CN105646476B

CN105646476B - 联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105646476B
Application number: CN201610127128.3A
Authority: CN
Inventors: 陈填烽; 杨亚慧; 曾钦松
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2036-03-07
Also published as: CN105646476A

Abstract

本发明公开了联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物及其制备方法和应用。本发明合成该联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物利用了经典的缩合反应，用两个相邻氨基与芳香醛的醛基发生缩合反应经分离提纯得到4个5‑(2‑取代芳基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑化合物和3个5‑(1‑取代苄基‑2‑取代芳基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑化合物。该联苯并硒二唑衍生物具有良好的抗肿瘤活性，选择性及稳定性都较好，对膀胱癌细胞的转移也有显著的抑制作用。本发明所述的联苯并硒二唑衍生物可应用在治疗膀胱癌的抗肿瘤药物中。

Description

联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种具有抗肿瘤活性的联苯并硒二唑衍生物及制备方法与应用。

背景技术

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率居泌尿系统恶性肿瘤的首位；是发生在人身上最常见的十大肿瘤之一，而且在男性中其发病率更高。膀胱灌注治疗是膀胱癌的常规治疗方法，并且延缓或防止其复发。常用的膀胱灌注治疗药物包括免疫增强剂卡介苗(BCG)和化疗药物，如丝裂霉素C(MMC)、阿霉素、表柔比星和吉西他滨。[Shelley MD,et al,Cancer Treat Reviews,2010,36:195-205]。有研究表示尿液pH值呈弱酸性，MMC在酸性环境下极容易失活，导致MMC的治疗效果降低，并且会增加肿瘤复发的风险。[Maeda T,et al,The Journal of Urology,2011,185:802-806；Wright ME,et al,Cancer Causes Control,2005,16:1117-1123]。因此，膀胱的酸性环境限制了膀胱癌化疗药物的疗效。而设计合成或筛选具有在低pH值环境下高稳定的抗癌药物的新策略已成为当今肿瘤防治领域的研究热点。

微量元素硒现今被称为生命的火种，有抗癌之王和长寿元素等美誉[RaymanM.P.The Lancet,2012,379(9822):1256-1268]。而硒元素主要以硒蛋白质的形式在生物体内存在并发挥作用，如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)等，对维持人体正常生理功能起着关键作用。而近年来，硒在抗肿瘤防治中的作用也越来越受到关注和研究。有研究发现，硒蛋白能够促使CD4+T细胞更倾向分化成Th1细胞，从而产生一个抗病毒的免疫作用及增强抗肿瘤的反应[Hoffmann F.W.,et al,The Journal of nutrition,2010,140(6):1155-1161；Hoffmann P.R.,et al,Archivum immunologiae et therapiaeexperimentalis,2007,55(5):289-297]。而鉴于硒良好的生物、药理活性，特别是在癌症方面有良好的防治效果，近几十年来，有关于含硒抗肿瘤药物的合成和临床试验也是科学研究的热点。早期的研究大多集中在无机硒化合物领域。但随着研究的深入，相比起无机硒化合物，有机硒化合物具有易吸收、高活性、相对低毒性、环境污染小等特点，因而引起了广泛的关注。特别是有机硒的抗肿瘤活性机制研究更是取得了一定的进展，如诱导肿瘤细胞凋亡或细胞周期阻滞；调节谷胱甘肽过氧化物酶及硫氧还蛋白还原酶活性，使细胞免受氧化损伤；提高机体免疫力和抑制肿瘤新生血管的分化等[G Mugesh,et al,ChemicalReviews,2001,101:2125-2179]。

