CN105658811A - 利用核苷酸类似物和解旋酶恒温扩增dna分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涵盖了一种恒温扩增特定序列的DNA分子的方法和流程。本发明是基于意外的发现，即本发明中的引物，在某些位置的核苷酸被非天然的核苷酸替代(“SAMRS核苷酸”)，例如：以2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤替代腺嘌呤，以肌苷替代鸟嘌呤，以2-硫代胸腺嘧啶替代胸腺嘧啶，以N4-乙烷基胞嘧啶替代胞嘧啶，这些含有SAMRS核苷酸的引物能够被常规的解旋酶恒温扩增法(HDA)中的酶所接受和使用。进一步意想不到的结果是，目标核苷酸(DNA/RNA)能够在解旋酶恒温扩增法(HDA)中被含有SAMRS核苷酸的引物有效地扩增放大。同时，我们还发现，通过使用SAMRS-取代的引物能够减少恒温扩增法中的非特异扩增和引物自聚的副产物。

Description

利用核苷酸类似物和解旋酶恒温扩增DNA分子的方法
背景技术
(1)本发明所涉及的技术领域：
本发明的技术领域是核酸化学，具体地说是涉及扩增预选选定的DNA分子数量(“扩增”目标DNA序列)的领域，更具体地说，本专利的技术领域覆盖恒温扩增流程和方法，这里的恒温扩增流程不需要传统聚合酶链式反应中使用的温度循环。
(2)背景技术描述
在许多实际的应用方面，包括针对生物样品中DNA和RNA分子的诊断，“放大”特定的核酸序列是最直接的一种方法。传统上，这项诊断工作是通过聚合酶链式反应(PCR)来完成[R.K.Saiki,D.H.Gelfand,S.Stoffel,S.J.Scharf,R.Higuchi,G.T.Horn,K.B.Mullis,H.A.Erlich(1988)耐热性DNA聚合酶利用引物来扩增DNA分子。《科学》239,487-491]。在聚合酶链式反应里，一个“正向引物”经过退火而结合到预先选择的目标寡核苷酸序列以形成双链体。然后，DNA聚合酶将利用该引物和合适的2'-脱氧核苷三磷酸合成与目标寡核苷酸序列互补的寡核苷酸产物(采用沃森-克里克互补规则)；目标寡核苷酸和合成的寡核苷酸产物他们的序列互补，并且形成标准的DNA双螺旋结构。然后，双螺旋结构经过加热，通常在温度超过75℃时“熔化”得到两个序列互补的单链DNA分子。在超过75℃以上的温度，每一条单链DNA与其互补的DNA都是自由的。最初的目标分子，然后结合到第二个正向引物，同时产物DNA分子结合到一个“反向引物”，这个反向引物被设计成能够结合到产物DNA分子下游的一个特定的位点。然后，聚合酶继续利用引物进行复制和延伸，從而得到全长的双链DNA产物(现在产物的数量翻倍)。接下來，通过加热两条DNA链再次分离，从而更多的正向和反向引物经过退火与目标DNA分子结合。重复聚合酶链式反应，结果就可以产生大量目标DNA分子以及其互补序列的拷贝。在不对称聚合酶链式反应(PCR)中，目标DNA分子和它的互补序列的拷贝数目取决与正向和反向引物的比例。
经典的PCR被广泛应用于研究、科学和技术等领域，并且被作为首选的方法来检测复杂生物样品中少量的DNA。然而，利用不同的温度循环以分离DNA双链体，在许多应用中有它的局限性，例如，常规的PCR技术和仪器很难被用在医生办公室和随时随地的目标DNA分子的即时检测。因此，大家希望不需要温度循环的扩增目标DNA分子的技术，这种恒温扩增的需求在很多的文献中被提及，其中也包括被称为“重组酶聚合酶扩增”的文献(RPA)[Piepenburg,O.,Williams,C.H.,Stemple,D.L.,Armes,N.A.