CN105628836A - 三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法 - Google Patents

三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明的三孢布拉氏霉菌的样品前处理方法如下：利用PDA培养基培养三孢布拉氏霉菌，培养4d后收集菌丝，液氮灭活后超低温冰箱保存备用；冷冻研磨破碎菌丝样品，代谢组提取采用冷冻过的甲醇水混合物以使酶失活；真空冷冻干燥后，经过肟化或腙化、硅烷化两步衍生化反应后用于GC-MS检测。本发明还提供了利用GC-MS对上述样品的检测方法，检测条件如下：选用AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样量1μL；程序升温；离子源温度250℃，全扫描范围m/z50～800。采用本发明能得到重现性较好的代谢组检测结果。

Description

三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法
技术领域
本发明涉及代谢组学的技术领域，具体说是一种三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法。
背景技术
随着人类基因组测序工作完成，基因功能的研究成为热点，各种“组学”相继出现，代谢组学继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后应运而生。代谢物组学的研究对象是生物体内整体代谢物的变化，为了更加全面、系统地了解这种变化，代谢物分析方法应依据代谢物物理化学参数的差异，采用不同的分析方法，力求满足高选择性、高灵敏度、高通量、多维、动态、多参量的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括以下步骤：
（1）培养三孢布拉氏霉菌：
a、种子培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48-52h；
种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%，其余为水；
b、发酵培养：将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；
发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液 10%，其余为水；
（2）样品制备：
分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备；
A：利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为：-40℃预冷的60% v/v 乙醇水、2:2:1v/v 的氯仿：乙醇：水、60% v/v 沸乙醇、60% v/v 冷甲醇；
B:样品衍生化
取200 μL提取液加10 μL的1 mg/mL γ-氨基丁酸，真空冷冻干燥后，加50 μL浓度为20 mg/mL的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min；
加80μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀，置于40°C水浴中，反应80min；
将衍生后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2 h。
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测；
GC条件：AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度：280°C；升温程序：初始温度70°C保持2 min，以5°C/min程序升温至290°C保持5 min；载气：高纯氦气，恒压模式91 kPa；进样量1 μL；柱后分流比10:1；
MS条件：接口温度：280°C；电离方式：EI；电离方式：电子轰击电离（EI+）；离子源温度：250°C；电子轰击能量：70 eV；电子电流：40 μA；扫描质量范围：50-800 m/z。
本发明具有的优点和积极效果是:
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法中，利用PDA 培养基培养三孢布拉氏霉菌，培养4d后收集菌丝，液氮灭活后超低温冰箱保存备用；冷冻研磨破碎菌丝样品，代谢组提取采用冷冻过的甲醇水混合物以使酶失活；真空冷冻干燥后，经过肟化或腙化、硅烷化两步衍生化反应后用于 GC-MS检测。本发明还提供了利用 GC-MS 对上述样品的检测方法，检测条件如下：选用AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样量 1μL；程序升温 ；离子源温度 250℃，全扫描范围 m/z50 ～800。采用本发明能得到重现性较好的代谢组检测结果。
附图说明
图1是采用-40℃预冷的60%v/v乙醇水作为提取剂时的GC-MS TIC总离子流图；
图2是采用2:2:1v/v的氯仿：乙醇：水溶液作为提取剂时的GC-MS TIC总离子流图；
图3是采用60% v/v 沸乙醇作为提取剂时的GC-MS TIC总离子流图；
图4是采用60% v/v 冷甲醇作为提取剂时的GC-MS TIC总离子流图。
具体实施方式
以下通过附图和具体实施例对本发明中的技术方案进行详细说明：
实施例1：
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括以下步骤：
（1）培养三孢布拉氏霉菌：
a、种子培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48h；
种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%，其余为水；
b、发酵培养：将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；
发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液 10%，其余为水；
（2）样品制备：
分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备；
A：利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为：-40℃预冷的60% v/v 乙醇水；
B:样品衍生化
取200 μL提取液加10 μL的1 mg/mL γ-氨基丁酸，真空冷冻干燥后，加50 μL浓度为20 mg/mL的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min；
加80μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀，置于40°C水浴中，反应80min；
将衍生后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2 h。
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测；
GC条件：AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度：280°C；升温程序：初始温度70°C保持2 min，以5°C/min程序升温至290°C保持5 min；载气：高纯氦气，恒压模式91 kPa；进样量1 μL；柱后分流比10:1；
MS条件：接口温度：280°C；电离方式：EI；电离方式：电子轰击电离（EI+）；离子源温度：250°C；电子轰击能量：70 eV；电子电流：40 μA；扫描质量范围：50-800 m/z。
所得GC-MS TIC总离子流图如图1所示。
实施例2：
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括以下步骤：
（1）培养三孢布拉氏霉菌：
a、种子培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为52h；
种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%，其余为水；
b、发酵培养：将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；
发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液 10%，其余为水；
（2）样品制备：
分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备；
A：利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为：2:2:1 v/v的氯仿：乙醇：水；
B:样品衍生化