本实验室在前期工作中合成的硒芳香杂环化合物SPO及ASDO能高效、选择性地抑制多种肿瘤细胞的增殖。它们均可通过激活Caspases及Bcl-2家族蛋白、引起线粒体跨膜电位的消散和细胞氧化损伤而导致细胞凋亡[Chen TF,et al,Biomedicine&Pharmacotherapy,2008,62:77-84；Chen TF,et al,Chemico-biological interactions,2009,180:54-60]。最近，我们发现硒代胱氨酸能通过引起细胞的DNA损伤协同五氟尿嘧啶引起肿瘤细胞的凋亡[Fan C,et al,Free Radical Biology and Medicine,2013,65:305-316]。此外，我们利用此系列中部分有机硒(R＝H)以增敏一线抗肿瘤阿霉素的化疗效果，而达到高效低毒和克服高糖引起的肿瘤细胞耐药的结果[Yuedan Liu,et al,Chemistry-AnAsian Journal.2015,10(3):642-652]。

发明内容

本发明的目的在于提供联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物及其制备方法和应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物，包括衍生物1a-1d和2a-2c；其结构式为：

5-(2-取代芳基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑化合物，1a:R＝H；1b:R＝OCH₃；1c:R＝Cl；1d:R＝NO₂；

5-(1-取代苄基-2-取代芳基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑化合物；2a:R＝H；2b:R＝OCH₃；2c:R＝Cl。

所述的联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物的制备方法，用两个相邻氨基与芳香醛的醛基发生缩合反应经分离提纯得到联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物1a-1d和2a-2c；

衍生物1a-1d的制备方法为：首先合成得到中间产物4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基；然后将中间产物4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基溶解在溶剂中，按照中间产物和芳香醛1：1的摩尔比加入对应的芳香醛：苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、对氯苯甲醛、对硝基苯甲醛，并加入对甲基苯磺酸作为催化剂；在80℃下搅拌40min，反应结束后冷却至室温，抽滤，取固体得到粗产物；将粗产物以管柱色谱分析法分离提纯得到深黄色固体即目标产物1a、1b、1c和1d；

衍生物2a-2c的制备方法为：首先合成得到中间产物4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基；然后将中间产物4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基溶解在溶剂中，按照中间产物和芳香醛1：2的摩尔比加入对应的芳香醛：苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、对氯苯甲醛，并加入对甲基苯磺酸作为催化剂；在80℃下搅拌2h，反应结束后冷却至室温，抽滤，取固体得到粗产物；将粗产物以管柱色谱分析法分离提纯得到深黄色固体即目标产物2a、2b、2c。

所述的联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物的制药应用，该联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物应用在制备治疗膀胱癌的抗肿瘤药物中。

所述的具有抗肿瘤活性的联苯并硒二唑衍生物的制备方法具体包括如下步骤：

1：5-(2-取代芳基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑化合物的合成

(1)称取3mmol 3,3',4,4'-联苯四胺于500mL烧瓶中，用250mL盐酸溶液(浓HCl:H₂O约为1:5)充分溶解。称取3mmol SeO₂溶于20mL热水，溶解后转入恒压滴液漏斗，使其缓慢加入烧瓶中。在室温下磁力搅拌反应2h。反应结束后，抽滤，滤液用NaOH调至中性，再次抽滤得到中间产物即4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基，为红棕色固体粉末，烘干，产率70％。

(2)称取1mmol 4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基于50mL烧瓶中，加入25mL DMF充分溶解。加入1mmol相应的芳香醛(苯甲醛，对甲氧基苯甲醛，对氯苯甲醛，对硝基苯甲醛)，再加入适量对甲基苯磺酸作为催化剂。在80℃下搅拌40min。反应结束后冷却至室温，倒入加有适量Na₂CO₃的溶液中搅拌30min，抽滤，取滤液，滴加到1L蒸馏水中，析出橘黄色粘稠物质，再次抽滤，取固体得到粗产物。将粗产物以管柱色谱分析法分离提纯(二氯甲烷：甲醇＝5：1为洗脱液)得到深黄色固体即目标产物(1a、1b、1c和1d)，产率40％。