(2006)利用重组酶和聚合酶扩增DNA。PLoSBiol4(7):e204],滚环法扩增(RCA)，NASBA，解旋酶协助的恒温扩增(HDA)[Tong,Y.,Lemieux,B.,；Kong,H.(2011)多种策略以改善灵敏度，速度和可靠的恒温核酸扩增法快速病原体检测。BMCBiotechnol.11Art.No:50][Lemieux,B.,Li,Y.；Kong,H.M.,Tang,Y.W.(2012)几乎不需要仪器的，简单和快速的检测单纯疱疹病毒的分子器件和方法：ExpertReviewMolec.Diagnostics12,437-443DOI:10.1586/ERM.12.34]和LAMP，等等。这些均被称为“恒温扩增”的方法。
然而现在的恒温扩增方法常常表现欠佳。在许多情况下，扩增的效果似乎取决于特定的目标分子的序列，或在扩增过程中使用的探针和所使用的引物的序列。在某些情况下，恒温扩增会完全的失败。在许多情况下，除了目标分子的扩增产物以外，还会出现额外的“伪”产品。当试图在一个试管中同时等温扩增多个寡核酸样品时(“多重恒温扩增”)，这些伪产物更加容易产生。
截止目前，基本上没有理论可以解释这些和其他易变的结果，虽然有一些公开的、私下的或非正式的猜测和解释，但是这些猜测和解释中有一些矛盾。其中一种解释伪产物的产生是因为在低度下，一些DNA分子(包括引物，探针，或被分析物)通过非沃森-克里克(Watson-Crick)相互作用可能会形成其他的折叠方式，从而导致扩增过程的失败。其它的解释认为，要避免分子内或分子间的相互作用而产生非特异性扩增，高温退火是核苷酸扩增法中必须有的步骤。另外，引物与引物之间的相互作用经常被用来解释多种等温扩增系统失败的原因，尤其是在多重恒温扩增法中。到目前为止，以上的这些解释没有一个被完全确立。因此，在本领域中还没有明确的实验方法来试图克服这些问题，也没有可靠的程序来指导和执行用于所有目标序列的等温扩增法，尤其是，针对多重恒温扩增法扩增多个(多于一个)目标分子序列。
解旋酶协助的恒温扩增法(HDA)尤其容易受到引物二聚等副产物扩增的影响。HDA使用称为解旋酶的蛋白酶来代替高温达到分离DNA双链结构。在理论上，解旋酶可以将双链DNA分开，从而允许引物结合到最初的双链DNA分子上，因此从最初的一个双链DNA分子产生两个双链DNA分子。虽然HDA技术已经成功的用于许多寡核苷酸的扩增，但遗憾的是，这个技术并不适用于扩增所有的目标寡核苷酸。同样地，当HDA扩增单个DNA分子时，副产物常常会引起等温扩增失败。多重恒温扩增技术，副产物产生的可能性更大，特别是多个引物之间的相互作用而产生引物二聚体和多聚体，因此多重恒温扩增法失败的几率特别大。不论在何种情况下，这些副产物的产生限制了这些技术的灵敏度和多重性。此外，标准的HDA技术无法使用引物浓度超过0.2微摩尔，这样就限制了检测的速度。
发明的内容
本发明是基于意外的发现，即本发明中的引物，在某些位置的核苷酸被非天然的核苷酸替代(“取代的引物”)，也就是引物中至少一些位置的A，T，G和C核苷碱基被本专利中设计的核苷类似物A*，T*，G*和C*取代(“SAMRS核苷酸”)，这些被SAMRS取代的引物能够被解旋酶和聚合酶接受，实现象HDA一样的恒温扩增。目前最优选的取代策略是以2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤(这两个核苷类似物均被定义为A*)替代腺嘌呤，以肌苷(定义为G*)替代鸟嘌呤，以2-硫代胸腺嘧啶(定义为T*)替代胸腺嘧啶，以N4-乙烷基胞嘧啶(定义为C*)替代胞嘧啶。进一步意想不到的结果是，目标核苷酸(DNA/RNA)能够在解旋酶恒温扩增法(HDA)中被含有核苷类似物(SAMRS)取代的引物有效地扩增放大。此外，本发明也是基于下述发现，即被SAMRS取代的引物进一步被人工扩展地遗传信息系统(AEGIS)中的核苷酸标记，SAMRS取代和AEGIS标记的引物也能够很好的被用于解旋酶恒温扩增法(HDA)中。
