CN105624306A - 一种检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法 - Google Patents

一种检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，利用基因组测序和核内复制回交相结合，快速确认重复大片段基因组DNA所在染色体位置。本发明所述核内复制回交方法可高效、快速检测酿酒酵母染色体大片段重复基因组DNA所在染色体位置，并进行修复，删除大片段重复基因组DNA，无需精确确认大片段重复位点所在位置，无需对待检测酿酒酵母进行繁琐的实验数据分析工作，操作简单，实验周期短。

Description

一种检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，又称面包酵母或出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酵母细胞自身具备高效的同源重组特性(Ma,H.,etal.Gene(1987),58,201-216)，因而被广泛的应用于质粒构建、基因敲除乃至基因组构建的研究当中(Gibson,D.G.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(2008).105,20404-20409)。人工合成酿酒酵母基因组项目(Sc2.0)的研究人员通过将大量长约3kb的DNA片段转化进入到酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母自身的同源重组特性将野生型染色体逐步替换为一条全新的人工设计的染色体(Annaluru,N.,etal.Science(2014)344,55-58)。
酿酒酵母高效的同源重组特性为DNA片段的整合提供了便利，同时也有可能导致外源DNA片段的重复整合形成多拷贝DNA，甚至错误整合至非目标位点，从而使得酵母菌株的生长状况变差，影响相关研究。基因敲除为解决外源DNA片段错误整合的传统方法，即首先将营养标记表达盒整合至待目标位点来敲除错误整合的DNA片段，然后再利用正确的DNA片段敲除营养标记表达盒进而修复DNA多拷贝问题。但是，该方法需要精确确认待修复位点所在位置，实验数据分析工作非常繁琐；而在实际研究工作当中，往往并没有必要确认错误整合发生的精确位置。因此，快速检测高拷贝DNA发生位置并进行修复将为酵母基因操作提供便利条件。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的问题提供一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，包括：
步骤A、对待测酿酒酵母菌株进行基因组测序；
步骤B、在待测酿酒酵母菌株相反交配型的野生型酵母菌株对应染色体着丝粒处添加半乳糖启动子；
步骤C、利用核内复制回交(endoreduplicationbackcross)获得全新的单倍体酵母菌株；
步骤D、对步骤C获得全新的单倍体酵母菌株进行基因组测序，与待测酿酒酵母菌株的基因组测序结果比较，确定大片段重复的位置。
其中，本发明所述检测方法中步骤C具体包括以下步骤：
1)将待测酿酒酵母菌株与所述添加半乳糖启动子的野生型酵母菌株进行融合，获得二倍体酵母菌株；
2)半乳糖诱导二倍体菌株中GAL1启动子表达，获得只携带源染色体的二倍体酿酒酵母菌株；
3)对步骤2)获得酿酒酵母菌株进行生孢实验并进行孢子拆分。
在一些实施方案中，本发明所述快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，分析比较结果，全新的单倍体酵母菌株的基因组测序结果中存在大片段重复DNA，大片段重复存在于待测酿酒酵母菌株染色体上。
在一些实施方案中，本发明所述快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，分析比较结果，全新的单倍体酵母菌株的基因组测序结果中不存在大片段重复DNA，大片段重复存在于待测酿酒酵母菌株染色体以外的染色体上。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，利用基因组测序和核内复制回交相结合，快速确认重复大片段基因组DNA所在染色体位置。本发明所述核内复制回交方法可高效、快速检测酿酒酵母染色体大片段重复基因组DNA所在染色体位置，并进行修复，删除大片段重复基因组DNA，无需精确确认大片段重复位点所在位置，无需对待检测酿酒酵母进行繁琐的实验数据分析工作，操作简单，实验周期短。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1酿酒酵母中存在重复大片段基因组DNA的染色体基因组测序结果图；
图2示本发明所述快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，包括：
步骤A、对待测酿酒酵母菌株进行基因组测序；
步骤B、在待测酿酒酵母菌株相反交配型的野生型酵母菌株对应染色体着丝粒处添加半乳糖启动子；
步骤C、利用核内复制回交(endoreduplicationbackcross)获得全新的单倍体酵母菌株；
步骤D、对步骤C获得全新的单倍体酵母菌株进行基因组测序，与待测酿酒酵母菌株的基因组测序结果比较，确定大片段重复的位置。
本发明所述快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法利用基因组测序和核内复制回交相结合，快速确认重复大片段基因组DNA所在染色体位置，具体如图2所示。
本发明所述检测方法步骤A利用基因组测序揭示待测酿酒酵母菌株中存在重复大片段基因组DNA，而重复的DNA片段可能存在于测序的染色体上，也有可能存在于其他染色体上；命名待测酿酒酵母菌株染色体为“源染色体”，待测酿酒酵母菌株为“源菌株”。
本发明所述检测方法步骤B根据文献报道方法(Reid,R.J.,etal.Genetics(2008),180,1799-1808)在相反交配型的野生型酵母菌株对应染色体着丝粒处添加半乳糖启动子(pGAL1)。命名上述野生型酵母菌株染色体为“野生型染色体”，该菌株为“野生型菌株”。其中，所述添加半乳糖启动子的方法具体为利用酵母同源重组的特性在待测酿酒酵母菌株相反交配型的野生型酵母菌株对应染色体的着丝粒前添加半乳糖启动子(GAL1)和Kl.URA3营养筛选标记。
本发明所述检测方法步骤C利用核内复制回交(endoreduplicationbackcross)获得全新的单倍体酵母菌株。
其中，本发明所述检测方法中步骤C具体包括以下步骤：
