CN105624236A - 一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法及其应用 - Google Patents

一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法，包括以下步骤：步骤一、琼胶酶粗酶液的制备；步骤二、江蓠除杂：将江蓠清洗除杂，烘干，80℃的水浴中加热2h；步骤三、升温灭菌：对加热处理后的江蓠进行升温至121℃，灭菌20min；步骤四、挤胶：将江蓠趁热挤胶，用滤布包裹江蓠，挤压，收集挤胶滤出的多糖溶液，冷却、烘干、粉碎成颗粒装袋备用，即得江蓠粗多糖；步骤五、酶处理：加入所述琼胶酶粗酶液处理；以制备寡糖溶液；步骤六、干燥：寡糖溶液进行冷冻干燥，或真空干燥成固体粉末，制得琼胶寡糖。本发明可以用于乳酸菌发酵企业及乳制品生产企业，以生产高活性乳酸菌制品以及高耐藏性的乳制品。

Description

一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及食品加工的技术领域，尤其涉及一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法及其应用。
背景技术
江蓠(Gracilaria)是多年生的大型红藻,属于红藻门,是我国广东、浙江、台湾沿海藻类养殖品种之一，主要作为渔业养殖饲料和生产食品胶原料。江蓠菜琼胶寡糖是一种非消化性低聚糖，对嗜热链球菌的生长具有明显促进作用，并且具有抑制病原菌、腐败菌等有害菌的生长，能提高人体免疫力，改善内分泌系统，促进营养物质的吸收，对人体亚健康状态进行改善，对抗生素、激素、细胞毒性药物等所致的菌群失调所引起的肠炎、腹泻、便秘以及药物的副作用进行治疗，具有延年益寿的作用。因此江蓠菜琼胶寡糖是一种新型保健品以及食品添加剂或饲料添加剂。
目前，在现有技术中还未有江蓠菜琼胶寡糖对益生菌的促进效果的报导，国内外主要研究寡糖的抗病毒、抗炎症、抗癌症等作用。工业生产益生菌发酵产品，往往出现产品益生菌数量不达标的问题。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法及其应用，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法及其应用，利用江蓠菜琼胶寡糖作为嗜热链球菌的碳源，提高发酵效率，减少工厂发酵时间,促进嗜热链球菌生长。
为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法，包括以下步骤：
步骤一、琼胶酶粗酶液的制备：将嗜热链球菌菌株(Vibriosp.NTi)接种于产琼胶酶液体培养基中，活化温度为25℃，180r/min培养12h，以2％接种量转接至发酵培养基，培养温度25℃，180r/min培养24h，对发酵液在4℃下8000r/min条件下离心30min，取上清液，即得琼胶酶粗酶液，所述琼胶酶粗酶液酶活≥200U/mL；
步骤二、江蓠除杂：将江蓠清洗除杂，烘干，加入江蓠重量30倍的水使江蓠充分溶胀，然后置于80℃的水浴中加热2h；
步骤三、升温灭菌：对加热处理后的江蓠进行升温至121℃，灭菌时间为20min；
步骤四、挤胶：将江蓠趁热挤胶，用滤布包裹江蓠，并利用压力机对装有江蓠的滤布进行挤压，收集挤胶滤出的多糖溶液；将收集的多糖溶液进行冷却、烘干、粉碎成颗粒装袋备用，放置在阴凉干燥处保存，即得江蓠粗多糖；
步骤五、酶处理：将冷却的粗多糖溶解水中，制成浓度为5g/L的多糖溶液，加入所述琼胶酶粗酶液处理；加酶量为15％(v/v)，酶活为200U/mL；酶解20-1280min，以制备寡糖溶液；
步骤六、干燥：寡糖溶液进行冷冻干燥，或真空干燥成固体粉末，制得琼胶寡糖。
作为实施例的优选方式，所述步骤一中，所述产琼胶酶液体培养基成分为：琼脂3g/L、酵母膏6g/L、NaCl20g/L、MgSO4·7H2O5g/L、KCl1g/L、CaCl20.2g/L、K2HPO40.1g/L、FeSO4·7H2O0.02g/L。
作为实施例的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为20min，制得聚合度为8的琼胶寡糖。
作为实施例的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为80min，制得聚合度为5的琼胶寡糖。