附图的简要说明
图1.被取代的引物里替代核苷酸G，C，A和T的首选的核苷碱基类似物，其中R是连接到寡核苷酸的位点。
图2.从人工扩展的遗传信息系统里首选的核苷碱基类似物，其中R是连接到寡核苷酸的位点，W是吸电子基团，如硝基或氰基。
图3.(电泳泳道1和2)：纯天然的引物(Std)只生成假产物，或许是引物二聚体，目标KIT基因不存在(泳道1，-)，目标KIT基因(泳道2，+)存在；(电泳泳道3和4)：本发明中的SAMRS引物在目标KIT基因存在时生成产物(泳道4，+)，在KIT基因不存在时无产物(泳道3，-)；(电泳泳道5和6)：纯天然的引物(Std)在目标HIV不存在时没有产物(泳道5，-)在目标HIV存在时生成产物(泳道6，+)；(电泳泳道7和8)：SAMRS引物在目标HIV存在时生成产物(泳道8，+)，SAMRS引物在目标HIV不存在时没有产物(泳道7，-)。
图4.数据来自于例1(电泳泳道1和2)：聚合酶Bst2.0和IsoAmpIII(每种各2微升)使用纯天然的引物扩增人类基因组中的KIT基因，人类基因分别为0纳克或20纳克。(泳道3)：聚合酶Bst2.0和IsoAmpIII(每种各2微升)使用含有八个SAMRS核苷酸取代的引物扩增人类基因组中的KIT基因(20纳克人类基因)。(泳道4)：聚合酶Bst2.0和IsoAmpIII(每种各2微升)使用含有四个SAMRS核苷酸取代的引物扩增人类基因组中的KIT基因(20纳克人类基因)。(泳道5和6)：聚合酶GspM和IsoAmpIII(每种各2微升)使用纯天然的引物扩增人类基因组中的KIT基因，人类基因分别为0纳克或20纳克。(泳道7)：聚合酶GspM和IsoAmpIII(每种各2微升)使用含有八个SAMRS核苷酸取代的引物扩增人类基因组中的KIT基因(20纳克人类基因)。(泳道8)：聚合酶GspM和IsoAmpIII(每种各2微升)使用含有四个SAMRS核苷酸取代的引物扩增人类基因组中的KIT基因(20纳克人类基因)。(泳道9和10)：聚合酶GspM2.0和IsoAmpIII(每种各2微升)使用纯天然的引物扩增人类基因组中的KIT基因，人类基因分别为0纳克或20纳克。。(泳道11)：聚合酶GspM2.0和IsoAmpIII(每种各2微升)使用含有八个SAMRS核苷酸取代的引物扩增人类基因组中的KIT基因(20纳克人类基因)。(泳道12)：聚合酶GspM2.0和IsoAmpIII(每种各2微升)使用含有四个SAMRS核苷酸取代的引物扩增人类基因组中的KIT基因(20纳克人类基因)。((泳道13和14)：聚合酶GspSSD和IsoAmpIII(每种各2微升)使用纯天然的引物扩增人类基因组中的KIT基因，人类基因分别为0纳克或20纳克。。(泳道15)：聚合酶GspSSD和IsoAmpIII(每种各2微升)使用含有八个SAMRS核苷酸取代的引物扩增人类基因组中的KIT基因(20纳克人类基因)。(泳道16)：聚合酶GspSSD和IsoAmpIII(每种各2微升)使用含有四个SAMRS核苷酸取代的引物扩增人类基因组中的KIT基因(20纳克人类基因)。