2：5-(1-取代苄基-2-取代芳基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑化合物的合成。

称取1mmol 4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基于50mL烧瓶中，加入25mL DMF充分溶解。加入2mmol相应的芳香醛(苯甲醛，对甲氧基苯甲醛，对氯苯甲醛)，再加入适量对甲基苯磺酸作为催化剂。在80℃下搅拌2h。反应结束后冷却至室温，倒入加有适量Na₂CO₃的溶液中搅拌30min，抽滤，取滤液，滴加到1L蒸馏水中，析出橘黄色粘稠物质，再次抽滤，取固体得到粗产物。将粗产物以管柱色谱分析法分离提纯(二氯甲烷：甲醇＝5：1为洗脱液)得到黄色固体即目标产物(2a、2b和2c)，产率35％。

本发明所述的具有抗肿瘤活性的联苯并硒二唑衍生物在抗肿瘤方面的研究如下：

1：细胞活性检测(表1，图4)：通过对一系列联苯并硒二唑衍生物的对膀胱癌细胞(EJ,T24)的抗肿瘤活性进行评价，从表1中我们发现其具有良好的体外抗肿瘤活性，尤其是1b对EJ癌细胞的生长抑制效果最好，且安全系数也比较高，从图4也可看出1b在不同pH的条件下的稳定性优于临床用药丝裂霉素。

2：细胞吸收分析结果表明(图1-3)：化合物的脂水分配系数及结构对其性质有重要影响，因此不同化合物的脂水分配系数将影响其对肿瘤的抑制作用。如图1所示，1b的亲油脂数是1.7,远高于1a(0.65)，此结果与它们的抗癌效果呈正相关。此外，1a和1b相比,引入带供电子的取代基(甲氧基组),表现出较强的抗癌效果。相比之下,化合物1c和1d含吸电子基，而其抗癌效果没有1b的好。图2所测的细胞吸收的效率与其抗肿瘤活性呈正相关，说明这些化合物的抗肿瘤活性与其进入细胞的能力是紧密相关的。为了探究药物进入细胞的方式，我们做了细胞定位的研究。图3表明有机硒1b通过胞吞以及溶酶体的形成进入肿瘤细胞。经过4小时，有机硒1b已开始进入EJ和T24细胞中。在此之后，有机硒1b逐渐积累在溶酶体，12小时后有部分分散到细胞质中，确没有在细胞核观察到。说明有机硒1b主要定位于细胞的溶酶体。

3：检测对细胞转移的作用结果表明(图5-7)：药物1b能够在亚细胞毒性浓度(0.1-0.4μM)下有效抑制膀胱癌细胞(EJ,T24)迁移、侵袭。

4：分子机制的研究结果表明(图8-12)：半胱氨酸蛋白酶家族(Caspases)，在启动和执行细胞凋亡中扮演了重要角色。图8和图9发现有机硒1b杀死肿瘤细胞是通过凋亡的途径，之后我们检测到是通过激活caspase通路而导致细胞凋亡的。而ROS作为重要的凋亡启动子，其除了能够介导氧化损伤，还能够调控各种激酶介导的促生存信号通路活化。有机硒1b通过介导活性氧ROS在胞内的累积caspase引起了激酶AKT,ERK和JNK的表达水平的改变，即抑制AKT,ERK的磷酸化并活化JNK，p53，同时也激活MAPKs，最终诱导了癌细胞的凋亡。

本发明具有如下的优点及效果：

(1)本发明所述的联苯并硒二唑衍生物具有良好的抗肿瘤活性。以1b为例，其对膀胱癌细胞的抑制作用显著高于临床抗肿瘤药物丝裂霉素，并深入探究了其抗肿瘤机制。

(2)本发明所述的联苯并硒二唑衍生物在不同pH条件下具有较好的稳定性，优于临床抗肿瘤药物丝裂霉素C。

(3)本发明所述的联苯并硒二唑衍生物能抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。

附图说明

图1为有机硒1a-2c及MMC的脂水分配系数(log p)。

图2为有机硒1a-2c在细胞中的吸收。(A)分析用同一浓度(20μM)的不同有机硒处理12h期间，EJ细胞对药物的吸收量。(B)分析同一浓度(20μM)的有机硒1b作用于肿瘤细胞EJ和正常膀胱细胞12h期间，不同细胞对1b的吸收量的不同。

