地，本发明提供的光损伤试验方法包括一下步骤：

(1)第一步骤：稳定培养人视网膜色素上皮细胞，采用特定成分培养基，在细胞培养皿4中铺下细胞后持续培养3周至细胞呈现铺满(confluent)状态；(2)第二步骤：将多个稳定培养细胞的培养皿4分组放置于测试平台6上，细胞培养皿数量为双数个(图3所示为6个)，分为两组，测试组和对照组，用于定量分析视网膜细胞的光损伤程度。对照组区域会放置遮光层41完全屏蔽光源的照射，通过控制单元14打开测试光源101(可置换)并照射稳定的时间(一般为4.5-12小时)；

(3)第三步骤：回收所述第二步骤中光照的人视网膜色素上皮细胞，测定回收的测试组和对照组培养细胞中的细胞活力(Cell Viability，CV)或与细胞凋亡相关的线粒体膜电位；

(4)第四步骤：根据第三步骤测定的数字化结果评价特定光源在特定光强条件下对细胞有无产生光化学损伤及其程度；

上述第一步骤所述的特定成分培养基是不含L-色氨酸、L-酪氨酸、叶酸、核黄素和酚红的DMEM细胞培养基；

上述第一步骤所述的细胞培养至少3周，保证其在细胞培养皿2中达到铺满(confluent)状态；

进一步的，所述人视网膜色素上皮细胞包括两类：一类是来自干细胞的视网膜色素上皮细胞；另一类是永生化的人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19型)；所述干细胞包括人类胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞；所述的视网膜色素上皮细胞已知在一种既定LED照射下会发生显著的细胞活性下降和线粒体膜电位改变，作为阳性对照组；此外，将同批培养的细胞置于无光照条件下，作为阴性对照组；

进一步的，所述的细胞活力检测方法，采用水溶性四唑盐WST-8【化学名(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐】用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目。在电子耦合试剂存在的情况下，被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜染料Formazan。甲臜染料能够溶解在组织培养基中，与活细胞数量成正比。通过检测吸光值比色，可以动态地量化活细胞的数量，从而对细胞增殖或药物毒性进行检测。

(5)第五步骤：获得测试光照细胞的细胞活力值CV_S。每次设定阴性对照(非光照)组，同样条件下同时进行活力检测后获得细胞活力值CV_C。细胞光损伤程度CV计算如公式一所示：

式中：

CV_S光照细胞(阳性组)的细胞活力值；

CV_C为非光照细胞(阴性组)的细胞活力值；

n为配对测试有效样本的组数。

图4所示的CV结果分析图表示人视网膜色素上皮细胞在光照后的细胞活力(cellviability)发生显著下降(p＜0.001)，而人皮肤成纤维细胞在相同光照条件下细胞活力不变。证明人视网膜色素上皮细胞是评估光损伤的有效细胞模型。其中，NS——没有显著性差异，***——有极其显著性差异。

图5显示随着光照时间的增加，人视网膜色素上皮细胞的细胞活力呈现持续性降低趋势。

尽管本发明已经参照实施例描述，本领域内技术人员将理解可做出各种改变并且可代替等同物而不偏离本发明的范围。另外，可做出许多修改以使特定情况或材料适应于本发明的教导而不偏离它的范围。因此，规定本发明不限于公开的特定实施例，而本发明将包括落入附上的权利要求的范围内的所有实施例。

Claims (12)

1.一种视网膜光损伤测量装置，其特征在于：所述装置包括第一温湿度调节单元(1)、温湿度传感器(2)、固定隔光板(3)、细胞培养皿(4)、第二温湿度调节单元(5)、测试平台(6)、测量箱(7)、第一滤光系统、第二滤光系统、测试光源放置台(10)、测试光源(101)、第一减速机电机(13)、第二减速机电机(12)和控制和显示单元(14)；

测量箱(7)为密闭的圆筒结构，其顶部或底部能够打开；测试平台(6)位于测量箱(7)的中上部，第一滤光系统和第二滤光系统位于测量箱(7)的中部，测试光源放置台(10)位于测量箱(7)的中下部；