图5.数据来自于例2(泳道1,2和3)：聚合酶Bst2.0和IsoAmpIII(每种各2微升)，以20纳克的人类基因为目标，硫酸镁的浓度分别是4，5或6毫摩尔。(泳道4,5和6)：聚合酶Bst2.0和IsoAmpIII(每种各2微升)，以20纳克的人类基因为目标，硫酸镁的浓度分别是4，5或6毫摩尔同时加上1M的甜菜碱(betaine)。(泳道7,8和9)：聚合酶GspSSD和IsoAmpIII(每种各2微升)，以20纳克的人类基因为目标，硫酸镁的浓度分别是4，5或6毫摩尔。(泳道10,11和12)：聚合酶GspSSD和IsoAmpIII(每种各2微升)，以20纳克的人类基因为目标，硫酸镁的浓度分别是4，5或6毫摩尔同时加上1M的甜菜碱(betaine)。
图6.数据来自于例3.M为DNA标记梯子，左侧的M标记每个相隔50个核苷酸，右侧的M标记每个相隔25个核苷酸。(泳道1，2，3，4)：不含SAMRS核苷酸类似物的KIT-纯天然的引物。(泳道5，6，7，8，9，10，和11)：含有SAMRS核苷酸类似物的KIT-SAMRS引物，SAMRS核苷酸在指定的位置上。目标分子是人类基因组DNA(每个反应为20纳克)，反应中有目标分子(+)或没有目标分子(-)，后者是一个阴性对照。每个反应的最终硫酸镁浓度分别为6毫摩尔，7毫摩尔，8毫摩尔，9毫摩尔，和10毫摩尔，标记在各个泳道的下面。
图7.数据来自于例4.M为DNA标记梯子，左侧的M标记每个相隔50个核苷酸，右侧的M标记每个相隔25个核苷酸。(泳道1，2，3，4)：使用纯天然的引物扩增艾滋病毒的基因片段(HIV)。(泳道5，6，7，8，9，10，和11)：含有SAMRS核苷酸类似物的HIV-SAMRS引物。目标分子是合成的HIV-DNA-96mer(每个反应0.2fmole)，反应中含有HIV目标分子(+)或没有HIV目标分子(-)；每个反应的最终硫酸镁浓度分别为6毫摩尔，7毫摩尔，8毫摩尔，9毫摩尔，和10毫摩尔，标记在各个泳道的下面。
图8.解旋酶协助的恒温扩增(HDA)反应机制的示意图。第1步是解旋酶分开双链DNA和引物与DNA的结合。第2步是DNA聚合酶的复制和延伸。步骤3是DNA扩增。圆圈代表解旋酶。椭圆形代表DNA聚合酶。
图9.PAGE电泳显示，解旋酶协助的恒温扩增(HDA)反应能够使用AEGIS标记的AEGIS-SAMRS引物扩增人类基因组中的TOP基因和MYC基因，该恒温扩增法可以实现单独和同时扩增两种基因。
专利的具体描述与最佳的实行方式
本发明的主要创新点是正向和反响引物中一些位置的A，T，G和C核苷碱基被核苷类似物取代，这些核苷类似物分别命名为A*，T*，G*和C*(“SAMRS”核苷酸类似物)。按照标准的技术，在经典PCR和等温PCR中，引物设计的第一步骤是在要被扩增的寡核苷酸中选择一部分或一个片段的DNA序列来进行扩增。正向引物的序列与被扩增DNA序列3'-端某一部分或区段的序列互补，然后聚合酶以目标DNA为模板延伸正向引物，从而复制目标DNA。同样地，反向引物的序列与正向引物延伸的产品“下游”某一部分或区段的序列互补。在本领域中，正向引物和反向引物被设计为能够得到合适大小的扩增产物为宜。
在以下的文献中和这些文献所引用的文献中，能够找到描述的设计经典的HDA引物序列的方法，[Tong,Y.,Lemieux,B.,；Kong,H.(2011)多种策略以改善灵敏度，速度和可靠的恒温核酸扩增法快速病原体检测。BMCBiotechnol.11Art.No:50][Lemieux,B.,Li,Y.；Kong,H.M.,Tang,Y.W.(2012)几乎不需要仪器的，简单和快速的检测单纯疱疹病毒的分子器件和方法：ExpertReviewMolec.Diagnostics12,437-443DOI:10.1586/ERM.12.34].