图3为有机硒1b在肿瘤细胞中的定位分析。(A)在24h内，有机硒1b(20μM)在EJ细胞中的定位图。(B)在24h内，有机硒1b(20μM)在T24细胞中的定位图。

图4为对有机硒1a-2c在不同pH的条件下的稳定性分析。(A)在pH7.0及pH4.0条件下随着时间的延长测得的1a,1b,2b及MMC的荧光光谱。(B)在pH7.0及pH4.0条件下随着时间的延长测得的1c,1d,2a和2c的荧光光谱。

图5为有机硒1b在亚毒性浓度下处理肿瘤细胞24h后，对EJ(A)和T24细胞(B)的毒性分析和细胞形态的观察(C)。

图6为有机硒1b处理24h后，对EJ(A，B)和T24细胞(C,D)的迁移的抑制作用。

图7为有机硒1b处理24h后，对EJ(A，B)和T24细胞(C,D)的侵袭的抑制作用。

图8为PI-流式细胞周期检测。分析同一浓度(20μM)的不同有机硒作用72h后，EJ细胞(A)和T24细胞(B)的细胞周期变化的分析。

图9为不同浓度的有机硒1b作用于膀胱癌EJ和T24细胞72h后引起的细胞周期的变化。

图10为不同有机硒在EJ细胞内引起的活性氧水平的分析。相同浓度(20μM)的不同有机硒作用在EJ细胞后，用10μM的DHE荧光探针检测其ROS的水平。

图11为有机硒1b作用在EJ细胞后活性氧水平的变化。(A)不同浓度的有机硒1b作用在EJ细胞后，用10μM的DHE荧光探针检测其ROS的水平。(B)有机硒1b(20μM)随着作用时间的不同，DHE探针的荧光强度的变化。

图12为有机硒1b作用于EJ细胞72h后引起的凋亡相关蛋白表达水平的变化。(A)有机硒1b引发EJ细胞凋亡的信号通路图；(B)定量检测有机硒1b激活EJ细胞中的caspase家族的相对表达量。用Western blot检测有机硒1b改变EJ细胞内(C)p-BRCA1,p-p53,和(D)P38,p-P38,JNK,p-JNK,ERK,p-ERK,AKT,p-AKT表达的情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：5-(2-取代芳基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑化合物的合成

(1)称取3mmol 3,3',4,4'-联苯四胺于500mL烧瓶中，用250mL盐酸溶液(浓HCl:H₂O约为1:5)充分溶解。称取3mmol SeO₂溶于20mL热水，溶解后转入恒压滴液漏斗，使其缓慢加入烧瓶中。在室温下磁力搅拌反应2h。反应结束后，抽滤，滤液用NaOH调至中性，再次抽滤得到中间产物(4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基)，为红棕色固体粉末，烘干，产率70％。

(2)称取1mmol 4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl)苯-1,2-二氨基于50mL烧瓶中，加入25mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解。加入1mmol相应的芳香醛(苯甲醛，对甲氧基苯甲醛，对氯苯甲醛，对硝基苯甲醛)，再加入适量对甲基苯磺酸作为催化剂。在80℃下搅拌40min。反应结束后冷却至室温，倒入加有适量Na₂CO₃的溶液中搅拌30min，抽滤，取滤液，滴加到1L蒸馏水中，析出橘黄色粘稠物质，再次抽滤，取固体得到粗产物。将粗产物以管柱色谱分析法分离提纯(二氯甲烷：甲醇＝5：1为洗脱液)得到深黄色固体即目标产物(1a、1b、1c和1d)，产率40％。

实施例2：5-(1-取代苄基-2-取代芳基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑化合物的合成。