作为实施例的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为1280min，制得聚合度为3的琼胶寡糖。
一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖的应用，用于贮藏嗜热链球菌：将嗜热链球菌按接种量2％，添加至含聚合度3-8和浓度为1-10g/L的琼胶寡糖的培养基中，置于42℃，无氧条件下，静置培养2-3天，并每隔一段时间测定活菌数。
采用本发明的技术方案后，具有以下有益效果：
1.本发明利用江蓠菜琼胶寡糖作为嗜热链球菌的生长碳源有效的解决了嗜热链球菌生长周期长、菌量数不高的问题。
2.本发明所使用的江蓠菜琼胶寡糖不会产生任何污染成分，更不会污染环境。本方法在实际生产中投资少见效快，适合推广应用。
3.采用高压灭菌加热处理，可以有效的对江蓠菜进行加热处理，减少水浴加热时间，减少热能损耗，相应国家节能减排的号召。
附图说明
图1为本发明不同聚合度江蓠菜琼胶寡糖薄层色谱图；
图2为本发明不同寡糖促嗜热链球菌的生长曲线图；
图3为本发明不同聚合度江蓠琼胶寡糖促嗜热链球菌的生长曲线图；
图4为本发明不同浓度的江蓠琼胶寡糖(DP3)促嗜热链球菌的生长曲线图。
具体实施方式
酶活的测定方法：(1)绘制葡萄糖标准曲线；(2)取250μL处理后的上清液，添加500μL溶于50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.0)的0.5％的琼脂(高温溶解后保温于40℃水浴中)，40℃温浴30min，加500μLDNS终止反应，沸水浴5min后冷却，稀释到5mL，测520nm处的吸光值，然后依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量，以检测发酵液中琼胶酶的活力。以沸水浴灭活5min的酶液作为对照。以上述条件下每分钟催化产生1μg还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
空白对照组：制备MRS培养基，所述MRS培养基包括以下组分：胰蛋白胨20.0g，酵母浸出粉5.0g,明胶2.5g，葡萄糖1g/L至10g/L，蔗糖5.0g，乳糖5g，乙酸钠1.5g，氯化钠4.0g，抗坏血酸0.5g，吐温801.0g，蒸馏水1L。调酸度至pH6.8。接种嗜热链球菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％。无氧环境下，42℃，静置培养2-3天。
江蓠菜琼胶寡糖组：制备江蓠菜琼胶寡糖，将琼胶寡糖代替MRS培养基中的葡萄糖，并利用不同聚合度的寡糖(DP3、DP5、DP8)和不同浓度寡糖(1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、10g/L)来对嗜热链球菌进行培养。接种嗜热链球菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％。无氧环境下，42℃，静置培养2-3天。
实施例1：一种嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法
一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法，包括以下步骤：
步骤一、琼胶酶粗酶液的制备：将嗜热链球菌菌株(Vibriosp.NTi)接种于产琼胶酶液体培养基中，活化温度为25℃，180r/min培养12h，以2％接种量转接至发酵培养基，培养温度25℃，180r/min培养24h，对发酵液在4℃下8000r/min条件下离心30min，取上清液，即得琼胶酶粗酶液，所述琼胶酶粗酶液酶活≥200U/mL；
步骤二、江蓠除杂：将江蓠清洗除杂，烘干，加入江蓠重量30倍的水使江蓠充分溶胀，然后置于80℃的水浴中加热2h；
步骤三、升温灭菌：对加热处理后的江蓠进行升温至121℃，灭菌时间为20min；
步骤四、挤胶：将江蓠趁热挤胶，用滤布包裹江蓠，并利用压力机对装有江蓠的滤布进行挤压，收集挤胶滤出的多糖溶液；将收集的多糖溶液进行冷却、烘干、粉碎成颗粒装袋备用，放置在阴凉干燥处保存，即得江蓠粗多糖；
步骤五、酶处理：将冷却的粗多糖溶解水中，制成浓度为5g/L的多糖溶液，加入所述琼胶酶粗酶液处理；加酶量为15％(v/v)，酶活为200U/mL；酶解20-1280min，以制备寡糖溶液；
步骤六、干燥：寡糖溶液进行冷冻干燥，或真空干燥成固体粉末，制得琼胶寡糖。
