CN105646708B - 细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体，是以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQ PTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。该多肽抗体可用于特异性检测两种不同长度的基质素2。

Description

细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种细胞外基质网络蛋白的多肽抗体及其制备方法和应用。
背景技术
细胞是生命的单位。我们身体里的每个细胞都生活在细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)中。细胞外基质就象土壤，合适的土壤是保证作物生长(组织器官功能)的必要条件。细胞外基质合成与降解的平衡破坏，最终导致此处细胞外基质过度聚集。细胞外基质合成与降解是受多种因素相互影响、综合调控的复杂过程。深入研究细胞外基质合成与降解综合调控机理对临床干预基质过度聚集、预防纤维化、研发临床治疗药物具有重要意义。
基质素2(Matrilin-2)作为信息转换器(Adaptor)分子是连接细胞外胶原纤维网络、非胶原微丝蛋白网络、蛋白多糖及细胞膜表面受体的重要成分，在细胞内外信息传递和交换等多种生理功能上扮演着十分重要的角色。细胞外非胶原基质网络结构的稳态取决于该蛋白(基质素2)的合成与降解的动态平衡，同时也直接影响细胞外基质与细胞、细胞与细胞、以及基质与基质间的通信关系。
我们课题组新近的研究表明，基质素2独特功能域有一个57碱基、19个氨基酸的剪接，因此在生理状态下存在两种不同长度的基质素2，而且在不同小鼠组织中二者的比例存在差异。我们进一步的研究首次证实，这两种不同长度的基质素2具有生理学的异质性。没有19个氨基酸剪接的长基质素2主要形成自身四聚体、三聚体，同时还很容易形成多聚体，而且相对比较不稳定，容易被酶切断；然而，有19个氨基酸剪接的短基质素2主要形成自身四聚体、三聚体，没有发现形成自身多聚体，而且相对比较稳定，不容易被酶切断。基质素2在细胞外可自身形成多聚体或与其它基质素结合形成杂合多聚体。每个多聚体蛋白的亚基都能与细胞外基质中的胶原蛋白、蛋白多糖或其它非胶原蛋白分子形成胶原依赖性和胶原非依赖性细胞外基质网络。在生理状态下独特功能域存在没有剪接、有剪接两种形式的mRNA和蛋白质，这也许说明两种不同的基质素2协同作用对维持基质素2自身结构稳定性和其与其它细胞外基质蛋白之间的稳态具有重要意义。
我们课题组以及部分科研人员的研究工作证实，基质素2在多种组织中均有表达(参见图1、图2)。由于基质素2广泛分布在各器官和组织中(参见图3)，在研究各种组织(如心、肝、肾、肺、脑、皮肤、阴茎等器官)的生理功能时，基质素2的研究可能具有应用前景。另外，由于各种疾病的预后都与纤维组织增生、包裹有关，因此深入研究基质素2对阐明非胶原网络蛋白基质素2结构的稳定与多种疾病导致纤维组织增生、纤维化过程也将具有指导作用(参见图4)。我们的研究认为，如果能生产一个同时识别两种不同长度基质素2的抗体，则该抗体将可以应用到基质素在各种组织分布方面的研究工作，这将是认识基质素2在不同组织中生理功能以及在疾病发生发展过程中(特别是细胞外基质紊乱、纤维组织增生、疾病纤维包裹、纤维化)病理意义的关键突破点，也将具有肯定的应用前景。另外，深入研究基质素2的剪切及其在细胞外基质网络中的作用也许可能为治疗延缓糖尿病、肾小球硬化、肝硬化等等所致基质过度聚集具有一定的启发作用，也将具有可观的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的特异性不够，不能明确证实是否能够检测具有明显异质性的两种不同长度的基质素2等不足和缺陷，提供一种能够同时识别两种不同长度的基质素2的细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体，还相应提供该细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体的制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体，所述多肽抗体是以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下(以上表示氨基酸序列时，均是以氨基酸三字母缩写的单字母符号表示)：
ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
三字母表示的氨基酸及其单字母缩写如下所示。
甘氨酸Glycine Gly G
丙氨酸AlanineAlaA