固定隔光板(3)垂直安装在测试平台(6)的上表面，其高度为测试平台(6)的上表面到圆筒结构顶部的距离，宽度为圆筒结构内直径；

测试光源(101)放置在测试光源放置台(10)内；

第一滤光系统由第一滤光膜(8)和第一升降轴(71)组成，第一滤光膜(8)固定在第一升降轴(71)上；

第二滤光系统由第二滤光膜(9)和第二升降轴(72)组成，第二滤光膜(9)固定在第二升降轴(72)上；

所述第一升降轴(71)位于第二升降轴(72)的内部，两个轴能各自独立地相对运动；第一减速机电机(13)驱动第一升降轴(71)的升降，第二减速机电机(12)驱动第二升降轴(72)的升降；

测试光源放置台(10)的中心位置设有容纳第二升降轴(72)穿过的通孔；

细胞培养皿(4)放置于测试平台(6)上；

控制和显示单元(14)分别与第一温湿度调节单元(1)、温湿度传感器(2)、第二温湿度调节单元(5)相连，接收并实时显示温湿度传感器(2)采集的温湿度数据，控制第一温湿度调节单元(1)或第二温湿度调节单元(5)进行温湿度调节；

控制和显示单元(14)与第一减速机电机(13)、第二减速机电机(12)相连，通过控制第一减速机电机(13)、第二减速机电机(12)，实现对第一升降轴(71)和第二升降轴(72)相对移动的控制；

控制和显示单元(14)还与测试光源放置台(10)相连，控制测试光源放置台(10)的通电开关。

2.根据权利要求1所述的测量装置，其特征在于：第一滤光膜(8)可衰减光强度，第二滤光膜(9)改变光谱成分。

3.根据权利要求1所述的测量装置，其特征在于：第一温湿度调节单元(1)包括进风机、排风机和加湿机；第二温湿度调节单元(5)包括进风机、排风机和除湿机。

4.根据权利要求1所述的测量装置，其特征在于：细胞培养皿(4)的数量是偶数个，且分成测试组和对照组，对照组区域放置遮光层(41)以完全屏蔽光源的照射；所述遮光层(41)粘贴在测试平台(6)的下表面。

5.根据权利要求1所述的测量装置，其特征在于：第一升降轴(71)和第二升降轴(72)通过固定卡件(11)固定于圆筒结构的正中部；所述测试光源放置台(10)下方设有圆盘结构的固定隔板，固定隔板边缘与圆筒内壁固定连接；固定卡件(11)固定在固定隔板的中央位置。

6.根据权利要求1所述的测量装置，其特征在于：控制和显示单元(14)控制测量箱(7)内的温度稳定在37±1°、湿度小于等于85％。

7.根据权利要求1所述的测量装置，其特征在于：控制和显示单元(14)是固定终端和/或便携式终端。

8.根据权利要求1所述的测量装置，其特征在于：还包括气体分析装置(15)，用于检测二氧化碳、微颗粒物、有害气体的浓度，其安装于测试平台(6)内，与控制和显示单元(14)相连。

9.一种利用权利要求4所述的装置进行视网膜光损伤测量的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、稳定培养人视网膜色素上皮细胞，在多个细胞培养皿(4)中铺下细胞后持续培养至细胞呈现铺满状态；

步骤二、将多个细胞培养皿(4)分组放置于测试平台(6)上，细胞培养皿数量为偶数个，分为测试组和对照组，用于定量分析视网膜细胞的光损伤程度；对照组区域放置遮光层以完全屏蔽光源的照射，通过控制和显示单元(14)打开测试光源(101)并照射；

步骤三、回收所述步骤二中光照的人视网膜色素上皮细胞，测定回收的测试组和对照组培养细胞中的细胞活力CV或与细胞凋亡相关的线粒体膜电位；

步骤四、根据步骤三测定的数字化结果评价特定光源在特定光强条件下对细胞有无产生光化学损伤及其程度；

步骤五、获得测试光照细胞的细胞活力值CV_S。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

步骤一中采用的培养基是不含L-色氨酸、L-酪氨酸、叶酸、核黄素和酚红的DMEM细胞培养基。

11.根据权利要求9或10之一所述的方法，其特征在于：

步骤三中，测定细胞活力具体是采用水溶性四唑盐WST-8用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目。

12.根据权利要求9或10之一所述的方法，其特征在于：

步骤五中，每次设定阴性对照组，即非光照组，同样条件下同时进行活力检测后获得细胞活力值CV_C；细胞光损伤程度CV计算如公式一所示：

式中：

CV_S光照细胞，即阳性组的细胞活力值；

CV_C为非光照细胞，即阴性组的细胞活力值；

n为配对测试有效样本的组数。