1)将待测酿酒酵母菌株与所述添加半乳糖启动子的野生型酵母菌株进行融合，获得二倍体酵母菌株；
2)半乳糖诱导二倍体菌株中GAL1启动子表达，获得只携带源染色体的二倍体酿酒酵母菌株；
3)对步骤2)获得酿酒酵母菌株进行生孢实验并进行孢子拆分。
进一步的，步骤1)所述融合的具体为挑取待测单倍体酿酒酵母菌株和添加半乳糖启动子的具有相反交配型的单倍体酿酒酵母菌株单菌落于无菌水中进行混合，然后滴于YPD培养平板上过夜培养，SC-Lys-Met营养缺陷型培养平板筛选二倍体菌株，挑取单菌落验证。
所述待测单倍体酿酒酵母菌株和具有相反交配型的单倍体酿酒酵母菌株会自发融合为二倍体酵母菌株(MATa/α)。利用SC-Lys-Met营养缺陷型培养平板筛选二倍体菌株，挑取单菌落并利用文献(Huxley,C.,etal.TrendsGenet(1990),6,236.)报道方法进行二次验证，确认为二倍体酿酒酵母菌株。
其中，所述YPD培养平板的配方为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。
所述SC-Lys-Met营养缺陷型培养平板的配方为合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺省赖氨酸和蛋氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，琼脂粉20g/L。
本发明所述检测方法中步骤2)利用半乳糖诱导二倍体菌株中GAL1启动子表达，从而使野生型染色体(wtV)丢失，获得只携带源染色体(synV)的二倍体酿酒酵母菌株，从而避免了在酿酒酵母产生孢子的过程中源染色体和野生型染色体之间发生的姐妹染色单体交叉互换。
其中，所述诱导二倍体菌株中GAL1启动子的表达根据文献方法进行具体操作(Reid,R.J.,etal.Genetics(2008),180,1799-1808)。
本发明所述检测方法中步骤3)对上述只携带源染色体的二倍体酿酒酵母菌株进行生孢实验并进行孢子拆分。由于该二倍体细胞中只携带源染色体，故最终得到的单倍体菌株必携带源染色体而不会携带野生型染色体。由于生孢过程中染色体的随机分配，源染色体之外的其余15条染色体则有可能来源于源菌株或者野生型菌株。
其中，所述生孢实验根据文献报道方法进行操作(Hou,L..ApplBiochemBiotechnol(2010),160,1084-93.)。所述孢子拆分的具体为利用酵母显微操作仪进行酿酒酵母孢子的拆分。
在一些实施方案中，本发明所述快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，分析比较结果，全新的单倍体酵母菌株的基因组测序结果中存在大片段重复DNA，大片段重复存在于待测酿酒酵母菌株染色体上。
在一些实施方案中，本发明所述快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，分析比较结果，全新的单倍体酵母菌株的基因组测序结果中不存在大片段重复DNA，大片段重复存在于待测酿酒酵母菌株染色体以外的染色体上。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，利用基因组测序和核内复制回交相结合，快速确认重复大片段基因组DNA所在染色体位置。本发明所述核内复制回交方法可高效、快速检测酿酒酵母染色体大片段重复基因组DNA所在染色体位置，并进行修复，删除大片段重复基因组DNA，无需精确确认大片段重复位点所在位置，无需对待检测酿酒酵母进行繁琐的实验数据分析工作，操作简单，实验周期短。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
实施例1
一、培养基配制
SC-Lys-Met营养缺陷型培养平板配方为合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺省赖氨酸和蛋氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，琼脂粉20g/L。
YPD液体培养基配方为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
SC+5-FOA培养基配方为合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L，5-氟乳清酸1g/L，琼脂粉20g/L。
二、实验方法
1、对待测酿酒酵母进行全基因组测序，结果如图1，显示V号染色体存在一个小片段重复区域(多拷贝DNA1)和两个大片段重复区域(多拷贝DNA2)，命名该染色体为“源V号染色体(synV)”。
2、利用文献报道方法(Reid,R.J.,etal.Genetics(2008),180,1799-1808)向BY4742菌株的V号染色体着丝粒添加GAL1启动子和Kl.URA3营养筛选标记，命名该染色体为“野生型V号染色体(wtV)”。
2.1挑取携带“源V号染色体(synV)”的待检测酿酒酵母菌株和携带“野生型V号染色体(wtV)”的酿酒酵母菌株单菌落于30μL无菌水中进行混合，然后在滴于YPD培养平板上过夜培养，利用SC-Lys-Met营养缺陷型培养平板筛选二倍体菌株，培养平板上生长的菌株即为二倍体酿酒酵母菌株。挑取单菌落并利用文献(Huxley,C.,etal.TrendsGenet(1990),6,236.)报道方法进行二次验证，确认为二倍体酿酒酵母菌株。
2.2挑选二倍体酿酒酵母菌株单菌落于5mLYPD液体培养基中进行过夜培养，然后根据文献(Reid,R.J.,etal.Genetics(2008),180,1799-1808)报道方法，使用半乳糖(Galactose)诱导二倍体菌株中的GAL1启动子表达，丢失野生型V号染色体。
2.3吸取10μL半乳糖诱导后的二倍体菌株的菌液涂布于YPD平板上，12小时后翻印至SC+5-FOA培养平板，30℃培养2天。
2.4挑取SC+5-FOA平板上的单菌落在SC+5-FOA划线分纯，确认生长的酵母菌株即为野生型V号染色体(wtV)的丢失的二倍体酿酒酵母菌株。
2.5对确认丢失wtV的二倍体菌株进行生孢，5天后利用随机拆孢的方法进行孢子拆分(Hou,L.,Biotechnologyletters(2009)31,671)，涂平板于YPD+6％乙醇固体培养板上，37℃培养3天。
2.6挑取菌株进行划线纯化，提取基因组进行基因组测序。
3、基因组测序结果新得到的菌株中未显示大片段重复DNA(图1，“多拷贝DNA2”)的存在，说明该重复区域在于V号染色体之外的染色体上；而小片段重复DNA(图1，“多拷贝DNA1”)仍然存在，说明该重复区域存在于V号染色体上(图2)。

