CN105612179A - 单克隆olfml-3抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供针对Olfml-3的单克隆抗体。在一些方面，提供用于治疗血管生成相关病状，诸如癌症的方法，其包括施用实施方案的Olfml-3结合抗体。

Description

单克隆OLFML-3抗体及其用途
本申请要求2013年10月09日提交的美国临时专利申请号61/888,759和2014年6月30日提交的美国临时专利申请号62/018,906的权益，所述美国临时专利申请各自以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
包含于名为“CLFR.P0410WO_ST25.txt”的文件中，为11KB(如Microsoft中所测量)，并且于2014年10月8日创建的序列表通过电子提交同此提交，并且以引用的方式并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明大体上涉及肿瘤学的领域。更具体来说，它涉及针对Olfml-3的单克隆抗体和它们用于治疗血管生成相关病状的方法。
2.相关技术的描述
血管生成是新血管结构从先前存在的血管进行毛细血管萌芽和形成的多步细胞过程。所述复杂过程涉及内皮连接的拆解，继之以内皮细胞脱离、增殖和迁移以及随后再建立细胞间和细胞-基质接触。因此，它要求源于内皮细胞自身或相邻壁细胞的多种血管细胞粘附分子和生长因子的协调作用。实际上，血管生成是一种由促血管生成因子和抗血管生成因子调控的严密调谐过程(Folkman，1995)。
众多研究已证明过度血管生成会显著影响各种疾病状态，包括肿瘤生长、缺血性心血管病变或慢性炎性疾病(Carmeliet，2003；Carmeliet，2005；Gariano和Gardner，2005)。
就血管介导的病变来说，肿瘤相关的血管生成被最广泛地研究。首先假定的是在不存在新血管形成下，肿瘤不能生长超过2-3mm3的尺寸(Folkman，1971)。因此，血管生成是肿瘤生长的先决条件，并且阻断这个过程可阻止肿瘤细胞进一步增殖。此外，预防血管生成是靶向正常组织，而并非避开如对肿瘤细胞所见的诱变疗法。因此预期抗血管生成疗法在保持肿瘤生长受控方面比直接处理肿瘤细胞的任何其它治疗都会更好得以维持。尽管存在血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和其它促血管生成分子为血管形成所必不可少的事实(Hanahan，1997；Yancopoulos等，2000)，但对支配肿瘤相关的血管生成的完整分子和细胞机理的了解不充分。
此外，在发达国家，眼中因血管渗漏和/或新血管形成而复杂化的疾病导致绝大多数的视觉病态和失明。视网膜新血管形成发生在诸如糖尿病性视网膜病的缺血性视网膜病变中，并且是工作年龄患者的视觉损失的主要病因(Klein等，1984)。脉络膜新血管形成以年龄相关的黄斑变性的并发症的形式发生，并且是年长患者的视觉损失的主要病因(Ferris等，1984)。需要改进的治疗来降低视觉损失的高速率，并且它们的开发有可能通过更充分了解眼部新血管形成的分子发病机理来促进。
在临床试验中，抗血管生成药物的有益作用迄今为止以针对VEGF的抗体在结肠癌和乳腺癌的情形下达到。然而，在可涉及替代性因子的其它肿瘤的情况下，取得的成功较小。因此，血管生成中涉及的其它分子应被鉴定，并且单独或与生长因子组合使用。靶向由血管生成内皮细胞表达和/或分泌的新的血管分子代表另一途径。
发明概述
根据本公开的某些方面，提供结合Olfml-3，并且抑制血管生成中Olfml-3的活性的单克隆抗体或其片段。因此，在一些实施方案中，提供一种特异性结合Olfml-3多肽的分离的或重组单克隆抗体。在某些方面，抗体与46A9BO、9F8BO或Z14A7单克隆抗体竞争结合Olfml-3多肽。优选抗体与46A9BO单克隆抗体竞争结合Olfml-3多肽。在某些方面，抗体可包含46A9BO、9F8BO或Z14A7单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的全部或一部分。在另一方面，抗体可包含对应于来自本发明实施方案的单克隆抗体的轻可变链和/或重可变链的第一、第二和/或第三互补决定区(CDR)的氨基酸序列。
因此，在某些方面，实施方案的分离抗体或重组抗体包含与46A9BO、9F8BO或Z14A7重链和轻链氨基酸序列的CDR区至少80％、90％或95％同一的CDR序列。在其它方面，抗体包含与46A9BO、9F8BO或Z14A7CDR同一的CDR区，例外之处是在一个、两个、三个或更多个CDR处存在一个或两个氨基酸取代、缺失或插入。举例来说，抗体可包含CDR，其中CDR序列相对于46A9BO、9F8BO或Z14A7单克隆抗体的CDR在VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3中包含1个或2个氨基酸取代。因此，在一些特定方面，实施方案的抗体包含(a)与46A9BO的VHCDR1(SEQIDNO：7)或Z14A7的VHCDR1(SEQIDNO：13)至少80％同一的第一VHCDR；(b)与46A9BO的VHCDR2(SEQIDNO：8)或Z14A7的VHCDR2(SEQIDNO：14)至少80％同一的第二VHCDR；(c)与46A9BO的VHCDR3(SEQIDNO：9)或Z14A7的VHCDR3(SEQIDNO：15)至少80％同一的第三VHCDR；(d)与46A9BO的VLCDR1(SEQIDNO：10)或Z14A7的VLCDR1(SEQIDNO：16)至少80％同一的第一VLCDR；(e)与46A9BO的VLCDR2(SEQIDNO：11)或Z14A7的VLCDR2(SEQIDNO：17)至少80％同一的第二VLCDR；和(f)与46A9BO的VLCDR3(SEQIDNO：12)或Z14A7的VLCDR3(SEQIDNO：18)至少80％同一的第三VLCDR。在另一方面，实施方案的抗体包含(a)与9F8BO的VHCDR1(SEQIDNO：21)至少80％同一的第一VHCDR；(b)与9F8BO的VHCDR2(SEQIDNO：22)至少80％同一的第二VHCDR；(c)与9F8BO的VHCDR3(SEQIDNO：23)至少80％同一的第三VHCDR；(d)与9F8BO的VLCDR1(SEQIDNO：24)至少80％同一的第一VLCDR；(e)与9F8BO的VLCDR2(SEQIDNO：25)至少80％同一的第二VLCDR；和(f)与9F8BO的VLCDR3(SEQIDNO：26)至少80％同一的第三VLCDR。
在其它方面，分离抗体或重组抗体包含与单克隆抗体46A9BO的分别由SEQIDNO：7、8、9、10、11和12表示的相应CDR序列至少80％、85％、90％或95％同一的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VLCDR序列。在一个方面，分离抗体包含与单克隆抗体46A9BO的CDR序列同一的CDR序列。在其它方面，抗体是IgG2b抗体。
在另一方面，分离抗体包含与46A9BO的VH结构域(SEQIDNO：1)至少约80％、85％、90％或95％同一的VH结构域和与46A9BO的VL结构域(SEQIDNO：2)至少约80％、85％、90％或95％同一的VL结构域。在其它方面，分离抗体包含与单克隆抗体46A9BO的VH和VL结构域同一的VH和VL结构域。
在其它方面，分离抗体或重组抗体包含与单克隆抗体9F8BO的分别由SEQIDNO：21、22、23、24、25和26表示的相应CDR序列至少80％、85％、90％或95％同一的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VLCDR序列。在一个方面，分离抗体包含与单克隆抗体9F8BO的CDR序列同一的CDR序列。在其它方面，抗体是IgG2b抗体。
在另一方面，分离抗体包含与9F8BO的VH结构域(SEQIDNO：19)至少约80％、85％、90％或95％同一的VH结构域和与9F8BO的VL结构域(SEQIDNO：20)至少约80％、85％、90％或95％同一的VL结构域。在其它方面，分离抗体包含与单克隆抗体9F8BO的VH和VL结构域同一的VH和VL结构域。
在其它方面，分离抗体或重组抗体包含与单克隆抗体Z14A7的分别由SEQIDNO：13、14、15、16、17和18表示的相应CDR序列至少80％、85％、90％或95％同一的第一VH、第二VH、第三VH、第一VL、第二VL和第三VLCDR序列。在一个方面，分离抗体包含与单克隆抗体Z14A7的CDR序列同一的CDR序列。在其它方面，抗体是IgG2c抗体。
在另一方面，分离抗体包含与Z14A7的VH结构域(SEQIDNO：3)至少约80％、85％、90％或95％同一的VH结构域和与Z14A7的VL结构域(SEQIDNO：4)至少约80％、85％、90％或95％同一的VL结构域。在一些方面，分离抗体包含与单克隆抗体Z14A7的VH和VL结构域同一的VH和VL结构域。
