CN105669825A - 一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品加工技术领域，公开了一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白及其制备方法。所述制备方法为：将蛋白和可溶性大豆多糖分别溶解于去离子水中，调整pH值为6.8～7.0，分别得到蛋白储液和多糖储液，将两者混合后过夜水化，然后冻干得到混合物；将冻干后的混合物在温度为60℃，湿度为79％的干燥器中反应7～14天，得到反应产物，然后将其溶解于去离子水中，搅拌混合后调整pH值为4.6～5.0，将溶液离心，取上清液干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。本发明的接枝产物能有效提高蛋白在等电点附近的功能性质，尤其乳化性，热稳定性及发泡性等优于二者的混合作用，具有良好的市场前景。

Description

一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白及其制备方法。
背景技术
基于Maillard反应机理的蛋白质和多糖糖基化研究是蛋白质化学改性的一种绿色有效方法，因其具有较高的接枝度和安全性而广泛在食品工业中应用。蛋白质和多糖是共存于食品乳化体系中最重要的两类生物大分子，是影响食品结构和质构的主要因素。蛋白质因能在液液或气液界面上形成吸附层来降低界面张力而多在胶体体系中充当乳化剂，多糖则由于其良好的增稠和持水特性而常用做稳定剂，由此赋予了体系不同于两者单独存在时的功能表现。共价键结合的蛋白质与多糖形成大分子复合物(conjugates)，既保留了蛋白质的表面活性又具有多糖的亲水性能，与蛋白质多糖弱相互作用形成的混合物(complex)对比，对环境条件(温度、pH值、离子强度等)具有较高的适应性。通过自发的Maillard反应生成的糖基化蛋白溶解性、乳化性、凝胶特性、抗氧化性、抗菌性以及热稳定性等性能均有提高。该研究是目前国内外对于功能性添加剂的新的研究领域。
可溶性大豆多糖(Soybeansolublepolysaccharides)是从豆制品加工的副产物豆渣中提取的水溶性多糖。是一种绿色食品添加剂。SSPS是一种酸性多糖，半乳糖醛酸主链上分布着阿拉伯糖中性侧链，结构类似于果胶，具有高溶解性、抗氧化性、较低粘性以及乳化稳定性好等优良特性。SSPS作为食品领域天然的抗氧化剂、防腐剂和增稠剂，对酸性乳饮料的稳定剂中的应用具有重要的学术意义。此外，SSPS还具有调节血糖值和血液脂质、促进肠道有害物质的吸附与排泄、抗癌、促进矿物质吸收利用等生物活性。工业生产中，豆渣不能被进一步利用，被当作废弃物扔掉，造成环境负担和浪费。SPSS的提取提高了豆渣利用率，降低成本，保护环境。
SSPS突出的分散稳定性是目前食品行业中应用的热点。SSPS在酸性条件下具有良好的分散稳定性，能够达到稳定低粘度的乳酸饮料效果，这种现象主要是由于SSPS中性糖侧链的空间位阻作用以及液滴通过多糖分子被联结在一起，形成所谓的桥连絮凝，随着可溶性大豆多糖浓度的增加，多糖可以完全覆盖蛋白质包被的液滴，使液滴表面带上净负电荷，液滴因静电排斥来使蛋白液滴稳定。所以利用SSPS来稳定酸性乳饮料具有很好的发展前景。但是，作为弱相互作用所得到的产品性能始终不能很好地经受储存期的考验，所以一般市面上的酸性乳饮料市场货架期都不长，长时间放置底部会出现少量蛋白沉淀等现象。SSPS能够很好的在酸性条件下稳定蛋白，如果与蛋白能够发生糖基化共价接枝，得到的共价复合物在蛋白等电点区域(pH4.6～5.0)的各种物化性能将得到突破性的提升，在此基础上得到糖基化产物能够更好地改善SSPS的市场应用预期。此外，关于蛋白的糖基化研究也是食品行业的一个研究热点，目前国内外该项研究所涉及的多糖都为中性多糖如葡聚糖，以及其他小分子的多糖，未能达到糖基化蛋白在酸性条件下完全可溶的理想效果。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下制备步骤：