在要被扩增的底物和相应的引物被确定以后，引物中一些标准的核苷酸必须被相应的SAMRS核苷酸类似物取代。本专利中的例子告诉我们，并非所有的核苷酸必须被SAMRS核苷酸类似物取代。更具体的说，本专利中的实验数据显示，引物中至少要有两个核苷酸类似物，最好不超过六个核苷酸类似物。最优化的取代数目是四。
目前倾向于在引物的3'-末端进行取代，最优化地取代位点为n-1，n-2，n-3...，其中n是引物3'-末端最后一个碱基。如果SAMRS核苷酸的数目为四，则最优化的取代位置是n-1，n-2，n-3和n-4，其中n是寡核苷酸引物3'-末端最后一个碱基。对于含有六个核苷酸类似物的引物，从引物3'-末端第二位到第七位的核苷酸均被取代(6)对于含有两个核苷酸类似物的引物，从引物3'-末端第二位到第三位的核苷酸会被取代(2)，对于含有四个核苷酸类似物的引物，从引物3'-末端第二位到第五位的核苷酸均被取代(4)。
目前最优选的SAMRS核苷酸取代策略是以2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤(这两个核苷类似物均被定义为A*)替代引物中的腺嘌呤，以肌苷(定义为G*)替代引物中的鸟嘌呤，以2-硫代胸腺嘧啶(定义为T*)替代胸腺嘧啶，以N4-乙烷基胞嘧啶(定义为C*)替代胞嘧啶。另外，这些核苷类似物的亚磷酰胺试剂已经商品化，固相合成含有这些寡核苷酸类似物的技术已经非常成熟。
在引物被设计后，含有SAMRS核苷酸类似物的引物，将在固相自动化合成仪使用相应的受保护的亚磷酰胺来合成。合成这种SAMRS引物的方法，在以下的文献和这些文献所引用的文献中有描述。
[Hoshika,S.,Leal,N.,Chen,F.,Benner,S.A.(2010)人工基因遗传系统。自回避DNA在PCR和多重PCR中的应用。Angew.Chem.Int.Edit.49,5554-5557]
[Yang,Z.,Chen,F.,Alvarado,J.B.,Benner,S.A.(2011)扩增，基因突变和含有六个字母的合成基因系统的测序。J.Am.Chem.Soc.133,15105-15112]。在SAMRS引物被合成好以后，本专利后续的过程在许多方面与常规的等温扩增过程HDA基本相似[Tong,Y.,Lemieux,B.,；Kong,H.(2011)多种策略以改善灵敏度，速度和可靠的恒温核酸扩增法快速病原体检测。BMCBiotechnol.11Art.No:50][Lemieux,B.,Li,Y.；Kong,H.M.,Tang,Y.W.(2012)几乎不需要仪器的，简单和快速的检测单纯疱疹病毒的分子器件和方法：ExpertReviewMolec.Diagnostics12,437-443DOI:10.1586/ERM.12.34].基于以上的原因，本专利中的方法被称为“HDA-类似”。领人惊奇的是，本发明中被SAMRS核苷酸类似物取代的引物竟然可以被标准的HDA(贝弗利，MA售出IsoAmpTM试剂盒)中的解旋酶和聚合酶使用来扩增寡核苷酸。另外，如本专利中的实验所揭示，我们发现某些聚合酶更适合本发明。更进一步，本发明也包括与单链寡核苷酸结合的蛋白。
2.示例
示例1:
例1描述了人类基因组DNA中的目标基因(KIT基因)的扩增(20纳克，约6000个拷贝)。这个例子证实了解旋酶和多种聚合酶能够使用SAMRS引物，高效率和低噪音地扩增目标寡核苷酸。同时实验数据证实了在HDA恒温扩增的过程中，引物中被SAMRS核苷酸类似物(G*，C*，T*，和A*)取代的核苷酸数目最好是4个而不是8个。这个例子也证明了在HDA恒温扩增中，被SAMRS取代的引物可以被不同的DNA聚合酶使用(Bst2.0,GspM,Gspm2.0,andGspSSD),这些实验进一步表明:
1)对于所有被测试的聚合酶，天然的核苷酸引物产生少量的产物和大量的副产物(副产物可能源自于“引物二聚体”)。
2)当使用GspSSDDNA聚合酶时，包含四个SAMRS组分的引物产生了预期的扩增，但是没有副产物。不管使用哪种聚合酶，含有八个SAMRS组分的引物没有产生任何“引物二聚体”或预期的扩增产物。
3)当使用GspM和GspM2.0DNA聚合酶时，包含四个SAMRS组分的引物既没有产生预期的扩增产物也没有产生副产物。因此，GspSSD是目前首选的DNA聚合酶。在这项研究中使用的含SAMRS组分的引物如下所示。粗体下划线的部分表示天然的核苷酸被SAMRS核苷酸类似物取代，A*为2-氨基嘌呤；T*为2-硫代胸腺嘧啶；G*为肌苷；C*为N4-乙烷基胞嘧啶。
KIT-90-F-25mer-std:5’-AGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAG-3’序列编号1
KIT-90-R-25mer-std:5’-TGTCAAGCAGAGAATGGGTACTCAC-3’序列编号2
KIT-90-F-25mer:5’-AGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAG-3’序列编号3
KIT-90-R-25mer:5’-TGTCAAGCAGAGAATGGGTACTCAC-3’序列编号4
KIT-98-F-29mer:5’-acaaAGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAG-3’序列编号5
KIT-98-R-29mer:5’-ggacTGTCAAGCAGAGAATGGGTACTCAC-3’序列编号6
这些引物在室温下与20纳克的人类基因组中的目标DNA混合，恒温扩增反应中包括缓冲水溶液、解旋酶、IsoAmp中的其它组份(来自BioHelix公司)、2'-脱氧核苷三磷酸、和表格1中所列出的各种DNA聚合酶和其它组分。以上的混合物在恒温65℃下反应90分钟，条件如下所示：
表1
各各反应在65℃下90分钟完成后，将10微升的样品与4微升的琼脂糖凝胶上样染料混合。恒温反应的扩增产物在2.5％的琼脂糖凝胶电泳上被分离和解析。其结果示于图4。
例2.证实SAMRS引物在HDA中恒温扩增KIT基因的功能，分别测试了GspSSD和 Bst2.0DNA聚合酶基因
证实含有SAMRS组份(G*，C*，T*，和A*)的KIT引物在解旋酶协助的恒温扩增法(HDA)中的效率，使用的聚合酶分别是Bst2.0和GspSSD，被测试的MgSO4的浓度分别是4毫摩尔，5毫摩尔和6毫摩尔。这些实验表明：
1)当硫酸镁的浓度从4毫摩尔增加到6毫摩尔时，预期的扩增产物对于Bst2.0和GspSSD聚合酶均显著地增加。
2)加入甜菜碱(1毫摩尔)有利于富含GC的目标寡核苷酸的扩增。
在本实验中使用的引物如下所示。粗体下划线的部分表示天然的核苷酸被SAMRS核苷酸类似物取代，A*为2-氨基嘌呤；T*为2-硫代胸腺嘧啶；G*为肌苷；C*为N4-乙烷基胞嘧啶。
KIT-98-F-29mer:5’-acaaAGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAG-3’序列编号7
KIT-98-R-29mer:5’-ggacTGTCAAGCAGAGAATGGGTACTCAC-3’序列编号8
恒温扩增反应中包括IsoAmp缓冲水溶液、聚合酶、解旋酶、2'-脱氧核苷三磷酸和表格2中的其它组份。以上的混合物在恒温65℃下反应90分钟。反应结束后，将10微升的样品与4微升的琼脂糖凝胶上样染料混合。恒温反应的扩增产物在2.5％的琼脂糖凝胶电泳上被分离和解析。其结果示于图5。
表2.