在一些方面，实施方案的抗体可为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA或其抗原结合片段。在其它方面，抗体可为Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。在一些情况下，抗体可为人抗体、人源化抗体或去免疫抗体。在另一方面，分离抗体是Z14A7、9F8BO或46A9BO抗体。
在某些方面，实施方案的抗体(或其片段)是糖基化抗体(例如具有哺乳动物糖基化形式)。在一些方面，抗体是去糖基化抗体(例如酶处理的抗体或在细菌中产生的抗体)或具有非哺乳动物糖基化(例如在酵母或昆虫细胞中产生的抗体)。
在一些实施方案中，提供一种分离的多核苷酸分子，其包含编码本文公开的抗体或包含抗体VH或VL结构域的多肽的核酸序列。
在其它实施方案中，提供一种产生实施方案的单克隆抗体或重组多肽的宿主细胞。在一些方面，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。在某些方面，宿主细胞是杂交瘤细胞。
在其它实施方案中，提供一种制造本发明实施方案的抗体的方法，其包括在细胞中表达一种或多种编码本文公开的抗体的VL或VH链的多核苷酸分子，以及从所述细胞纯化所述抗体。
在其它实施方案中，提供包含如本文讨论的抗体或抗体片段的药物组合物。这种组合物进一步包含药学上可接受的载体，并且可含有或可不含有其它活性成分。
因此，在一些方面(例如对于医学或临床应用)，可使抗体或片段连接于待靶向Olfml-3表达性细胞的试剂。所述试剂可为细胞毒性剂、细胞因子、抗血管生成剂、化学治疗剂、诊断剂、显像剂、放射性同位素、促凋亡剂、酶、激素、生长因子、肽、蛋白质、抗生素、抗体、抗体的Fab片段、显像剂、抗原、存活因子、抗凋亡剂、激素拮抗剂、病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微粒、磁性珠粒、微装置、细胞、核酸或表达载体。
也可提供一种于药学上可接受的载体中包含一种或多种上述抗体或片段的药物组合物，例如一种包含抗体或片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。
预期上述本发明的Olfml-3抗体或片段或组合物可用于治疗其中血管生成起作用的任何疾病或病症，其将被一般地称为血管生成相关病状。预期本发明将可适用于人或动物的任何所述病症。示例性血管生成相关病状包括癌症、眼部新血管形成、动静脉畸形、冠脉再狭窄、外周血管再狭窄、肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、缺血性心血管病变、慢性炎性疾病等。
在癌症的情况下，示例性血管生成癌症包括血管生成乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤或白血病。眼部新血管形成病症包括黄斑变性(例如年龄相关的黄斑变性(AMD))、角膜移植物排斥、角膜新血管形成、早产儿视网膜病(ROP)和糖尿病性视网膜病。
某些实施方案涉及一种包含特异性结合Olfml-3的分离和/或重组抗体或多肽的抗体或重组多肽组合物。在某些方面，抗体或多肽具有与任何本文提供的单克隆抗体的全部或一部分至少或至多80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一(或其中可导出的任何范围)的序列。在其它方面，分离和/或重组抗体或多肽具有、具有至少、或具有至多10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个来自任何本文提供的序列(例如SEQIDNO：1、2、3、4、19或20)或所述序列的组合的连续氨基酸。
在其它方面，实施方案的抗体或多肽包含一个或多个具有任何本文公开的氨基酸序列的氨基酸区段。举例来说，抗体或多肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸区段，所述区段在长度方面包含与任何本文公开的氨基酸序列至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一的约、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25至25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个氨基酸，包括其间的所有值和范围。在某些方面，氨基区段选自如表1中提供的Olfml-3结合抗体的氨基酸序列(例如SEQIDNO：1、2、3、4、19或20)中的一个。
在其它方面，实施方案的抗体或多肽包含与Olfml-3结合抗体(如表1中所提供)的V、VJ、VDJ、D、DJ、J或CDR结构域至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一(或其中可导出的任何范围)的氨基酸区段。举例来说，多肽可包含1、2或3个与如表1中提供的Olfml-3结合抗体的CDR1、2和/或3至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一(或其中可导出的任何范围)的氨基酸区段。
如本文在说明书中所用，“一”可意指一个(种)或多个(种)。如本文在权利要求中所用，当与措辞“包含”联合使用时，措辞“一”可意指一个(种)或超过一个(种)。
除非明确指示仅指代供选择物或供选择物是互相排斥的，否则在权利要求中使用术语“或”用于意指“和/或”，但本公开支持仅指代供选择物以及“和/或”的定义。如本文所用，“另外”可意指至少第二或更多。
在整篇本申请中，术语“约”用于指示值包括用于测定所述值的装置、方法的固有误差偏差或存在于研究受试者之间的偏差。
本发明的其它目标、特征和优势将根据以下详细描述而变得明显。然而，应了解尽管指示本发明的优选实施方案，但详细描述和特定实施例通过仅说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改将根据这个详细描述而变得对本领域技术人员明显。
附图简述
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过参照这些附图中的一个或多个，结合本文呈现的特定实施方案的详细描述来更充分了解。
图1.针对人Olfml3的大鼠单克隆抗体对肿瘤生长的抑制作用。图1A：用大鼠IgG2B(同种型对照)、9F8BO(抗Olfml-3B)或46A9BO(抗Olfml-3B)抗体治疗的小鼠中的9天龄LLC1肿瘤。棒条对应于1cm。图1B：相较于对照IgG2B治疗的肿瘤，用9F8BO(抗Olfml-3B)和46A9BO(抗Olfml-3B)抗体治疗的小鼠中的肿瘤重量降低。误差棒代表SEM(1个实验；5只小鼠/组；2个肿瘤/小鼠)。*P＜0.05。
图2.图显示用以评估针对人Olfml3的46A9单克隆抗体对肿瘤生长的抑制作用的进一步研究的结果。用LLC1细胞皮下(s.c.)接种小鼠，并且随后用对照大鼠IgG或30、150或750μg46A9在接种之后第5、7和9天注射。在第11天，处死动物。在整个研究过程期间测量肿瘤体积，并且将结果绘图。
图3.图显示用以评估针对人Olfml3的9F8(mAb1)和46A9(mAb2)单克隆抗体对肿瘤生长的抑制作用的进一步研究的结果。用LLC1细胞皮下接种小鼠，并且随后用对照大鼠IgG、9F8或46A9抗体(以每只小鼠150μg的剂量)在接种之后第5、7和9天注射。在第11天，处死动物。在整个研究过程期间测量肿瘤体积，并且将结果绘图。如下标记误差棒：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；以及****p＜0.0001。
图4A-B.A，图显示暴露于9F8(mAb1)或46A9(mAb2)单克隆抗体或对照(11G8)抗体的肿瘤组织中的免疫荧光研究的结果。肿瘤组织切片用DAPI染色并进行免疫荧光标记以检测作为血管形成标志物的PECAM-1。定量PECAM-1阳性组织区域的比例(以在对照治疗的样品中检测的区域的百分比形式)，并且将结果绘图。B，进一步免疫荧光研究用于确定治疗的肿瘤组织中的周细胞覆盖量。再次，将暴露于9F8(mAb1)或46A9(mAb2)单克隆抗体或对照(11G8)抗体的组织切片。肿瘤组织切片用DAPI染色并进行免疫荧光标记以检测PECAM-1和α-SMA来确定组织中的周细胞覆盖率。将组织中α-SMA+区域比例和α-SMA+周细胞覆盖率定量并绘图。
图5.图显示对46A9BO抗体结合重组可溶性Olfml-3蛋白的ELISA研究。研究用糖基化46A9BO抗体与去糖基化46A9BO抗体两者进行，并且结果显示抗原识别基本上不依赖于抗体糖基化。
说明性实施方案的描述
