CN105638457A - Ems离体诱变提高火龙果抗寒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法。本发明以从火龙果成熟枝条上诱导的无菌幼苗为试材，通过EMS诱变处理，对成活的幼苗施加HYP选择压，通过选择压能够成活的幼苗再经低温诱导，获得的了火龙果无菌幼苗具有良好的抗寒能力。这样的方法不仅有利于保存母本的优良性状和后代的遗传稳定性。同时采用离体诱导，操作条件可控，突变率相对较高，为火龙果的抗寒新品种选育及寻找提高抗寒性的新途径提供重要的理论依据和参考。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。

Description

EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法

技术领域

本发明涉及果树诱变育种技术领域，尤其是一种EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法。

背景技术

火龙果为仙人掌科多年生攀援性肉茎植物，原产中美洲，是热带、亚热带的名优水果之一。火龙果抗寒力较差，即使在热量丰富的亚热带地区栽培也可能受低温冻害的影响，如2007年底至2008年初的低温凝冻天气、2013年12月的低温冷害及2014年2月的倒春寒天气，造成广西、贵州、云南等南亚热带地区大面积火龙果园受冻严重。有研究表明，当温度低于5℃时将可能导致火果受冻，其幼芽、嫩枝，甚至包括部分成熟枝条也会被冻伤或冻死。温度越低，持续时间越长，对后期火龙果产量和品质的影响越严重，0℃是大多数栽培品种能忍受的最小阈值。但目前生产上耐低温的火龙果资源相当缺乏，且受区域的限制，国内外有关火龙果抗寒及育种等方面的研究相当少见。

EMS诱变技术是现代分子育种及资源创新的一种行之有效的方法之一。特别是诱变剂与组织培养技术相结合，可提高细胞有益突变率10-100倍。而诱变材料的选择园艺植物诱变育种成败的关键之一。在离体化学诱变中，茎尖、叶片、愈伤组织等均可作为诱变材料使用，但必须保证诱变剂的有效渗入和诱变后材料能进一步生长、发育，最终产生新的个体。因此，提高诱变频率和减少外植体的损伤是化学诱变处理中的一个矛盾，如何确定诱变剂浓度和处理时间因材料不同而异，即使同一材料的不同形态采用EMS诱变效果也存在较大差异。

发明内容

本发明的目的是：提供一种EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，它成功率高，所获得的火龙果无菌幼苗具有较强的抗寒能力。

本发明是这样实现的：EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，包括如下步骤：

1）以从火龙果成熟茎段上培育的单个无菌苗为试材，将试材浸泡在体积浓度为3.71-3.95%的EMS处理液中，使试材与EMS处理液完全接触，处理期间经常摇动，使溶液与无菌苗均匀接触，处理时间为8.26-9.32小时；

2）在步骤1）的处理时间完毕后，用无菌水冲洗5次以上，去除毒性，吸干表面水份，将单株苗接种于继代培养基上恢复生长25-35d，促进其生长分化；

3）在步骤2）中将恢复生长后分化出的不定芽进行HYP逐步筛选，在最大耐受浓度为20mmol/L的HYP的培养基中培养筛选12-18d后，存活的芽继续接入含有20mmol/L的HYP的选择培养基中培养18-25d；再将存活的材料转入不含HYP的培养基中培养18-25d；

4）在步骤3）中最后存活的材料在0-4℃下进行低温诱导7-24d，从而增强火龙果的抗寒性。

所述的HYP筛选采用多步筛选法，将EMS诱变处理后新增殖的不定芽依次转入含不同浓度的HYP选择培养基上培养15d，以未经EMS处理的芽作为对照；筛选出火龙果对HYP的最大耐受浓度20mmol/L，即为选择压。

步骤2）中的继代培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.05%+CCC0.5mg/L。

步骤3）中采用筛选培养基均为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.05%+CCC0.5mg/L+HYP20mmol/L；步骤3）中不含HYP的培养基即为步骤2）中的继代培养基。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明以从火龙果成熟枝条上诱导的无菌幼苗为试材，通过EMS诱变处理，对成活的幼苗施加HYP选择压，通过选择压能够成活的幼苗再经低温诱导，获得的火龙果无菌幼苗具有良好的抗寒能力。这样的方法不仅有利于保存母本的优良性状和后代的遗传稳定性。同时采用离体诱导，操作条件可控，突变率相对较高，为火龙果的抗寒新品种选育及寻找提高抗寒性的新途径提供重要的理论依据和参考。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。