作为实施例的优选方式，所述步骤一中，所述产琼胶酶液体培养基成分为：琼脂3g/L、酵母膏6g/L、NaCl20g/L、MgSO4·7H2O5g/L、KCl1g/L、CaCl20.2g/L、K2HPO40.1g/L、FeSO4·7H2O0.02g/L。
作为实施例的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为20min，制得聚合度为8的琼胶寡糖。
作为实施例的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为80min，制得聚合度为5的琼胶寡糖。
作为实施例的优选方式，所述步骤四中，酶解时间为1280min，制得聚合度为3的琼胶寡糖。
实施例2：制备不同聚合度寡糖的工艺流程
利用琼胶酶菌株发酵制备的粗酶液添加至以50mmol/LTris-HCl为缓冲液(pH7.0)的江蓠多糖溶液中，江蓠菜琼胶多糖溶液浓度为5g/L，粗酶液添加量为15％。酶解产物如图1所示。通过薄层色谱定性试验显示酶解江蓠菜琼胶多糖20min时琼胶寡糖聚合度为8，80min时聚合度为5，1280min时聚合度为3。
实施例3：不同寡糖促嗜热链球菌生长方法的工艺流程
利用以上制备寡糖方法制备出不同寡糖，配制培养基，分别配制嗜热链球菌培养基、江蓠菜琼胶寡糖按照同浓度替代嗜热链球菌中的葡萄糖培养基、琼寡糖按照同浓度替代嗜热链球菌中的葡萄糖培养基。接种嗜热链球菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％，培养条件为无氧环境下，42℃，静置培养2-3天，绘制嗜热链球菌生长曲线，如图2所示。结果显示江蓠菜琼胶寡糖对嗜热链球菌促生长效果要优于琼寡糖以及葡萄糖，在发酵48h时OD600值达到最大，说明48h是最优发酵时间。
实施例4：不同聚合度江蓠琼胶寡糖促嗜热链球菌生长方法的工艺流程
利用以上制备寡糖方法制备出不同聚合度的江蓠菜琼胶寡糖，配制培养基，分别配制嗜热链球菌培养基、江蓠菜琼胶寡糖(DP3)按照同浓度替代嗜热链球菌中的葡萄糖培养基、江蓠菜琼胶寡糖(DP5)按照同浓度替代嗜热链球菌中的葡萄糖培养基、江蓠菜琼胶寡糖(DP8)按照同浓度替代嗜热链球菌中的葡萄糖培养基。接种嗜热链球菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％，培养条件为无氧环境下，42℃，静置培养2-3天，绘制嗜热链球菌生长曲线，如图3所示。结果显示，聚合度3-8的江蓠菜琼胶寡糖对嗜热链球菌具有明显的促生长作用，促嗜热链球菌效果最好的聚合度为3。
实施例5：不同浓度的江蓠琼胶寡糖(DP3)促嗜热链球菌生长方法的工艺流程
利用以上制备寡糖方法制备出江蓠菜琼胶寡糖(DP3)，配制培养基，分别配制嗜热链球菌培养基、江蓠菜琼胶寡糖(DP3)替代嗜热链球菌中的葡萄糖培养基并配制浓度为1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、10g/L、20g/L的培养基。接种嗜热链球菌OD600值为0.8的菌液，接种量为2％，培养条件为无氧环境下，42℃，静置培养1-2天，绘制嗜热链球菌生长曲线，如图4所示。结果表明，浓度1g/L-10g/L的江蓠菜琼胶寡糖对嗜热链球菌的生长具有促进作用，促生长最优浓度为3g/L。
结果表明，提高消化道耐受性能力中最优寡糖添加量是聚合度为3和浓度为5g/L。
通过上述实验可知，本发明制备的江蓠菜琼胶寡糖对嗜热链球菌具有明显的促生长作用，并且确定以底物浓度为5g/L的江蓠菜琼胶寡糖(DP3)，在无氧环境下，42℃，静置培养32h时OD600值最大，为嗜热链球菌发酵最优条件。本发明利用江蓠菜琼胶寡糖对益生菌培养成分进行添加或替换，使嗜热链球菌在单位时间内OD600值高于嗜热链球菌培养基的培养。本发明能提高嗜热链球菌的生长速度，增加单位时间内的嗜热链球菌的数量，从而提高产品的益生菌数量。本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、琼胶酶粗酶液的制备：将嗜热链球菌菌株(Vibriosp.NTi)接种于产琼胶酶液体培养基中，活化温度为25℃，180r/min培养12h，以2％接种量转接至发酵培养基，培养温度25℃，180r/min培养24h，对发酵液在4℃下8000r/min条件下离心30min，取上清液，即得琼胶酶粗酶液，所述琼胶酶粗酶液酶活≥200U/mL；