本发明实施方案部分地基于Olfml-3作为血管生成调节剂的作用。本发明实施方案的各个方面可用于预防或治疗与Olfml-3介导的血管生成相关的疾病或病症。Olfml-3的作用可通过单克隆抗Olfml-3抗体来降低。在某些方面，本发明实施方案提供递送对Olfml-3具有特异性的单克隆抗体以治疗血管生成相关疾病(诸如癌症)的组合物和方法。以下描述本发明的其它实施方案和优势。
I.Olfml-3
嗅介蛋白(Olfactomedin)样蛋白3(Olfml-3)是一种在人中由OLFML3基因编码的蛋白质。先前，本发明者使用t.End.1V高血管生成和t.End.1V低静息细胞系来鉴定差异性表达，并且与血管生成相关的新分子。在鉴定的血管生成相关的基因之中，他们鉴定了小鼠Olfml-3基因(嗅介蛋白样3(olfactomedin-like3))(同义词：mONT3、HNOEL-iso、hOLF44)。
一些嗅介蛋白家族成员牵涉于其中它们起调控作用的发育过程中，所述成员诸如tiarin(Tsuda等，2002)、pDP4(Rosenbauer等，2004)和嗅球蛋白(noelin)(Moreno和Bronner-Fraser，2005；Barembaum等，2000)。功能获得研究已显示当在非洲蟾蜍(Xenopus)胚胎中过表达时，Olfml-3(mONT3)展现如对于tiarin所示的背侧化作用(Ikeya等，2005)，从而表明它在非洲蟾蜍外胚层样式化方面具有活性。近来，显示非洲蟾蜍ONT1是用于精细调谐脊索蛋白(Chordin)/骨形态发生蛋白质(BMP)系统的关键分子，其中它充当用于B1TP介导的脊索蛋白降解的分泌骨架(Harland，2008；Inomata等，2008；Sakuragi等，2006)。这表明Olfml-3可充当不同酶和底物的骨架(Tomarev和Nakaya，2009)。从疾病状态至发育事件的所有这些数据都强调了解含有嗅介蛋白结构域的蛋白质的功能的重要性。
通过系统发生分析所鉴定，人hOLF44基因编码属于嗅介蛋白/嗅球蛋白/Tiarin家族的分泌糖蛋白。连同mONT2(嗅介蛋白样1)和鸡cONT1一起，人Olfml-3基因属于分泌分子的新的未表征嗅介蛋白样(ONT)亚家族(Ikeya等，2005)，所述分子包括mONT3、rONT3、hONT3、cONT1、mONT2、rONT2和hONT2。这个分泌糖蛋白含有在N末端的推定信号肽、在序列中间的卷曲螺旋结构域和在C末端的嗅介蛋白样(OLF)结构域(Zeng等，2004)。这个分子涉及在嗅觉神经元周围的细胞外基质(ECM)的形成(Snyder等，1991；Yokoe和Anholt，1993)，并且在脊椎动物神经发育中具有调控作用(Barembaum等，2000；Tsuda等，2002)。
最高水平的人Olfml-3(hOLF44)mRNA表达见于胎盘中，而且也见于肝和心脏中，但表达水平较低(Zeng等，2004)。内源性hOLF44见于人足月胎盘的胎儿侧上围绕合胞体滋养母细胞的细胞外间隙中，从而说明所述分子是分泌的(Zeng等，2004)。标记的重组hOLF44蛋白在COS-7细胞的核周区域中，多半在内质网中富集，从而提供证据表明它可采用经典分泌路径(Zeng等，2004)。这些研究结果表明人Olfml-3作为与细胞外基质(ECM)相关，可能牵涉于基质相关的胎盘和胚胎发育或类似过程中的组分的作用(Zeng等，2004)。
发现人Olfml-3的大鼠直系同源物(大鼠HNOEL-iso)基因在虹膜、巩膜、视网膜的小梁网和视神经中表达(Ahmed等，2004)。在胚胎发生期间极其早期检测到人Olfml-3的小鼠对应物(mONT3)的表达：首先，在尿囊的近侧区域中，随后在假定侧中胚层板中，接着于E8.5胚胎日在CNS和心脏中(Ikeya等，2005)。发现mONT-3敲除小鼠(雄性和雌性)是可存活的，正常的以及可繁殖的，从而表明mONT3对于正常胚胎发生是非必需的，并且由其它家族成员代偿(Ikeya等，2005)。此外，功能获得研究显示当在非洲蟾蜍胚胎中过表达时，mONT3展现背侧化作用(Ikeya等，2005)，从而表明在胚胎图式形成方面具有作用。
II.治疗性抗体
在某些实施方案中，涵盖结合Olfml-3蛋白的至少一部分，并且抑制Olfml-3在血管生成中的活性的抗体或其片段以及它们治疗疾病的相关用途。如本文所用，术语“抗体”意图广泛指代任何免疫结合剂，诸如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE以及保留抗原结合活性的包含抗体CDR结构域的多肽。抗体可选自由嵌合抗体、亲和力成熟抗体、人源化抗体和人抗体组成的组。优选地，抗Olfml-3抗体是人源化抗体。通过已知手段以及如本文所述，可产生对Olfml-3蛋白、它的一个或多个相应表位、或任何前述各物的缀合物具有特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段以及结合结构域和CDR(包括任何前述各物的工程改造形式)，无论所述抗原或表位从天然来源分离或是天然化合物的合成衍生物或变体。
在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如包含移植于异源性非人、人或人源化序列(例如框架和/或恒定结构域序列)的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。在一个实施方案中，非人供体是大鼠。在一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变(例如噬菌体展示筛选等)所获得。在一个实施方案中，本发明的嵌合抗体具有鼠类V区和人C区。在一个实施方案中，使鼠类轻链V区融合于人κ轻链。在一个实施方案中，使鼠类重链V区融合于人IgG1C区。
适于本发明的抗体片段的实例包括不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的“Fv”片段；(iv)由VH结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，即包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域由使两个结构域缔合以形成结合结构域的肽接头连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；和(ix)双功能抗体，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(美国专利申请公布20050214860)。可通过并入连接VH结构域和VL结构域的二硫桥键来使Fv、scFv或双功能抗体分子稳定。也可制备包含接合于CH3结构域的scFv的微抗体(Hu等，1996)。
抗体样结合肽模拟物也涵盖在实施方案中。Liu等(2003)描述“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其是充当削减抗体，并且具有某些优势(血清半衰期较长以及合成方法的繁重性较小)的肽。
动物可用抗原，诸如Olfml-3蛋白或肽接种以产生对Olfml-3蛋白或肽具有特异性的抗体。常常，使抗原结合或缀合于另一分子以增强免疫应答。如本文所用，缀合物是结合于用于在动物中引发免疫应答的抗原的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质物质。在动物中应答于抗原接种产生的抗体包括由多种个别抗体产生性B淋巴细胞制得的多种非相同分子(多克隆抗体)。多克隆抗体是其各自可识别相同抗原上的不同表位的抗体种类的混合群体。鉴于动物中多克隆抗体产生的恰当条件，所述动物的血清中的大多数抗体将识别所述动物已针对其加以免疫的抗原性化合物上的集合表位。通过亲和纯化来进一步增强这个特异性以仅选择识别目标抗原或表位的那些抗体。
单克隆抗体是单一种类的抗体，其中每个抗体分子都识别相同表位，因为所有抗体产生性细胞都源于单一B淋巴细胞细胞系。用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常沿与用于制备多克隆抗体的那些品系相同的品系开始。在一些实施方案中，诸如小鼠和大鼠的啮齿动物用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是熟知的，并且可提供某些优势。小鼠(例如BALB/c小鼠)被常规使用，并且通常产生高百分比的稳定融合。
杂交瘤技术涉及使来自先前用Olfml-3抗原免疫的小鼠的单一B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)融合。这个技术提供一种持续无限数目的世代来繁殖单一抗体产生性细胞，以使可产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同抗体(单克隆抗体)的方法。