(1)将蛋白和可溶性大豆多糖分别溶解于去离子水中，搅拌1～2h，调整溶液pH值为6.8～7.0，分别得到蛋白储液和多糖储液，将两者搅拌混合均匀后过夜水化，然后冻干得到混合物；
(2)将冻干后的混合物在温度为60℃，湿度为79％的干燥器中反应7～14天，得到反应产物；
(3)将步骤(2)所得反应产物溶解于去离子水中，搅拌0.5～2h，调整溶液pH值为4.6～5.0，然后将溶液离心，将上清液干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。
所述的蛋白包括大豆分离蛋白、豌豆蛋白或乳清蛋白等。
所述调节溶液pH值优选采用0.1NHCl或0.1NNaOH进行调节。
所述蛋白储液和多糖储液中所含蛋白或多糖的质量分数优选为10％。
所述的蛋白储液和多糖储液混合后，所含蛋白和可溶性大豆多糖的质量比优选为1:(1～5)。
步骤(3)中所述反应产物溶解于去离子水中的质量比优选为1:20。
所述的离心优选在10000rpm下离心15～30min。
所述的干燥是指采用冷冻干燥、喷雾干燥或者真空干燥。
一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白，通过以上方法制备得到。
植物蛋白和糖的糖基化接枝改性反应是基于蛋白质分子中氨基酸侧链的自由氨基和糖分子还原末端的羰基之间的羰氨反应，即Maillard反应机理进行的。对于复杂的Maillard反应阶段来说，具有功能特性的接枝产物一般是形成在Maillard反应的初级阶段末期或者中期，高级阶段形成功能差的棕黄色或黑色物质—类黑素，因此在反应过程中选择结合SDS-PAGE图谱，利用考马斯亮兰和品红试剂分别用于染色蛋白谱带和糖蛋白谱带，通过对比产物中有无添加巯基乙醇的情况下进行电泳后图谱的变化来鉴定共价键的大分子复合物的形成；选择利用反应物在可见区420nm处有吸收，显示高级阶段产物生成的程度。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
本发明基于美拉德反应制备的糖基化接枝产物具有较高的接枝度，SSPS具有优越的分散稳定性，特别在酸性条件下能够很好稳定蛋白分子，进一步与蛋白发生共价接枝可以准确地达到修饰蛋白分子在酸性条件下分子稳定的效果，同时得到功能性优越的蛋白多糖大分子产物，有效提高蛋白在等电点附近的功能性质，尤其乳化性，热稳定性及发泡性等优于二者的混合作用，具有良好的市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中SPI和SSPS干热不同反应时间蛋白质的电泳图谱。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将大豆分离蛋白6.25g(实验室自制，蛋白含量为80％)和可溶性大豆多糖5g(福建味博食品有限公司)分别溶解于去离子水中，搅拌1h，采用0.1NHCl和0.1NNaOH调整溶液pH值为6.8，分别得到质量分数为10％的蛋白储液和多糖储液，将两者搅拌2h混合均匀后过夜水化，然后冻干得到混合物；
(2)将冻干后的混合物在温度为60℃，湿度为79％的干燥器中反应7天，得到反应产物；
(3)将步骤(2)所得反应产物溶解于20倍质量的去离子水中，搅拌2h，采用0.1NHCl调整溶液pH值为4.8，然后将溶液在室温下10000rpm下离心15min，上清液经冷冻干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。所得糖基化蛋白在酸性条件(pH4.6～5.0)完全可溶，具有良好的功能特性。大豆分离蛋白与可溶性大豆多糖1：1干热制备的共价复合物乳化活性(EAI)进一步增加，与大豆分离蛋白相比提升了约181.7％。
本实施例的大豆分离蛋白通过如下方法制备：
低温脱脂豆粕粉碎后溶于蒸馏水(1:10,w/v)，用2NNaOH调节溶液pH至8.0，室温缓慢搅拌2h，豆渣过4层纱布后，离心(8000g,20min,25℃)，在上清液中加入2NHCl调节溶液pH至4.5，4℃静置0.5h后离心(8000g,20min,25℃)，沉淀用清水清洗表面多次以去除残留的清蛋白。取出沉淀，记录湿重，分散于湿重7倍的纯水中，缓慢搅拌(切记用转子剧烈搅拌)，然后调节pH至7.5，纯水透析48h，期间换3次水，冻干备用。