缬氨酸Valine Val V
亮氨酸Leucine Leu L
异亮氨酸Isoleucine Ile I
脯氨酸Proline Pro P
苯丙氨酸Phenylalanine Phe F
酪氨酸Tyrosine TyrY
色氨酸Tryptophan Trp W
丝氨酸Serine Ser S
苏氨酸Threonine Thr T
半胱氨酸Cystine Cys C
蛋氨酸Methionine Met M
天冬酰胺AsparagineAsn N
谷氨酰胺Glutarnine Gln Q
天冬氨酸AsparticacidAsp D
谷氨酸Glutamicacid Glu E
赖氨酸Lysine Lys K
精氨酸ArginineArg R
组氨酸Histidine His H
上述的多肽抗体，优选的，所述氨基酸序列的确定源自基质素2的独特功能域。
上述的多肽抗体，优选的，所述独特功能域的氨基酸序列如下：
SRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体的合成方法，包括以下步骤：
以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2(Matrilin 2)的独特功能域C-末端部分的氨基酸序列为基础进行多肽合成；再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体，制备所得多克隆抗体。
上述的合成方法中，优选的：所述合成的具有独特功能域多肽的氨基酸序列如下所示：
ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
上述的合成方法中，优选的：所述C-末端部分的氨基酸序列如下所示：
SRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的多肽抗体在特异性检测两种不同长度的基质素2中的应用。
上述的应用中，优选的，所述多肽抗体用于制作可特异性检测两种不同长度的基质素2的试剂盒。
上述的应用中，优选的，所述多肽抗体用于作为骨关节炎发病机制研究实验的指示剂。
上述本发明设计生产的针对基质素2独特功能域的多肽抗体建立在我们多方位研究的基础上，经过多种实验方法验证证实，这是目前能够同时识别两种不同长度的基质素2的多肽抗体。
我们的抗体与目前可供商业基质素2抗体(如Santa Cruz的SC-66959(H65)、SC-27926(V20)、SC-293397(2B8)、GeneTex GTX59785)相比具有明显的优势。本发明的多肽抗体首先是经过了特别的合成和筛选制备，其能够特异性地检测两种不同长度的基质素2，是目前唯一通过克隆重组检测分析的基质素2抗体。本发明提出的多肽抗体与抗原的抗原决定簇位于特异的独特功能域，该功能域结构特殊，和目前已知蛋白质没有交叉反应，与基质素家族的其它成员(如基质素1、基质素3和基质素4)均没有交叉反应；特异性结合强度非常高。
我们的实验结果显示，本发明提出的多肽抗体可以应用于ELISA、免疫组织化学、免疫荧光组织化学、免疫细胞组织化学和蛋白印痕等，这为该抗体应用于临床迈出了更坚实的一步。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基质素2在多种小鼠组织中均有表达的照片。其中，A为心肌；B为结肠；C为阴茎海绵体；D为食道；E为肺组织；F为肾脏；G为气管软骨；H为胃与食道交界处胃上皮；I为蜒腺导管上皮。
图2为基质素2在骨关节豚鼠关节软骨组织中高表达，其中，A-C为豚鼠关节软骨。
图3为基质素2的剪切在各小鼠组织中存在的电泳图谱。
图4为基质素2在多种纤维组织增生、纤维包裹性疾病组织中的高表达。其中，A为结核球周边肺组织；B为结核球纤维包裹区；C和D为包虫病纤维包裹区；E为血吸虫虫卵沉积区；F为骨关节炎关节面软骨。
图5为基质素2序列及其剪切酶切位点示意图。
图6为本发明实施例中合成的多肽分子检测图。
图7为本发明实施例中蛋白印痕检测实验Western Blot检测V5Tag的电泳图谱。
图8为本发明实施例中蛋白印痕检测实验Western Blot检测Flag Tag的电泳图谱。
图9为本发明实施例中蛋白印痕检测实验Western Blot检测Matrilin 2的电泳图谱。
图10为本发明实施例中ELISA效价鉴定实验测本发明多肽抗体的效价分析图。
图11为基质素2在骨关节、软骨组织中的高表达，其中的E-F为早期骨关节炎病人。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体，该多肽抗体是以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下：
ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