已开发用人来源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，从而保持外来抗体的可变区完整的方法。或者，在关于人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中产生“完全人”单克隆抗体。也已开发用以通过重组构建具有啮齿动物氨基酸序列与人氨基酸序列两者的抗体可变结构域来使单克隆抗体的可变结构域转化成更似人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，仅高变CDR源于小鼠单克隆抗体，而框架区源于人氨基酸序列。据认为用见于人抗体的相应位置中的氨基酸序列替换抗体中是啮齿动物所特有的氨基酸序列将降低治疗使用期间不利免疫反应的可能性。也可使产生抗体的杂交瘤或其它细胞经受可或可不改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性的遗传突变或其它变化。
有可能使用单克隆抗体和其它抗体以及重组DNA技术来产生工程改造的抗体以产生保留原始抗体的抗原或表位特异性的其它抗体或嵌合分子，即分子具有结合结构域。所述技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同抗体的框架区、恒定区、或恒定区加框架区的遗传物质中。参见例如以引用的方式并入本文的美国专利号5,091,513和6,881,557。
通过如本文所述的已知手段，可产生对Olfml-3蛋白、它的一个或多个相应表位、或任何前述各物的缀合物具有特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段以及结合结构域和CDR(包括任何前述各物的工程改造形式)，无论所述抗原或表位从天然来源分离或是天然化合物的合成衍生物或变体。
抗体可从任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物产生。优选地，抗体是羊类、鼠类(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。此外，更近期技术允许从人组合抗体文库开发和筛选人抗体。举例来说，噬菌体抗体表达技术允许在不存在动物免疫下产生特异性抗体，如以引用的方式并入本文的美国专利号6,946,546中所述。这些技术进一步描述于Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram等(1992)；Barbas等(1994)；以及Schier等(1996)中。
用于在各种动物物种中产生多克隆抗体，以及用于产生各种类型(包括人源化、嵌合和完全人)的单克隆抗体的方法在本领域中是熟知的以及高度可预测的。用于产生这些抗体的方法也是熟知的以及可预测的。举例来说，以下美国专利和专利申请提供使得能够实现所述方法的描述，并且以引用的方式并入本文：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677；以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024。本文以及其中引用的所有专利、专利申请公布和其它出版物都据此以引用的方式并入本申请。
充分预期的是无论抗体的动物物种、单克隆细胞系或其它来源如何，针对Olfml-3的抗体都将能够中和或抵消Olfml-3的作用。某些动物物种用于产生治疗性抗体的优选性可较小，因为由于通过抗体的“Fc部分”使补体系统活化，它们可更可能导致过敏应答。然而，整个抗体可被酶促消化成“Fc”(补体结合)片段以及具有结合结构域或CDR的抗体片段。移除Fc部分会降低抗体片段将引发不合需要的免疫应答的可能性，并且因此，无Fc的抗体可优先用于防治性或治疗性治疗。如上所述，抗体也可被构建以使其为嵌合抗体、部分或完全人抗体，以便减轻或消除由向动物施用已在其它物种中产生或具有来自其它物种的序列的抗体所致的不利免疫后果。
取代性变体通常含有在蛋白质内的一个或多个位点处进行的一个氨基酸至另一氨基酸的交换，并且可被设计以在损失或不损失其它功能或性质的情况下调节多肽的一种或多种性质。取代可为保守性的，也就是说一个氨基酸被一个具有类似形状和电荷的氨基酸替换。保守性取代在本领域中是熟知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。或者，取代可为非保守性的以使多肽的功能或活性受影响。非保守性变化通常涉及用化学相异残基取代残基，诸如极性或带电荷氨基酸取代非极性或不带电荷氨基酸，并且反之亦然。
蛋白质可为重组的，或在体外合成。或者，非重组或重组蛋白可从细菌分离。也预期含有这种变体的细菌可在组合物和方法中加以实施。因此，蛋白质无需被分离。
预期在组合物中，每ml存在约0.001mg与约10mg之间的总多肽、肽和/或蛋白质。因此，组合物中的蛋白质的浓度可为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更高(或其中可导出的任何范围)。其中，约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可为结合Olfml-3的抗体。
可使抗体或优选是抗体的免疫部分化学缀合于其它蛋白质，或表达为与其它蛋白质的融合蛋白。出于本说明书和随附权利要求的目的，所有所述融合蛋白都被包括在对抗体或抗体的免疫部分的定义中。
实施方案提供连接于至少一种试剂以形成抗体缀合物或有效载荷的针对Olfml-3、多肽和肽的抗体和抗体样分子。为增加抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，常规的是连接或共价结合或复合至少一种所需分子或部分。这种分子或部分可为但不限于至少一种效应物或报道分子。效应物分子包括具有所需活性，例如细胞毒性活性的分子。已连接于抗体的效应物分子的非限制性实例包括毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相比来说，报道分子被定义为可使用测定检测的任何部分。已被缀合于抗体的报道分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色粒子或配体，诸如生物素。
用于使抗体连接或缀合于它的缀合部分的若干方法在本领域中是已知的。一些连接方法涉及使用金属螯合物复合物，其采用例如有机螯合剂，诸如二乙三胺五乙酸酐(DTPA)；乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3-6α-二苯基甘脲-3连接于抗体。也可使单克隆抗体与酶在诸如戊二醛或高碘酸盐的偶联剂存在下反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光素标记的缀合物。
III.治疗疾病
本发明实施方案的某些方面可用于预防或治疗与Olfml-3介导的血管生成相关的疾病或病症。Olfml-3的作用可通过任何适合物质来降低以预防血管生成。所述示例性物质可为单克隆抗Olfml-3抗体。
“治疗(Treatment/treating)”是指出于获得疾病或健康相关病状的治疗益处的目的向受试者施用或施加治疗剂或对受试者执行程序或模式。举例来说，治疗可包括出于使诸如结肠直肠癌的肿瘤的生长或侵袭最小的目的施用抑制Olfml-3的功能的药学上有效量的抗体。
“受试者”是指人或非人，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，受试者是人。
如本申请整篇所用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指就对这个病状的医学治疗而言促进或增强受试者的健康的任何事物。这包括但不限于疾病的征象或症状的频率或严重性降低。举例来说，治疗癌症可涉及例如降低肿瘤的尺寸，降低肿瘤的侵袭性，降低癌生长速率，或防止转移。治疗癌症也可涉及延长患有癌症的受试者的存活期。
本发明的某些方面可用于治疗与Olfml-3的表达增加相关的任何病状或疾病。举例来说，疾病可为血管生成相关病状或疾病。血管生成相关病状或疾病是导致新血管过量的血管生成过程不平衡的结果。
在某些实施方案中，本发明方法可用于抑制非病原性血管生成，即受试者中由正常过程所致的血管生成。非病原性血管生成的实例包括子宫内膜新血管形成以及脂肪组织或胆固醇的产生中涉及的过程。因此，本发明提供一种用于抑制非病原性血管生成，例如用于控制重量或促进脂肪损失，用于降低胆固醇水平，或作为堕胎方法的方法。
本发明方法也可抑制与血管生成疾病相关的血管生成，所述血管生成疾病即其中病原性与血管生成不当或不受控制相关的疾病。举例来说，大多数癌性实体肿瘤通过在肿瘤部位中以及周围诱导血管生成来产生足以供它们自身使用的血液供给。这个肿瘤诱导的血管生成常为肿瘤生长所需，并且也允许转移性细胞进入血流中。
其它血管生成疾病包括糖尿病性视网膜病、年龄相关的黄斑变性(ARMD)、牛皮癣、类风湿性关节炎和其它炎性疾病。这些疾病的特征在于正常组织被新血管形成区域中新形成的血管破坏。举例来说，在ARMD中，脉络膜被毛细血管侵袭和破坏。在ARMD中，血管生成驱动的脉络膜破坏最终导致部分或完全失明。血管生成相关病状也包括眼部新血管形成、动静脉畸形、冠脉再狭窄、外周血管再狭窄、肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、缺血性心血管病变或慢性炎性疾病。