例3.证实在HDA恒温扩增反应中GspSSDDNA聚合酶能够利用SAMRS引物高效地扩 增KIT基因
在这个例子中，比较了含有SAMRS核苷酸类似物(G*，C*，T*，和A*)的引物与天然核苷酸(无SAMRS核苷酸)的引物扩增目标寡核苷酸的效率和特异性。目标寡核苷酸分别是人类基因组中的KIT基因(双链DNA分子)和HIV基因的合成模拟片段(HIV-DNA-96mer)，测试GspSSDDNA聚合酶在不同浓度的硫酸镁(6毫摩尔，7毫摩尔，8毫摩尔，9毫摩尔，和10毫摩尔)的条件下，两种引物的效率和特异性。
总之，这些实验表明：
1.在HDA恒温扩增反应中，当硫酸镁的浓度从6毫摩尔增加到10毫摩尔时，被SAMRS组份取代的引物的扩增效率显著降低。因此，硫酸镁的浓度在6毫摩尔是目前优选的(结合例2中的实验结果)。
2.在反应中含有目标寡核苷酸时(人类基因组DNA或HIV基因的合成模拟片段)，SAMRS引物能够有效地扩增目标分子而且没有任何“引物二聚体”之类的副产物；在阴性对照实验中目标寡核苷酸不存在时，SAMRS引物没有产生任何扩增物。相反地，天然的核苷酸引物，无论目标寡核苷酸存在与否，都产生“引物二聚体”等副产物。
用于扩增人类基因组中KIT基因的引物如下。粗体下划线的部分表示天然的核苷酸被SAMRS核苷酸类似物取代，A*为2-氨基嘌呤；T*为2-硫代胸腺嘧啶；G*为肌苷；C*为N4-乙烷基胞嘧啶。所有其它的组份(表3，被取代的或天然的引物，2'-脱氧核苷三磷酸，聚合酶和解旋酶以及IsoAmp试剂盒包含的其它一组份)分别在室温下混合。以上的混合物在恒温65℃下反应90分钟。
KIT-90-F-25mer-天然:5’-AGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAG-3’序列编号9
KIT-90-R-25mer-天然:5’-TGTCAAGCAGAGAATGGGTACTCAC-3’序列编号10
KIT-98-F-29mer-SAMRS:5’-acaaAGATTTGTGATTTTGGTCTAGCCAG-3’序列编号11
KIT-98-R-29mer-SAMRS:5’-ggacTGTCAAGCAGAGAATGGGTACTCAC-3’序列编号12
表3.
反应在65℃下90分钟完成后，，将10微升的样品与4微升的琼脂糖凝胶上样染料混合。恒温反应的扩增产物在2.5％的琼脂糖凝胶电泳上被分离和解析。其结果示于图6。
例4.证实在HDA恒温扩增反应中GspSSDDNA聚合酶能够利用SAMRS引物高效地扩 增HIV基因
用于扩增HIV基因的寡核苷酸序列如下所示。粗体下划线的部分表示天然的核苷酸被SAMRS核苷酸类似物取代，A*为2-氨基嘌呤；T*为2-硫代胸腺嘧啶；G*为肌苷；C*为N4-乙烷基胞嘧啶。所有其它的组份(表3，被取代的或天然的引物，2'-脱氧核苷三磷酸，聚合酶和解旋酶以及IsoAmp试剂盒包含的其它一组份)分别在室温下混合。以上的混合物在恒温65℃下反应90分钟。
GagF_Std_30mer:5’-aaacACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACA-3’序列编号13
GagR_Std_31mer:5’-atctATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’序列编号14
GagF_SAMRS_30mer:5`-aaacACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACA-3’序列编号15
GagR_SAMRS_31mer:5`-atctATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’序列编号16
表4.
反应在65℃下90分钟完成后，，将10微升的样品与4微升的琼脂糖凝胶上样染料混合。恒温反应的扩增产物在2.5％的琼脂糖凝胶电泳上被分离和解析。其结果示于图7。
例如5.含有非天然核苷酸标记的嵌入式恒温扩增法。
将人工扩展遗传信息系统(AEGIS)中的核苷酸加到一个寡核酸序列中得到标签序列，将这个标签序列附加到一个或多个SAMRS引物的5`-端就可以产生一个或多个含有AEGIS和SAMRS的引物。使用这样的AEGIS-SAMRS引物可以提高多元HDA扩增法的均一性。在本专利中，所使用的AEGIS核苷酸是：6-氨基-5-硝基-3-(1'-β-D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-吡啶酮(命名为Z)和2-氨基-8-(1'--β-D-2'-deoxyribofuranosyl)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8H)-酮(命名为P)。在HDA恒温扩增法中，含有AEGIS-SAMRS引物的浓度较低(0.01微摩尔)，它们被用于启动等温扩增专一的目标底物。AEGIS-引物作为通用的引物，它们的浓度较高(Universal-4P,0.1-0.2微摩尔)，被用于等温扩增后期进一步的扩增所有的目标底物。
HDA恒温扩增法中使用的AEGIS和SAMRS引物:
Universal-4P:5`-GGAPCAAPTACPCGCPAC-3`
TOP-F-4P:5`-GGAPCAAPTACPCGCPACGACAGCCCCGGATGAGAAC-3`
TOP-R-4P:5`-GGAPCAAPTACPCGCPACAAGAATTGCAACAGCTCGATTG-3`
MYC-F-4P:5`-GGAPCAAPTACPCGCPACTCCTCCTTATGCCTCTATCAT-3`
MYC-R-4P:5`-GGAPCAAPTACPCGCPACCCGCGCTTTGATCAAGAGTCC-3`
表5.