步骤二、江蓠除杂：将江蓠清洗除杂，烘干，加入江蓠重量30倍的水使江蓠充分溶胀，然后置于80℃的水浴中加热2h；
步骤三、升温灭菌：对加热处理后的江蓠进行升温至121℃，灭菌时间为20min；
步骤四、挤胶：将江蓠趁热挤胶，用滤布包裹江蓠，并利用压力机对装有江蓠的滤布进行挤压，收集挤胶滤出的多糖溶液；将收集的多糖溶液进行冷却、烘干、粉碎成颗粒装袋备用，放置在阴凉干燥处保存，即得江蓠粗多糖；
步骤五、酶处理：将冷却的粗多糖溶解水中，制成浓度为5g/L的多糖溶液，加入所述琼胶酶粗酶液处理；加酶量为15％(v/v)，酶活为200U/mL；酶解20-1280min，以制备寡糖溶液；
步骤六、干燥：寡糖溶液进行冷冻干燥，或真空干燥成固体粉末，制得琼胶寡糖。
2.如权利要求1所述的一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法，其特征在于：所述步骤一中，所述产琼胶酶液体培养基成分为：琼脂3g/L、酵母膏6g/L、NaCl20g/L、MgSO4·7H2O5g/L、KCl1g/L、CaCl20.2g/L、K2HPO40.1g/L、FeSO4·7H2O0.02g/L。
3.如权利要求1所述的一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法，其特征在于：所述步骤四中，酶解时间为20min，制得聚合度为8的琼胶寡糖。
4.如权利要求1所述的一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法，其特征在于：所述步骤四中，酶解时间为80min，制得聚合度为5的琼胶寡糖。
5.如权利要求1所述的一种促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖制备方法，其特征在于：所述步骤四中，酶解时间为1280min，制得聚合度为3的琼胶寡糖。
6.一种如权利要求1所述的促嗜热链球菌生长的江蓠菜琼胶寡糖的应用，其特征在于：用于贮藏嗜热链球菌：将嗜热链球菌按接种量2％，添加至含聚合度3-8和浓度为1-10g/L的琼胶寡糖的培养基中，置于42℃，无氧条件下，静置培养2-3天，并每隔一段时间测定活菌数。
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Denomination of invention: A preparation method of agar oligosaccharide from Gracilaria to promote the growth of Streptococcus thermophilus and its application

Effective date of registration: 20210729

Granted publication date: 20190115

Pledgee: Bank of Xiamen Limited by Share Ltd. Zhangzhou branch

Pledgor: FUJIAN PROVINCE LVQI FOOD COLLOID Co.,Ltd.

Registration number: Y2021350000082

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Effective date of registration: 20220804

Address after: 363107 neiding Industrial Park, jiaomei Town, Taiwan investment zone, Zhangzhou City, Fujian Province

Patentee after: FUJIAN PROVINCE LVQI FOOD COLLOID Co.,Ltd.

Address before: 363107 neiding Industrial Park, jiaomei Town, Taiwan investment zone, Zhangzhou City, Fujian Province

Patentee before: FUJIAN PROVINCE LVQI FOOD COLLOID Co.,Ltd.

Patentee before: JIMEI University

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