本实施例中大豆分离蛋白(SPI)和可溶性大豆多糖(SSPS)干热接枝及证明的相关试验：
SDS-PAGE分析方法：
依据Laemmli的方法进行SDS-PAGE。将步骤(3)所得样品置入样品缓冲液中[0.125mol/LTris-HCl缓冲液，含1％SDS(w/v)，5％甘油(v/v)，2％2-巯基乙醇(2-ME,v/v)和0.025％溴酚蓝(w/v)]，电泳前煮沸5min，10000g离心10min，取上清液上样，上清液中样品含量为10.0mg/mL，上样量为10μL。分离胶浓度为13％，浓缩胶浓度为5％。样品在浓缩胶中的电流设定为20mA，样品进入浓缩胶与分离胶界面后，将电流调节为40mA，当电泳跑至距离电泳槽橡胶底边约1.5cm时，关闭电源。分别用考马斯亮蓝R-250试剂对凝胶胶片进行蛋白质染色。SPI和SSPS干热不同反应时间(即调节本实施例步骤(2)干燥器中反应为7～14天)蛋白质的电泳图谱如图1所示。从图1所示的实验结果看出，在反应时间7～14天过程中，浓缩胶顶部以及浓缩胶与分离胶之间均出现了谱带，且随着反应时间的增加，浓缩胶顶部谱带更加明显。电泳图谱说明在本发明方法条件下，SPI和SSPS发生一定程度的共价接枝，分子量较大，聚合程度明显。
实施例2
(1)将乳清蛋白16.67g(实验室自制，蛋白含量为90％)和可溶性大豆多糖15g(福建味博食品有限公司)分别溶解于去离子水中，搅拌2h，采用0.1NHCl和0.1NNaOH调整溶液pH值为7.0，分别得到质量分数为10％的蛋白储液和多糖储液，将两者搅拌2h混合均匀后过夜水化，然后冻干得到混合物；
(2)将冻干后的混合物在温度为60℃，湿度为79％的干燥器中反应7天，得到反应产物；
(3)将步骤(2)所得反应产物溶解于20倍质量的去离子水中，搅拌2h，采用0.1NHCl调整溶液pH值为4.6，然后将溶液在室温下10000rpm下离心15min，上清液经喷雾干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。所得糖基化蛋白在酸性条件(pH4.6～5.0)完全可溶，具有良好的功能特性。干热法制备的大豆分离蛋白-可溶性大豆多糖共价复合物的乳化活性指数(EAI)表明蛋白质多糖接枝产物乳化活性与乳清蛋白相比提高了225％。
实施例3
(1)将大豆分离蛋白6.25g(实验室自制，蛋白含量为80％)和可溶性大豆多糖15g(福建味博食品有限公司)分别溶解于去离子水中，搅拌2h，采用0.1NHCl和0.1NNaOH调整溶液pH值为7.0，分别得到质量分数为10％的蛋白储液和多糖储液，将两者搅拌2h混合均匀后过夜水化，然后冻干得到混合物；
(2)将冻干后的混合物在温度为60℃，湿度为79％的干燥器中反应10天，得到反应产物；
(4)将步骤(2)所得反应产物溶解于20倍质量的去离子水中，搅拌2h，采用0.1NHCl调整溶液pH值为5.0，然后将溶液在室温下10000rpm下离心15min，上清液经真空干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。所得糖基化蛋白在酸性条件(pH4.6～5.0)完全可溶，具有良好的功能特性。大豆分离蛋白与可溶性大豆多糖1：3制备的共价复合物乳化活性(EAI)进一步增加，与大豆分离蛋白相比提升了约191.8％。由于多羟基的多糖以共价键键入到大豆分离蛋白中后，使得产物溶解度增加，有效阻止了油滴的聚集，从而提升了乳化活性。
实施例4
(1)将大豆分离蛋白6.25g(实验室自制，蛋白含量为80％)和可溶性大豆多糖25g(福建味博食品有限公司)分别溶解于去离子水中，搅拌1h，采用0.1NHCl和0.1NNaOH调整溶液pH值为6.8，分别得到质量分数为10％的蛋白储液和多糖储液，将两者搅拌2h混合均匀后过夜水化，然后冻干得到混合物；
(2)将冻干后的混合物在温度为60℃，湿度为79％的干燥器中反应10天，得到反应产物；