注释：没有底物的阴性对照反应和其他有底物的反应有相同的条件。
以上反应的所有成分均在室温下混合，25微升的反应混合物在65℃恒温反应120分钟。HDA恒温扩增法使用含有AEGIS标签序列的通用引物和AEGIS-SAMRS引物扩增大人类基因组DNA中的TOP和MYC基因。反应后的扩增产物在3％的琼脂糖凝胶电泳上被分离和解析。其结果示于图9。
工业实用性
本专利所发明的方法可用于许多工业领域，其中包括诊断检测传染病原中的目标DNA和RNA分子。

Claims (8)

1.一种用于合成DNA分子的流程，该DNA分子互补于目标DNA分子，其中所述的目标DNA分子杂交与互补的DNA分子成为双螺旋，本专利所述的方法包括将双螺旋DNA孵育在缓冲水溶液中，缓冲液中有解旋酶，脱氧核糖核酸聚合酶，2'-脱氧核苷三磷酸，和含有非天然核苷酸的引物，该引物的序列与目标DNA分子的一个序列片段基本上互补，并且在该引物中至少一种腺嘌呤被2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤替代，或者引物中至少一个鸟嘌呤被肌苷取代，或至少有一个胸腺嘧啶被2-硫代胸腺嘧啶取代，或者至少一个胞嘧啶被N4-乙烷基胞嘧啶所取代，并且其中所述被替换的核苷酸的数目总数是2至6。
2.一种用于合成多个DNA分子的流程，这些DNA分子互补于目标DNA分子，其中所述的目标DNA分子杂交与互补的DNA分子成为双螺旋，本专利所述的方法包括将双螺旋DNA孵育在缓冲水溶液中，缓冲液中有解旋酶，脱氧核糖核酸聚合酶，2'-脱氧核苷三磷酸，和两种含有非天然核苷酸的引物，一种是正向引物和另一种是反向引物，所述正向引物的序列基本上互补与目标DNA分子的一个片段，所述的反向引物的序列基本与目标DNA分子下游某段序列相同，并且在每一种引物中至少一种腺嘌呤被2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤替代，或者每一种引物中至少一个鸟嘌呤被肌苷取代，或至少有一个胸腺嘧啶被2-硫代胸腺嘧啶取代，或者至少一个胞嘧啶被N4-乙烷基胞嘧啶所取代，并且每一种引物中被替换的核苷酸的总数目是2至6。
3.根据权利要求1所述的流程，包括在一个或多个被取代引物的5'-末端附加一个预先选择的寡核苷酸标记，该寡核苷酸标记至少包含下图中的一个核苷碱基
其中X选自于包含N和CH的基团，W为硝基，氰基，或另外一种吸电子基团，R是连接所指示的杂环碱基到寡核苷酸的地方。
4.根据权利要求2所述的流程，包括在一个或多个被取代引物的5'-末端附加一个预先选择的寡核苷酸标记，该寡核苷酸标记至少包含下图中的一个核苷碱基
其中X选自于包含N和CH的基团，W为硝基，氰基，或另外一种吸电子基团，R是连接所指示的杂环碱基到寡核苷酸的地方。
5.根据权利要求1所述的流程，被取代的核苷酸是放置在距离引物3'-末端第二到第八核苷酸的位置。
6.根据权利要求2所述的流程，被取代的核苷酸是放置在距离引物3'-末端第二到第八核苷酸的位置。
7.根据权利要求1所述的流程，被取代核苷酸的总数目是4，并且这些取代核苷酸被放置在所述引物的3'-末端第二到第五核苷酸的位置。
8.根据权利要求2所述的流程，被取代核苷酸的总数目是4，并且这些取代核苷酸被放置在所述引物的3'-末端第二到第五核苷酸的位置。
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