附图说明,

图1为0℃持续低温处理下REC的变化情况；

图1中，E5代表3.8%EMS，H6代表20mmol/LHYP，下同；

图2为0℃持续低温处理下MDA含量的变化情况；

图3为0℃持续低温处理下Pro含量变化情况；

图4为0℃持续低温处理下SOD酶活性变化情况；

图5为4℃持续低温处理下REC的变化情况；

图6为4℃持续低温处理下MDA含量的变化情况；

图7为4℃持续低温处理下Pro含量变化情况；

图8为4℃持续低温处理下SOD酶活性变化情况。

具体实施方式,

本发明的实施例1：EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，包括如下步骤：

1）以从火龙果成熟枝条上培育的单个无菌苗为试材，将试材试材放置到配好的浓度为3.8%（体积比）的EMS处理液中，轻微摇晃使试材与EMS处理液完全接触，处理期间经常摇动，使溶液与无菌苗均匀接触，处理时间为9小时；

2）在步骤1）的处理时间完毕后，用无菌水冲洗5次以上，去除毒性，吸干表面水份，将单株苗接种于继代培养基上恢复生长20d，促进其生长分化；

3）在步骤2）中将恢复生长分化出的不定芽进行HYP筛选。HYP筛选采用多步筛选法，将EMS诱变处理后新增殖的不定芽依次转入含不同浓度的HYP（2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L）选择培养基上培养15d，以未经EMS处理的芽作为对照；筛选出火龙果对HYP的最大耐受浓度20mmol/L，即为选择压；将筛选存活的芽继续接入含有20mmol/L的HYP的选择培养基中培养20d；再将存活的材料接入不含HYP的培养基中培养20d；

4）在0℃下进行低温诱导处理，处理时间为0-72h，每隔12h随机取样进行初步的抗寒性分析鉴定，以未经EMS和HYP处理的无菌幼苗为对照，每处理3次重复。

试验结果如图1-4所示。

大量研究表明，电解质渗出率（REC）作为抗寒性鉴定的重要指标，其大小与植物的抗寒性呈显著负相关。从图1中可以看出，无论是对照组还是处理组，REC均随低温持续时间延长而增加，且以对照组的REC显著高于处理组，说明处理组细胞受伤害的程度明显低于对照，其抗寒性较对照大大提高。

丙二醛（MDA）是脂质过氧化作用的终产物，其含量与植物受逆境胁迫程度有关，是衡量脂质过氧化作用强弱的主要指标。常温下植物体内MDA很少，但遭遇逆境等伤害时，MDA含量升高，其主要原因是逆境条件下植物细胞膜系统遭到破坏，进而降低了植物细胞膜的选择透过性。根据图2得知，在0℃持续低温处理下，对照组的MDA含量随低温处理时间延长呈波浪形的变化规律，处理组的MDA含量变幅比较平缓，且显著低于对照。

脯氨酸（Pro）作为最关键的有机渗透调节物质，也是鉴定植物抗寒性的重要指标之一。大量研究表明，Pro含量的增加有利于增强植物的抗寒性。从图3可以看出，0℃低温处理下，Pro含量呈先增加后降低的趋势，对照组Pro含量在48h达到最大值，处理组Pro含量在24h达到最大值，36-72h之间Pro含量趋于平稳。从图4中可以看出，0℃低温处理下，对照组的MDA含量随低温处理时间延长呈波浪形的变化规律。整个处理过程中，处理组的MDA含量变幅比较平缓，且显著低于对照。

超氧化物歧化酶（SOD）是植物体内第一个清除活性氧（ROS）的重要抗氧性酶，其活性大小与植物抗逆性密切相关，抗寒性强的植物比抗寒性差的植物具有更强的抗氧化能力。从图4中可以看出，SOD酶活性都随低温持续时间延长呈先增后降再增再降的趋势，且均以处理组的SOD酶活性显著高于对照组，表明处理组抗氧化的能力更强。

综合所述，依据植物抗寒性强弱与低温下REC、MDA、Pro和SOD的关系，得出处理组的抗寒性强于对照组。

本发明的实施例2：步骤1）-4）同实施例1，筛选后成活的无菌幼苗进行4℃低温抗寒锻炼，在第7、14、19和24d随机取样初步的抗寒性分析鉴定，以未经EMS和HYP处理的无菌幼苗为对比，每处理3次重复。