(5)(3)将步骤(2)所得反应产物溶解于20倍质量的去离子水中，搅拌0.5h，采用0.1NHCl调整溶液pH值为4.8，然后将溶液在室温下10000rpm下离心25min，上清液经冷冻干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。所得糖基化蛋白在酸性条件(pH4.6～5.0)完全可溶，具有良好的功能特性。大豆分离蛋白与可溶性大豆多糖1：5制备的共价复合物乳化活性(EAI)进一步增加，与大豆分离蛋白相比提升了约194.1％。
实施例5
(1)将大豆分离蛋白6.25g(实验室自制，蛋白含量为80％)和可溶性大豆多糖5g(福建味博食品有限公司)分别溶解于去离子水中，搅拌1.5h，采用0.1NHCl和0.1NNaOH调整溶液pH值为6.9，分别得到质量分数为10％的蛋白储液和多糖储液，将两者搅拌2h混合均匀后过夜水化，然后冻干得到混合物；
(2)将冻干后的混合物在温度为60℃，湿度为79％的干燥器中反应14天，得到反应产物；
(6)将步骤(2)所得反应产物溶解于20倍质量的去离子水中，搅拌2h，采用0.1NHCl调整溶液pH值为4.8，然后将溶液在室温下10000rpm下离心30min，上清液经喷雾干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。所得糖基化蛋白在酸性条件(pH4.6～5.0)完全可溶，具有良好的功能特性。大豆分离蛋白与可溶性大豆多糖1：1在本实施例条件下制备的共价复合物乳化活性(EAI)进一步增加，与大豆分离蛋白相比提升了约200.7％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下制备步骤：
(1)将蛋白和可溶性大豆多糖分别溶解于去离子水中，搅拌1～2h，调整溶液pH值为6.8～7.0，分别得到蛋白储液和多糖储液，将两者搅拌混合均匀后过夜水化，然后冻干得到混合物；
(2)将冻干后的混合物在温度为60℃，湿度为79％的干燥器中反应7～14天，得到反应产物；
(3)将步骤(2)所得反应产物溶解于去离子水中，搅拌0.5～2h，调整溶液pH值为4.6～5.0，然后将溶液离心，将上清液干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，其特征在于：所述的蛋白包括大豆分离蛋白、豌豆蛋白或乳清蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，其特征在于：所述调节溶液pH值采用0.1NHCl或0.1NNaOH进行调节。
4.根据权利要求1所述的一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，其特征在于：所述蛋白储液和多糖储液中所含蛋白或多糖的质量分数为10％。
5.根据权利要求1所述的一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，其特征在于：所述的蛋白储液和多糖储液混合后，所含蛋白和可溶性大豆多糖的质量比为1:(1～5)。
6.根据权利要求1所述的一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述反应产物溶解于去离子水中的质量比为1:20。
7.根据权利要求1所述的一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，其特征在于：所述的离心是指在10000rpm下离心15～30min。
8.根据权利要求1所述的一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制备方法，其特征在于：所述的干燥是指采用冷冻干燥、喷雾干燥或者真空干燥。
9.一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。
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