取200 μL提取液加10 μL的1 mg/mL γ-氨基丁酸，真空冷冻干燥后，加50 μL浓度为20 mg/mL的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min；
加80μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀，置于40°C水浴中，反应80min；
将衍生后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2 h。
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测；
GC条件：AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度：280°C；升温程序：初始温度70°C保持2 min，以5°C/min程序升温至290°C保持5 min；载气：高纯氦气，恒压模式91 kPa；进样量1 μL；柱后分流比10:1；
MS条件：接口温度：280°C；电离方式：EI；电离方式：电子轰击电离（EI+）；离子源温度：250°C；电子轰击能量：70 eV；电子电流：40 μA；扫描质量范围：50-800 m/z。
所得GC-MS TIC总离子流图如图2所示。
实施例3：
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括以下步骤：
（1）培养三孢布拉氏霉菌：
a、种子培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为50h；
种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%，其余为水；
b、发酵培养：将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；
发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液 10%，其余为水；
（2）样品制备：
分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备；
A：利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为：60% v/v 沸乙醇；
B:样品衍生化
取200 μL提取液加10 μL的1 mg/mL γ-氨基丁酸，真空冷冻干燥后，加50 μL浓度为20 mg/mL的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min；
加80μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀，置于40°C水浴中，反应80min；
将衍生后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2 h。
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测；
GC条件：AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度：280°C；升温程序：初始温度70°C保持2 min，以5°C/min程序升温至290°C保持5 min；载气：高纯氦气，恒压模式91 kPa；进样量1 μL；柱后分流比10:1；
MS条件：接口温度：280°C；电离方式：EI；电离方式：电子轰击电离（EI+）；离子源温度：250°C；电子轰击能量：70 eV；电子电流：40 μA；扫描质量范围：50-800 m/z。
所得GC-MS TIC总离子流图如图3所示。
实施例4：
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括以下步骤：
（1）培养三孢布拉氏霉菌：
a、种子培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为49h；
种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%，其余为水；
b、发酵培养：将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；
发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液 10%，其余为水；
（2）样品制备：
分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备；
A：利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为：60% v/v 冷甲醇；
B:样品衍生化
取200 μL提取液加10 μL的1 mg/mL γ-氨基丁酸，真空冷冻干燥后，加50 μL浓度为20 mg/mL的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min；
加80μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀，置于40°C水浴中，反应80min；
将衍生后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2 h。
本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测；
GC条件：AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度：280°C；升温程序：初始温度70°C保持2 min，以5°C/min程序升温至290°C保持5 min；载气：高纯氦气，恒压模式91 kPa；进样量1 μL；柱后分流比10:1；
MS条件：接口温度：280°C；电离方式：EI；电离方式：电子轰击电离（EI+）；离子源温度：250°C；电子轰击能量：70 eV；电子电流：40 μA；扫描质量范围：50-800 m/z。
所得GC-MS TIC总离子流图如图4所示。
结合不同抽提溶剂的的GC-MS总离子流图TIC，可以得出结论：当利用2:2:1V/V的氯仿：乙醇：水溶液和60%沸乙醇作为抽提溶剂时，最后检测出的代谢物数量与TIC图效果都不是很理想，同时60%沸乙醇作为抽提溶剂时，代谢物数量相对也不是很多；考虑到气质样品制备时淬灭细胞使用的是甲醇溶液，为了减少引入其他有机溶剂，最后综合考虑选择60%冷甲醇。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括以下步骤：
（1）培养三孢布拉氏霉菌：
a、种子培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48-52h；
种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%，其余为水；
b、发酵培养：将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；
发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通0.1%、BHT 0.05%、混菌发酵液 10%，其余为水；
（2）样品制备：
分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备；
A：利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为：-40℃预冷的60%v/v乙醇水、2:2:1v/v的氯仿：乙醇：水、60%v/v沸乙醇、60%v/v冷甲醇；
B:样品衍生化
取200 μL提取液加10 μL的1 mg/mL γ-氨基丁酸，真空冷冻干燥后，加50 μL浓度为20 mg/mL的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80 min；
加80μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀，置于40°C水浴中，反应80min；
将衍生后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2 h。
2.一种权利要求1所述三孢布拉氏霉菌代谢组经样品前处理后的检测方法，其特征在于：对样品进行GC-MS检测；
GC条件：AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度：280°C；升温程序：初始温度70°C保持2 min，以5°C/min程序升温至290°C保持5 min；载气：高纯氦气，恒压模式91 kPa；进样量1 μL；柱后分流比10:1；
MS条件：接口温度：280°C；电离方式：EI；电离方式：电子轰击电离EI+；离子源温度：250°C；电子轰击能量：70 eV；电子电流：40 μA；扫描质量范围：50-800 m/z。
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