实施例3：MTT法检测膀胱癌细胞及正常细胞的增殖

试验所使用的细胞株均为购自ATCC公司的国际通用的肿瘤细胞株，即EJ膀胱癌细胞，T24膀胱癌细胞，SV-HUVEC正常膀胱细胞。MTT(噻唑蓝)能被活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶还原成为不溶于水的甲瓒结晶，DMSO溶解后在570nm有吸收峰，从而用来检测细胞活性。分别将癌细胞(2×10⁴个/mL)、正常细胞(5×10⁴个/mL)接种于96孔板，每孔100μL，每组设3个重复。接种细胞24h后分别加入不同浓度的有机硒(1a-2c)，并继续培养72h。然后每孔加入5mg/mL MTT 25μL，继续培养4h，再吸去上清培养基，加入DMSO 150μL/孔，振荡15min后于自动酶标仪上测定570nm处的吸光值。计算细胞存活率，用IC₅₀值表示细胞半数抑制浓度。结果如表1所示，7个新的联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物(1a-2c)能很好的抑制膀胱癌细胞(EJ,T24)的生长，其中1b的抗肿瘤活性最强，且其对人体正常膀胱细胞毒性比较低，即安全系数也比较高。明显优于临床上使用的抗肿瘤药物注射用盐酸丝裂霉素(MMC)，表明有机硒1b在肿瘤细胞和正常细胞之间具有选择性。

表1苯并[1,2,5]硒二唑化合物及MMC的体外肿瘤活性(IC₅₀)和安全系数的研究

^a：每个化合物对不同细胞的IC₅₀值由MTT法计算得到；

^b：人体正常膀胱细胞；

^c：安全系数Safe Index＝IC₅₀(SV-HUC-1)/IC₅₀(EJ)；

实施例4：测定有机硒及丝裂霉素C的脂水分布系数(logP)。

将正辛醇和饱和的PBS溶液等体积混合，以转速为45rpm放到摇床上摇24h，用分液漏斗将正辛醇和饱和的PBS分液。往离心管中分别加入3mL上述已分液的PBS和正辛醇溶液，并往混合溶液中加入有机硒及MMC的储备液配成一定的浓度。以转速为45rpm放到摇床上摇24h，离心，然后分别用紫外光谱定量测出水相(PBS层)和油相(正辛醇层)药物的含量，紫外测定时设定的波长为各药物的最大紫外吸收波长。脂水分布系数logP＝化合物在油相的浓度/化合物在水相的浓度＝c油相/c水相。图1所示，1b的亲油性要大于1a,1c,1d，和其抗肿瘤效果成正相关。

实施例5：检测膀胱癌细胞及正常细胞对有机硒的吸收效果。

分别取对数生长的癌细胞于6孔板中，培养24h后，更换提前预热的无血清无酚红的培养基，继续孵育培养2h。分别培养板加入同一浓度的不同有机硒(1a-2c)或不同浓度的1b，在培养箱孵育的过程中，按照以下时间0,1,2,4,6,8,10,12h分别从孔里取出100μL的培养基于96孔板中，并在药物的最大紫外吸收波长下测出不同时间点下取出培养基的吸光值，从而计算出培养基中药物的含量。另外，实验最后，将培养板中的细胞用胰酶消化下来，并在显微镜下计数得到细胞密度，从而计算出肿瘤细胞/正常细胞对不同药物的吸收量(μmol/cells).实验结果图2表明，在相同浓度下，随着时间的变化，EJ细胞对有机硒1b的吸收比其他化合物的多，且与正常细胞相比，癌细胞吸收量也较大，说明了1b吸收效果最好且具有选择性。

实施例:6：有机硒1b在细胞内的定位。

为了探究药物进入细胞的方式，我们做了细胞定位的研究。在2cm培养皿接种癌细胞(5×10⁴/mL)，孵育24h后按不同时间点加入相同浓度的药物，检测前两小时用Lyso-tracker红色染料染细胞的溶酶体，检测前半小时用DAPI蓝色染料染细胞核，最后用荧光显微镜(FL Auto Imaging System,AMAFD1000)检测药物在细胞内的定位情况。图3表明有机硒1b通过内吞作用进入肿瘤细胞。经过4小时，有机硒1b已开始进入EJ(图3A)和T24(图3B)细胞中。在此之后，有机硒1b逐渐积累在溶酶体，12小时后有部分分散到细胞质中，确没有在细胞核观察到。说明有机硒1b主要定位于细胞的溶酶体。