待治疗或预防的示例性血管生成眼病也包括归因于包括但不限于年龄相关的黄斑变性、眼部组织胞浆菌病、病理性近视和血管样条纹的任何病因的脉络膜新血管形成(CNV)。这也适用于包括但不限于增生性糖尿病性视网膜病、视网膜静脉阻塞和早产儿视网膜病的任何病因的视网膜新血管形成。这也适用于任何病因的虹膜新血管形成和角膜新血管形成。
新血管形成也可为与眼部伤口相关的新血管形成。举例来说，伤口可为对眼球的创伤性损伤(诸如角膜裂伤)的结果。或者，伤口可为眼科手术的结果。在一些实施方案中，本发明方法可应用于预防或降低在玻璃体视网膜手术之后增生性玻璃体视网膜病变的风险，预防在角膜手术(诸如角膜移植和激光手术)之后的角膜混浊，预防小梁切除术的闭合，预防或实质上减缓翼状胬肉复发等。
新血管形成可定位在受试者的眼上或眼内。举例来说，新血管形成可为角膜新血管形成(位于角膜上皮上或角膜的内皮表面上)、虹膜新血管形成、玻璃体腔内的新血管形成、视网膜新血管形成或脉络膜新血管形成。新血管形成也可为与结膜疾病相关的新血管形成。
可施用结合Olfml-3的抗体以治疗癌症。癌症可为实体肿瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈、头部、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌部或子宫中。
癌症可具体来说具有以下组织学类型，但它不限于这些：恶性赘瘤；癌瘤；未分化癌瘤；巨大和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉病腺癌；实体癌；恶性类癌瘤肿瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；顶泌腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病(paget′sdisease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；具有鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢基质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；恶性睾丸母细胞瘤；塞尔托利细胞癌(sertolicellcarcinoma)；恶性莱迪希细胞肿瘤(leydigcelltumor)；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合肿瘤；苗勒混合肿瘤(mullerianmixedtumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳肿瘤(brennertumor)；恶性叶状肿瘤(phyllodestumor)；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤(kaposi′ssarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间胚叶性软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；尤因氏肉瘤(ewing′ssarcoma)；恶性牙原性肿瘤；釉母细胞性牙肉瘤；恶性釉母细胞瘤；釉母细胞性纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；寡树突神经胶质细胞瘤；寡树突神经胶质母细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经性肿瘤；恶性脑脊髓膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin′sdisease)；霍奇金氏瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样真菌病；其它指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴细胞性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞性白血病；嗜酸性粒细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
IV.药物制剂
当进行含有单克隆抗体的组合物的临床应用时，将通常有益的是制备适于预定应用的药物组合物。这将通常需要制备基本上不含热原以及可对人或动物有害的任何其它杂质的药物组合物。也可采用适当缓冲剂来致使复合物稳定，并且允许由靶标细胞摄取。
短语“药物或药理学上可接受”是指分子实体和组合物在向动物(适当时，诸如人)施用时不产生不利、过敏性或其它不适当反应。制备包含抑制性核酸或其它活性成分的药物组合物将为本领域技术人员鉴于本公开所知，如由以引用的方式并入本文的Remington(2005)所例示。此外，对于动物(例如人)施用，应了解制剂应满足如由FDA生物标准司(FDAOfficeofBiologicalStandards)所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、所述类似物质及其组合，如将为本领域普通技术人员所知。药学上可接受的载体被特别配制以向人施用，但在某些实施方案中，可合乎需要的是使用被配制以向非人动物施用，但将不可为向人施用所接受(例如由于政府规章)的药学上可接受的载体。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则预期它用于治疗性组合物或药物组合物中。
向患者或受试者施用的本发明组合物的实际剂量可由身体和生理因素决定，所述因素诸如体重、病状的严重性、所治疗的疾病的类型、先前或并行治疗干预、患者的特发病和施用途径。负责施用的从业者将在任何情况下确定组合物中活性成分的浓度和适于个别受试者的剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其它实施方案中，活性化合物可占单位的重量的约2％至约75％之间，或例如约25％至约60％之间，以及其中可导出的任何范围。在其它非限制性实例中，剂量也可包括每次施用每kg体重约1至约1000mg(这个所述范围包括间插剂量)或更多，以及其中可导出的任何范围。在可从本文所列的数值导出的范围的非限制性实例中，可施用每kg体重约5μg至约100mg、约5微克至约500毫克等的范围。各剂量可处于1、10、50、100、200、500、1000或更高μl或ml或在前述数值之间的作何数值的体积中。
可于与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂适当混合的水中制备治疗性组合物的溶液。也可于甘油、液体聚乙二醇、其混合物中以及于油中制备分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
本发明的治疗性组合物有利地以呈液体溶液或混悬液形式的可注射组合物形式施用；也可制备适于在注射之前溶解或混悬于液体中的固体形式。这些制剂也可被乳化。出于所述目的的典型组合物包含药学上可接受的载体。举例来说，组合物可含有每毫升磷酸盐缓冲盐水10mg、25mg、50mg或多达约100mg人血清白蛋白。其它药学上可接受的载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等。
非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯，诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、盐水溶液、胃肠外媒介物，诸如氯化钠、林格氏右旋糖(Ringer′sdextrose)等。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。根据熟知参数调整药物组合物的pH和各种组分的精确浓度。
在特定实施方案中，本发明的组合物适于向哺乳动物的眼施加。举例来说，制剂可为溶液、混悬液或凝胶。在一些实施方案中，组合物通过生物可降解植入物(诸如玻璃体内植入物)或眼用插入物(诸如被设计以相对于结膜表面放置的眼用插入物)来施用。在一些实施方案中，治疗剂涂布医学装置或可植入装置。
在优选方面，本发明的制剂将以呈滴剂形式的水溶液施加于眼。这些滴剂可由单次剂量安瓿递送，所述安瓿可优选是无菌的，并且因此致使不需要制剂的抑菌组分。或者，滴剂可由多次剂量瓶递送，所述瓶可优选包括当制剂被递送时从所述制剂提取防腐剂的装置，所述装置在本领域中是已知的。
在其它方面，本发明的组分可以形成被放置在眼睑下的可溶解插入物的浓缩凝胶或类似媒介物形式向眼递送。