上述氨基酸序列的确定源自基质素2的独特功能域。基质素2序列及其剪切酶切位点示意图如图5所示。独特功能域的氨基酸序列如下：
SRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
上述本实施例的细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体的合成方法，包括以下步骤：
以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2(Matrilin 2)的独特功能域C-末端部分的氨基酸序列为基础进行多肽合成(也可以委托其他市场主体如吉尔生化(上海)有限公司进行多肽的合成)；本实施例中合成的多肽经质谱检测结果显示(参见图6)氨基酸序列正确；再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体，制备所得多肽抗体。
如图5所示，上述的合成方法中，合成的具有独特功能域多肽的氨基酸序列如下所示：
ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
所述C-末端部分的氨基酸序列如下所示：
SRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
蛋白印痕检测应用实验：
对上述本实施例合成的多肽抗体进行蛋白印痕检测实验，实验过程如下(Westernblot分析重组质粒产物)：
实验重组cDNA质粒，在表达质粒pcDNA3.1-V56His的C-端都附着一个V5尾巴，这样所有的质粒表达产物都能够被V5检测到。为了区分表达质粒产物Matrilin 1、Matrilin 2和Matrilin 3，在重组含不同长度的Matrilin 2以及完全删除独特功能域的Matrilin2cDNA质粒时，在其N-端加上了一个FLAG帽子，这样FLAG就可以检测到不同结构的Matrilin2。
将质粒转染COS-1细胞系72小时后，收集细胞培养上清液，用4％-15％梯度电泳分离，把质粒表达产物转移在PVDF膜上。通过与V5、FLAG和Matrilin 2抗体(即本实施例合成的多肽抗体)膜杂交，结果显示V5抗体能够检测到含有两种不同长度的Matrilin 2(即Matrilin 2L和Matrilin 2S)、完全除掉独特功能域的Matrilin 2(即Matrilin 2D)、Matrilin 1以及Matrilin 3的质粒所有表达产物(参见图7)。然而，FLAG抗体只能够检测到含两种不同长度的Matrilin 2和完全除掉独特功能域的Matrilin 2质粒表达产物，该抗体不能检测到含Matrilin 1和Matrilin 3的质粒表达产物(参见图8)。而本发明制备合成的具有独特功能域的多肽抗体则能够检测到所有两种不同长度的Matrilin 2(参见图9)，但该抗体检测不到完全除掉独特功能域的Matrilin 2质粒表达产物及其他的Matrilin 1以及Matrilin 3的质粒表达产物。
由上可见，蛋白印痕检测证实我们制备的抗体能够特异性地识别两种不同长度的Matrilin 2。
ELISA效价鉴定实验：
采用ELISA方法对上述本实施例合成的多肽抗体进行效价鉴定，鉴定结果如图10所示。
免疫应用实验：
我们选择上述基质素2独特功能域C-末端的多肽序列作为抗原免疫新西兰大白兔，可获得多克隆抗体。合成的多肽经过测定，多克隆抗体经过ELISA和克隆重组表达质粒验证，我们的多肽抗体同样可以特异性识别两种不同长度的基质素2。该多肽抗体与基质素1和基质素3没有交叉反应。另外，该多肽抗体的免疫组织化学、免疫荧光组织化学证实为特异性抗体。
上述本实施例合成的多肽抗体经过多重鉴定后发现其具有以下特征：
1.1经克隆重组蛋白印痕证实，本发明合成的多肽抗体能够检测两种不同长度的基质素2，且与基质素1和基质素3没有交叉反应(结果见上述蛋白印痕检测应用实验)；
1.2本发明合成的多肽抗体可以广泛应用于ELISA、免疫组织化学、免疫荧光组织化学、免疫细胞组织化学和蛋白印痕等，可以用于开展多种研究，并具有确定性的临床应用前景。
例如，图11显示了基质素2在早期骨关节炎病人骨组织中的高表达，其提示基质素2在骨关节炎中具有肯定的作用；而上述本发明的应用研究实验表明，本发明合成制备的多肽抗体能够在研究骨关节炎的发病机制甚至防治上具有应用前景，可用于作为骨关节炎发病机制研究实验的指示剂。

Claims (1)

1.一种分离的抗原，其氨基酸序列是：SRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。
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