实施例7：检测有机硒(1a-2c)在不同pH条件下的稳定性。

有相关的临床研究表明，膀胱细胞所处的微环境偏酸性，而临床药物丝裂霉素水溶液状态在pH7.0以下时随其下降稳定性也下降。我们可以通过测荧光光谱的变化来检测它们的结构稳定性。取7个药物(1a-2c)及MMC用不同pH的PBS配成溶液在室温条件下进行孵育，在不同时间点用荧光分光光度计检测它们的荧光光谱的变化。如图4所示，在pH7.0或其以下的条件下，随着处理时间的延长，有机硒1b荧光光谱相较于临床用药丝裂霉素的最大峰值对应波长并未发生变化，说明其稳定性也是最好的。

实施例8：检测有机硒1b抑制膀胱癌细胞转移的效果。

实验前，先进行MTT预实验，确定药物对细胞迁移、侵袭影响的加药浓度，图5表明在该浓度下，1b对细胞没有毒性。

(1)细胞迁移实验：取对数生长期的细胞消化下来并均匀接种在6孔板中，用完全培养基预培养24h后，无血清培养基饥饿处理6h，以无菌的tip头在6孔板中央划线，用PBS清洗脱落细胞3次并更换含有3％FBS的培养基，然后加入不同浓度的1b处理24h，最后用DAPI染色，用显微镜实时观测细胞的迁移情况，拍照并计算迁移率。图6表明在该亚毒性的浓度下，有机硒1b对EJ和T24细胞的迁移有显著的抑制作用，且对EJ细胞的抑制效果作用相对明显。

(2)细胞侵袭实验：先将基质胶隔夜4℃融解。将溶解的基质胶按24μg/孔均匀铺在Transwell培养室(8mm,Corning,NY,USA)的上室，在37℃下放置4-8小时使其凝固；然后将处于对数生长期的细胞消化下来，以无血清培养基重悬细胞并接种(5×10⁵cells/ml，100μL/well)于上室。下室加入500μL完全培养基，同时分别在上室下室加入相同浓度的药物处理24h；弃培养基，PBS清洗3次，棉棒擦掉上室未侵袭过去的细胞，甲醇固定10min后，姬姆萨染色，水洗、烘干后倒置显微镜拍照，计算侵袭率。图7表明在该亚毒性的浓度下，有机硒1b对EJ和T24细胞的侵袭有显著的抑制作用，且对EJ细胞侵袭的抑制效果作用相对明显。

实施例9：检测有机硒对膀胱癌细胞周期的影响。

本发明用流式细胞仪进行细胞周期分析。流式细胞仪用于分析观察是否在G1峰前出现凋亡特有的凋亡峰(Sub-G1 phase)，计算该峰细胞占总细胞的百分数，即为凋亡百分数(AP:％)。实验采用PI染色，在Beckman Coulter Epics XL MCL流式细胞仪上进行分析。癌细胞分别用等浓度的有机硒(1a-2c)或不同浓度的1b处理72小时后，离心收集细胞，用PBS清洗两次，加入70％乙醇，-20℃放置固定过夜，离心，清洗后进行细胞PI染色。DNA含量测定利用Beckman流式细胞分析仪(Beckman Coulter Epics XL MCL flow cytometer，Miami,FL)。细胞周期分布利用软件MultiCycle(Phoenix Flow Systems,San Diego,CA)。用DNA柱状图表示细胞在G0/G1、S和G2/M各相的分布比例。凋亡细胞亚二倍体DNA含量测定通过定量图中sub-G1峰测得。每个样品分析10000颗细胞。本发明的实验结果如图8所示，不同的有机硒化合物均以20μM浓度作用于膀胱癌细胞72h，细胞周期均发生了变化，而有机硒1b效果最明显，引起细胞的凋亡，从对照组的2.2％上升到处理组的74.1％。作用于T24的各有机硒中，有机硒1b也引起细胞的凋亡，从对照组的2.1％上升到处理组的59.1％。而从图9结果中可知，细胞有机硒1b以不同浓度处理两种细胞中均引起了细胞周期的变化，且呈剂量效应，这表明了有机硒1b是通过诱导细胞凋亡而抑制膀胱癌细胞生长的。