Claims (6)

1.一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，其特征在于，包括：
步骤A、对待测酿酒酵母菌株进行基因组测序；
步骤B、在待测酿酒酵母菌株相反交配型的野生型酵母菌株对应染色体着丝粒处添加半乳糖启动子；
步骤C、利用核内复制回交(endoreduplicationbackcross)获得全新的单倍体酵母菌株；
步骤D、对步骤C获得全新的单倍体酵母菌株进行基因组测序，与待测酿酒酵母菌株的基因组测序结果比较，确定大片段重复的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C具体包括以下步骤：
1)将待测酿酒酵母菌株与所述添加半乳糖启动子的野生型酵母菌株进行融合，获得二倍体酵母菌株；
2)半乳糖诱导二倍体菌株中GAL1启动子表达，获得只携带源染色体的二倍体酿酒酵母菌株；
3)对步骤2)获得酿酒酵母菌株进行生孢实验并进行孢子拆分。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，分析比较结果，若全新的单倍体酵母菌株的基因组测序结果中存在大片段重复DNA，则大片段重复存在于待测酿酒酵母菌株染色体上。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，分析比较结果，若全新的单倍体酵母菌株的基因组测序结果中不存在大片段重复DNA，则大片段重复存在于待测酿酒酵母菌株染色体以外的染色体上。
5.根据权利要求2-4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤1)所述融合的具体为挑取待测单倍体酿酒酵母菌株和添加半乳糖启动子的具有相反交配型的单倍体酿酒酵母菌株单菌落于无菌水中进行混合，然后滴于YPD培养平板上过夜培养，营养缺陷型培养平板筛选二倍体菌株，挑取单菌落验证。
6.根据权利要求2-5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3)所述孢子拆分的具体为利用酵母显微操作仪进行酿酒酵母孢子的拆分。
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