其它制剂适于口服施用。口服制剂包括例如像药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等的典型赋形剂。组合物采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式。
本发明的治疗性组合物可包括经典药物制剂。施用本发明的治疗性组合物将通过任何常见途径，只要通过那个途径可达到靶标组织即可。这包括口服、经鼻、经颊、经直肠、经阴道或局部。局部施用可特别有利于治疗皮肤癌，以防止化学疗法诱发的脱发或其它皮肤过度增生性病症。或者，可通过正位、皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射来施用。所述组合物将通常以包括生理可接受的载体、缓冲剂或其它赋形剂的药学上可接受的组合物形式施用。对于治疗肺或呼吸道病状，可使用气雾剂递送。气雾剂的体积在约0.01ml与0.5ml之间。
基于预定目标确定治疗性组合物的有效量。举例来说，本领域技术人员通过考虑诸如以下的因素可易于确定待向给定受试者施用的本发明的抗体的有效量：受试者的尺寸和重量；新血管形成或疾病渗透的程度；受试者的年龄、健康和性别；施用途径；以及施用是区域性的抑或是全身性的。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者中的物理离散单元，各单元含有被计算以产生以上联合它的施用(即适当途径和治疗方案)所讨论的所需响应的预定量的治疗性组合物。待施用的量(根据治疗次数与单位剂量两者)取决于所需保护或作用。
治疗性组合物的精确量也取决于从业者的判断，并且对于各个体是特定的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态、施用途径、预定治疗目标(例如减轻症状相对于治愈)以及特定治疗性物质的效价、稳定性和毒性。
V.组合治疗
在某些实施方案中，本发明的组合物和方法涉及与第二或另一疗法组合的针对Olfml-3以抑制它在血管生成中的活性的抗体或抗体片段。所述疗法可应用于治疗与Olfml-3的表达或活性增加相关的任何疾病。举例来说，疾病可为血管生成相关疾病。
方法和组合物(包括组合疗法)增强治疗或保护作用，和/或增加另一抗血管生成、抗癌或抗过度增生疗法的治疗作用。治疗性和防治性方法和组合物可以有效实现所需作用，诸如杀灭癌细胞和/或抑制细胞过度增殖的组合量提供。这个过程可涉及使细胞与抗体和第二疗法两者接触。可使组织、肿瘤或细胞与一种或多种包括一种或多种药剂(即抗体或抗癌剂)的组合物或药理学制剂接触，或通过使所述组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同组合物或制剂接触，其中一种组合物提供1)抑制性抗体；2)抗癌剂，或3)抑制性抗体与抗癌剂两者。此外，预期这种组合疗法可与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法联合使用。
术语“接触”和“暴露”在应用于细胞时在本文中用于描述这样的过程，借助所述过程治疗性抗体和化学治疗剂或放射冶疗剂被递送至靶标细胞中或被与所述靶标细胞直接邻近放置。为实现细胞杀灭，例如以有效杀灭细胞或防止它分裂的组合量向细胞递送两种药剂。
相对于抗癌治疗，抑制性抗体可在之前、期间、之后或以各种组合施用。施用可处于在从同时发生至数分钟至数天至数周范围内的间隔下。在其中基因表达的抑制剂与抗癌剂分开向患者提供的实施方案中，将通常确保有效时期在各次递送的时间之间不期满，以使两种化合物将仍然能够对患者施加有利组合作用。在所述情况下，预期可在彼此的约12至24或72小时内，并且更具体来说在彼此的约6-12小时内向患者提供抗体和抗癌疗法。在一些情况下，可合乎需要的是显著延长治疗时期，其中在相应施用之间有数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)时间推移。
在某些实施方案中，疗程将持续1-90天或更多天(这个所述范围包括间插天数)。预期一种药剂可在第1天至第90天(这个所述范围包括间插天数)中的任一天或其任何组合给予，并且另一药剂在第1天至第90天(这个所述范围包括间插天数)中的任一天或其任何组合给予。在单一天(24小时时期)内，患者可被给予一次或多次药剂施用。此外，在疗程之后，预期存在一段不施用抗癌治疗的时期。视患者的状况，诸如他们的预后、力量、健康等而定，这个时期可持续1-7天和/或1-5周和/或1-12个月或更长时间(这个所述范围包括间插天数)。预期必要时将重复治疗循环。
可采用各种组合。对于以下实例，抑制性抗体疗法是“A”，而抗癌疗法是“B”：
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A
B/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A
向患者施用本发明的任何化合物或疗法都将在考虑药剂的毒性(如果有的话)下遵循用于施用所述化合物的一般性方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。
在特定方面，预期标准疗法将包括抗血管生成疗法、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法或基因疗法，并且可与如本文所述的抑制性抗体、抗癌疗法、或抑制性抗体与抗癌疗法两者组合采用。
A.抗血管生成疗法
熟练技术人员将了解其它抗血管生成疗法可与本发明方法组合或联合使用。举例来说，其它抗血管生成疗法可拮抗VEGF和/或FGF信号传导路径。因此，在一些情况下，其它疗法可包括施用结合VEGF、VEGF受体、FGF或FGF受体的抗体。在某些特定方面，本发明的方法和组合物可与(贝伐单抗(bevacizumab))、(雷珠单抗(ranibizumab))、(培加他尼钠(pegaptanibsodium))或消炎性药物联合使用。因此，在某些特定情况下，提供一种包含于药学上可接受的载体中的抗Olfml-3组合物和贝伐单抗或培加他尼钠的治疗性组合物。
在其它方面，调控血管生成的基因可与本发明方法联合递送。举例来说，在一些方面，调控血管生成的基因可为金属蛋白酶的组织抑制剂、内皮抑素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、kringle1-5、PEX、基质金属蛋白酶-2的C末端血红素结合蛋白结构域、人血纤维蛋白溶酶原的kringle5结构域、内皮抑素和血管抑素的融合蛋白、内皮抑素和人血纤维蛋白溶酶原的kringle5结构域的融合蛋白、由干扰素-γ诱导的单核因子(Mig)、干扰素-α诱导性蛋白质10(IP10)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(fins样酪氨酸激酶1受体)和激酶插入结构域受体(KDR)基因。在某些特定方面，这种血管生成调控基因可于诸如美国专利7,122,181中所述的慢病毒载体的病毒载体中递送，所述专利以引用的方式并入本文。
B.化学疗法
广泛多种化学治疗剂可根据本发明加以使用。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于暗示在治疗癌症时施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据它们在细胞内的活性模式，例如它们是否影响细胞周期以及在什么阶段它们影响细胞周期来分类。或者，药剂可基于它直接交联DNA、插入DNA中、或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力加以表征。大多数化学治疗剂属于以下种类：烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲。