实施例10：利用DHE探针检测有机硒介导的胞内活性氧含量的变化。

由于有机硒1b引起细胞的凋亡，而细胞内的ROS的改变对细胞凋亡起着重要的作用。收集细胞并用PBS重悬(1×10⁶cells/mL)，加入DHE探针至样品终浓度为10μM。37℃避光孵育30min后，将标记的细胞加入含有等浓度的有机硒(1a-2c)或是不同浓度的1b的96孔板中，利用荧光酶标仪分别以不同的激发和发射波长检测胞内探针DHE(ex＝300nm,em＝610nm)的荧光强度。DHE细胞染色则按照以下步骤：细胞接种至2cm培养皿培养24h后，用工作浓度为10μM的DHE探针孵育20min，再加入有机硒1b孵育，在一定的时间点使用荧光显微镜对细胞进行拍照。从图10结果表明，不同有机硒1a-2c在同一浓度下(20μM)作用于EJ，在随着时间的推移，有机硒1b在EJ细胞内引起的ROS在短时间内上升最显著，最高达到了对照组的134.7％。同时图11A表明了有机硒1b随着浓度的升高在EJ细胞内引起的ROS水平也逐渐上升，且有机硒1b以20μM浓度处理EJ细胞后，图11B所示测得的探针的荧光强度的图片也与上述结果一致。

实施例11：检测被激活的细胞凋亡通路。

为了检测有机硒1b诱导EJ细胞凋亡是否与Caspase激活有关，通过荧光分析检测了三种重要的Caspases，Caspase-3,-8,-9。细胞经过药物处理后，收集细胞总蛋白，并用BCA法测定不同处理组蛋白样品的浓度。将样品置于96孔板，并加入caspase的特异性底物(Ac-DEVD-AMC for caspase-3,Ac-LEHD-AMC for caspase-9 and Ac-IETD-AMC forcaspase-8)，最后加入相应体积的PBS，37℃避光孵育2h。孵育结束后用荧光酶标仪(SpectroAmaxTM250)检测不同处理组的荧光强度(ex＝380nm,em＝440nm)，并计算相对活性。在图12B观察到Caspase-3明显被激活而且随着1b浓度的增加被激活的量也不断上升而Caspase-8、9都有相应的变化。这表明了同时引起了内在和外在的凋亡途径。

用Western blotting法检测有机硒引起的细胞内蛋白表达的变化。药物处理后RIPA裂解液裂解细胞制备细胞的总蛋白取液，并用BCA法测定蛋白质浓度。蛋白分离采用Tricine-SDS-PAGE体系，每泳道以30-60μg蛋白上样，75V电压电转至硝酸纤维膜75min，5％脱脂牛奶封闭1h，TBST清洗三次后加入不同蛋白的特异性抗体，4℃孵育过夜，TBST清洗三次后加入HRP标记的二抗孵育2h，最后用Kodak X-ray化学发光检测仪显色。每次实验均以β-actin作为内参校正。Western blotting分析图12C可以发现随着1b剂量的增加p-p53和p-BRCA1增加，同时总的p53蛋白水平变化不大。这些结果表明1b诱导的细胞凋亡和p53信号通路的活化有密切的关联。图12D结果表明，1b作用于EJ细胞后引起了激酶AKT,ERK和JNK的表达水平的改变，即抑制AKT,ERK的磷酸化并活化JNK，同时也激活MAPKs，最终诱导了癌细胞的凋亡。图12A总结了本实验的信号通路图。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物1b的制药应用，其特征在于，该联苯并[1,2,5]硒二唑衍生物应用在制备治疗膀胱癌的抗肿瘤药物中，其结构式为：