其结果如图5-8所示。

从图5可以看出，无论是处理组还是对照组，REC均随低温锻炼时间的延长而显著增加，但同一锻炼时间下处理组的REC显著低于对照组。当抗寒锻炼7d后，对照组的REC已超过60%，而处理组的REC低于50%(为43.4%)。当抗寒锻炼至24d时，对照组的REC达到94.501%，材料基本全部冻坏，而处理组的REC为75.126%，部分材料茎段呈绿色。与对照相比，处理组的REC降低了17.1-29.7%，说明经EMS和HYP处理后，材料的抗寒性大大增强。

从图6中可以看出，在整个抗寒锻炼过程中，对照组和处理组材料中的MDA含量均随锻炼时间延长而增加。在0-7d之间，MDA含量的变化趋势平缓，说明受伤害程度较小，7-24d之间增加趋势显著，说明细胞膜伤害程度加剧。同一锻炼时间以处理组的MDA含量显著低于对照组。与对照相比，处理组的MDA降幅范围在12.2-39.1%，说明处理组材料受伤害的程度较对照降低，抗寒性较对照有所提高。

由图7可知，整个抗寒锻炼过程中，两组材料的Pro含量均呈先增加后降低的趋势，且在第14d后达到最大值。说明锻炼初期，细胞的渗透势提高有助于保护细胞膜免受低温伤害，在一定程度上提高了植物的抗寒性，但随低温锻炼时间延长，渗透调节物质含量逐渐下降，植物抵御低温伤害的能力减弱，而抗寒性较弱的材料Pro含量累积量则更低。由图中可以看出，整个过程处理组的Pro含量累积量更大，说明其抗寒性较对照大大提高。

图8中SOD酶活性随锻炼时间延长呈先增加后降低的趋势，对照组在第7d达到最大值，处理组在14d达到最大值。这表明短时间的低温锻炼，植株的抗寒性增强，而较长时间的低温锻炼，即使抗寒性较强的植物也会受到较大程度的伤害，导致抗氧化酶活性大大降低。但整个锻炼过程中，处理组SOD酶活性均显著高于对照组，说明其抗寒性较对照大大增强。

综合所述，通过抗寒生理初步检测，经EMS诱变处理，并通过HYP筛选后的火龙果无菌苗在同一低温不同处理时间下均表现出比对照更强的抗寒能力，这可能与诱变处理后植物细胞产生了一定的抗寒突变体有关。说明通过EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法是切实可靠的。

Claims (4)

1.一种EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）以从火龙果成熟茎段上培育的单个无菌苗为试材，将试材浸泡在体积浓度为3.71-3.95%的EMS处理液中，使试材与EMS处理液完全接触，处理期间经常摇动，使溶液与无菌苗均匀接触，处理时间为8.26-9.32小时；

2）在步骤1）的处理时间完毕后，用无菌水冲洗5次以上，去除毒性，吸干表面水份，将单株苗接种于继代培养基上恢复生长25-35d，促进其生长分化；

3）在步骤2）中将恢复生长后分化出的不定芽进行HYP逐步筛选，在最大耐受浓度为20mmol/L的HYP的培养基中培养筛选12-18d后，存活的芽继续接入含有20mmol/L的HYP的选择培养基中培养18-25d；再将存活的材料转入不含HYP的培养基中培养18-25d；

4）在步骤3）中最后存活的材料在0-4℃下进行低温诱导7-24d，从而增强火龙果的抗寒性。

2.根据权利要求1所述的EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，其特征在于：所述的HYP筛选采用多步筛选法，将EMS诱变处理后新增殖的不定芽依次转入含不同浓度的HYP选择培养基上培养15d，以未经EMS处理的芽作为对照；筛选出火龙果对HYP的最大耐受浓度20mmol/L，即为选择压。

3.根据权利要求1所述的EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，其特征在于：步骤2）中的继代培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.05%+CCC0.5mg/L。

4.根据权利要求3所述的EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，其特征在于：步骤3）中采用筛选培养基均为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.05%+CCC0.5mg/L+HYP20mmol/L；步骤3）中不含HYP的培养基即为步骤2）中的继代培养基。