化学治疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和保释芬(piposulfan)；氮丙啶，诸如本多帕(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、米特多帕(meturedopa)和优多帕(uredopa)；亚乙基亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(尤其布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；凯利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；潘卡他汀(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡里奇霉素(calicheamicin)，尤其卡里奇霉素γlI和卡里奇霉素ωI1；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双磷酸盐，诸如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白(chromoprotein)烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authrarnycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如二甲睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如弗罗林酸(frolinicacid)；乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；胺基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊佛米新(elformithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(galliumnitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；洛尼代宁(lonidainine)；类美登醇(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹达洛(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足叶草酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、维拉库林A(verracurinA)、杆孢菌素A(roridinA)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；格塞图辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂配位络合物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓扑异构酶(topoisomerase)抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine)(DMFO)；类视色素(retinoid)，诸如视黄酸(retinoicacid)；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴肼(procarbazine)、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法呢基蛋白质转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)及以上中的任一个的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
这个定义中也包括用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抑制调控肾上腺中雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如像4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉于异常细胞增殖中的信号传导路径中的基因(例如像PKC-α、Ralf和H-Ras)的表达的那些；核糖酶，诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗；及以上中的任一个的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
C.放射疗法
导致DNA损害并已广泛使用的其它因素包括通常称为γ射线、X射线和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素的因素。也涵盖其它形式的DNA损害因素，诸如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和紫外线辐照。最可能的是这些因素都对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复、以及染色体的组装和维持造成广泛范围的损害。X射线的剂量范围在从每日剂量50至200伦琴(roentgen)持续延长时期(3至4)至单次剂量2000至6000伦琴的范围内。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型、以及由赘生性细胞达成的摄取。
术语“接触”和“暴露”在应用于细胞时在本文中用于描述这样的过程，借助所述过程治疗性构建体和化学治疗剂或放射冶疗剂被递送至靶标细胞中或被与所述靶标细胞直接邻近放置。为实现细胞杀灭，例如以有效杀灭细胞或防止它分裂的组合量向细胞递送两种药剂。
D.免疫疗法
在癌症治疗的情形下，免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。曲妥珠单抗(Trastuzumab)(HerceptinTM)是这种实例。免疫效应物可为例如对肿瘤细胞的表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独抗体可充当疗法的效应物，或它可募集其它细胞来实际上影响细胞杀灭。也可使抗体缀合于药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、篦麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)，并且仅充当靶向剂。或者，效应物可为携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。治疗模式(即直接细胞毒性活性和抑制或降低ErbB2)的组合将在治疗ErbB2过表达性癌症方面提供治疗益处。
另一免疫疗法也可用作与以上讨论的基因沉默疗法的组合疗法的一部分。在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带可经受靶向，即不存在于大多数其它细胞上的某一标志物。存在许多肿瘤标志物，并且在本发明的情形下，这些中的任一个都可适于靶向。常见肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酰基路易斯抗原(SialylLewisAntigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白(laminin)受体、erbB和p155。免疫疗法的替代性方面在于使抗癌作用与免疫刺激作用组合。也存在免疫刺激分子，包括细胞因子，诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF和γ-IFN；趋化因子，诸如MIP-1、MCP-1和IL-8；以及生长因子，诸如FLT3配体。以蛋白质形式或使用基因递送来使免疫刺激分子与肿瘤抑制剂组合已显示会增强抗肿瘤作用(Ju等，2000)。此外，针对这些化合物中的任一个的抗体可用于靶向本文讨论的抗癌剂。
当前在研究中或使用中的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2、p53(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗p185(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美国专利5,824,311)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的基因沉默疗法一起采用。
在主动免疫疗法中，通常与不同细菌佐剂一起施用抗原性肽、多肽或蛋白质、或自体或同种异体肿瘤细胞组合物或“疫苗”(Ravindranath和Morton，1991；Morton等，1992；Mitchell等，1990；Mitchell等，1993)。
在过继性免疫疗法中，体外分离患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，通过诸如IL-2的淋巴因子来活化或以用于达成肿瘤坏死的基因转导，并且再施用(Rosenberg等，1988；1989)。
E.手术
约60％的患有癌症的人士将经受某一类型的手术，其包括预防性、诊断性或分级性、治愈性和缓解性手术。治愈性手术是可与其它疗法联合使用的癌症治疗，所述其它疗法诸如本发明的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代性疗法。
治愈性手术包括切除，其中癌性组织的全部或一部分被物理移除、切除和/或破坏。肿瘤切除是指物理移除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除之外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(莫斯手术(Mohs’surgery))。进一步预期本发明的某些方面可与移除浅表癌、前癌或伴随量的正常组织联合使用。
在切除癌性细胞、组织或肿瘤的一部分或全部后，可在身体中形成空腔。治疗可通过用另一抗癌疗法灌注、直接注射或局部施加于区域来实现。所述治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月进行重复。这些治疗的剂量也可不同。
F.其它药剂
预期其它药剂可与本发明的某些方面组合用于改进治疗的治疗功效。这些其它药剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体的上调和间隙接合的药剂、细胞抑制和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖性细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂、或其它生物制剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。进一步预期上调细胞表面受体或它们的配体(诸如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配体))将通过建立对过度增殖性细胞的自分泌或旁分泌效应来增强本发明的凋亡诱导能力。通过升高间隙接合的数目来增加细胞间信号传导将使对相邻过度增殖性细胞群体的抗过度增殖作用增加。在其它实施方案中，细胞抑制或分化剂可与本发明的某些方面组合用于改进治疗的抗过度增殖功效。细胞粘附抑制剂被涵盖来改进本发明的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步预期使过度增殖性细胞对凋亡的敏感性增加的其它药剂(诸如抗体c225)可与本发明的某些方面组合用于改进治疗功效。
激素疗法也可与本发明的某些方面联合或与先前所述的任何其它癌症疗法组合使用。激素的使用可用于治疗某些癌症，诸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌，以降低诸如罩固酮或雌激素的某些激素的水平或阻断其作用。这个治疗常与至少一种作为治疗选项或用以降低转移风险的其它癌症疗法组合使用。
VI.试剂盒和诊断
在本发明的各个方面，设想一种含有治疗剂和/或其它治疗和递送剂的试剂盒。在一些实施方案中，本发明涵盖一种用于制备和/或施用本发明的疗法的试剂盒。试剂盒可包括一个或多个含有任何本发明的药物组合物的密封小瓶。试剂盒可包括例如至少一种Olfml-3抗体以及用以制备、配制和/或施用本发明的组分或执行本发明方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施方案中，试剂盒也可包括适合容器部件，其是将不与试剂盒的组分反应的容器，诸如埃彭道夫管、测定板、注射器、瓶或管。容器可由可灭菌材料，诸如塑料或玻璃制得。
试剂盒可进一步包括说明单页，其概述本文阐述的方法的程序步骤，并且将遵循与本文所述或为普通技术人员所知大致上相同的程序。说明信息可处于含有机器可读指令的计算机可读介质中，所述指令在使用计算机执行时导致显示递送药学上有效量的治疗剂的真实或虚拟程序。
VII.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应了解随后实施例中公开的技术代表由本发明者发现在实施本发明方面良好地起作用的技术，并且因此可被视为构成它的优选实施模式。然而，本领域技术人员鉴于本公开应了解可在不脱离本发明的精神和范围下，在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且仍然会获得相似或类似结果。
实施例1-产生单克隆抗体
本发明者产生一组针对重组Olfml-3蛋白的单克隆抗体。使用标准技术，通过在大鼠中同时注射作为免疫原的两种长度是14个aa的肽来产生三种针对人Olfml3的抗体，所述肽包含卷曲螺旋(肽A，86-99aa：RVDRLEREVDYLET；SEQIDNO：5)和嗅介蛋白样结构域(肽B，390-403aa：GYQIVYKLEMRKKE；SEQIDNO：6)中的表位(Aurrand-Lions等，1996)。简要来说，偶联于100μgKLH载体蛋白(钥孔虫戚血蓝蛋白，Pierce)并与佐剂S6322(Sigma)混合的人Olfml3肽A和B用于免疫雌性Wister大鼠。总之，每9天进行3次注射。在最终皮下注射人Olfml3肽之后2天，使来自引流淋巴结的母细胞融合于Sp2/0细胞，并且在含有HAT的培养基(LifeTechnologies)中选择杂交瘤。通过ELISA来筛选产生特异性识别人Olfml3-FLAG的单克隆抗体的生长克隆。阳性克隆被亚克隆、再筛选以及进一步测试。根据制造商说明书，在蛋白质G-琼脂糖柱(GEHealthCare)上纯化抗体。两种Olfml3结合抗体46A9BO和9F8BO具有IgG2b同种型子类，并且一种Olfml3结合抗体Z14A7具有IgG2c同种型子类。46A9BO和9F8BO单克隆抗体用于体内肿瘤移植物模型。
将抗体46A9BO、9F8BO和Z14A7的VH和VL链测序，并且确定互补决定区(CDR)。从杂交瘤细胞集结块提取总RNA，并且通过用寡(dT)引物进行逆转录来从RNA产生cDNA。使用用以扩增单克隆抗体DNA的VH区与VL区两者的可变结构域引物来进行PCR反应。提取并凝胶纯化产物，接着克隆至Invitrogen测序载体pCR2.1中，并且转化至TOP10中以获得阳性转化体。挑选所选择的菌落，并且通过测序来分析，由此产生各抗体的共有序列(表1)。通过IMGT编号系统来确定CDR(Lefranc等，1999)。
抗体46A9BO包含对应于SEQIDNO：7、8和9的VHCDR序列和对应于SEQIDNO：10、11和12的VLCDR序列。抗体9F8BO包含对应于SEQIDNO：21、22和23的VHCDR序列和对应于SEQIDNO：24、25和26的VLCDR序列。抗体Z14A7包含对应于SEQIDNO：13、14和15的VHCDR序列和对应于SEQIDNO：16、5和6的VLCDR序列。
用46A9BO抗体进行的其它研究显示抗原识别基本上不依赖于抗体糖基化。ELISA研究显示无论抗体是否已被去糖基化，重组可溶性Olfml-3蛋白都以剂量依赖性方式结合于46A9BO抗体(参见图5)，但糖基化抗体更有效结合抗原。当测试糖基化和去糖基化46A9BO与Olfml-3肽B序列的结合时，获得相同结果(在两种情况下均未观察到与肽A序列的结合)。
实施例2-抗Olfml-3单克隆抗体46A9BO和9F8BO在体内降低肿瘤生长
用0.5x106个鼠类路易斯(Lewis)肺癌细胞(LLC1；从EuropeanCollectionofCellCultures，Salisbury,UnitedKingdom获得)皮下(s.c.)接种8至10周龄雌性C56BL6/J小鼠。接着如下用抗体腹膜内注射小鼠：在第1天：50μg，在第5天：50μg以及在第8天：50μg单克隆抗体46A9BO、单克隆抗体9F8BO或同种型匹配对照大鼠IgG2B抗体。在第九天切除肿瘤并分析。测量肿瘤重量。
相较于同种型匹配对照抗体，用46A9BO或9F8BO抗Olfml-3抗体治疗的小鼠中的肿瘤重量显著降低(图1)。因为LLC1肿瘤不表达Olfml-3，所以肿瘤生长降低归因于抗Olfml-3抗体对肿瘤血管生成的作用。
为测试治疗和剂量效应，进行进一步研究以评估46A9抗体的体内肿瘤生长抑制活性。再次，用LLC1细胞皮下接种小鼠。接种的小鼠接着用对照大鼠IgG或30、150或750μg46A9在接种之后第5、7和9天治疗。在第11天，处死动物。在整个研究过程期间测量肿瘤体积。结果显示于图2的图中，所述图说明所有测试剂量的46A9抗体都实现肿瘤体积统计显著降低。
在第11天处死小鼠之后，收集组织样品，并且使其经受组织学分析以评估任何潜在毒性。对来自小鼠的肺、心脏、肝和肾组织样品的详细分析揭示即使在46A9的最大测试剂量750μg下也无毒性征象。因此，在测试条件下，抗Olfml-3疗法似乎基本上无毒。
进行其它鼠类研究以评估9F8(mAb1)和46A9(mAb2)单克隆抗体的潜在抗肿瘤活性。基本上如上所详述来完成研究。简要来说，用LLC1细胞皮下接种小鼠，并且随后用对照大鼠IgG、9F8或46A9抗体(以每只小鼠150μg的剂量)在接种之后第5、7和9天注射。在第11天，处死动物。在整个研究过程期间测量肿瘤体积，并且将结果绘图。如图3的图中所示，研究说明相对于对照抗体治疗，9F8抗体与46A9抗体两者均能够显著抑制肿瘤生长。
完成其它研究以评估9F8和46A9抗体对肿瘤血管形成的影响。对于这些研究，从暴露于9F8、46A9或对照抗体的肿瘤收集组织切片。将组织切片标记以检测作为血管形成标志物的PECAM-1。定量PECAM阳性组织区域的比例，并且结果呈现于图4A的图中。类似地，肿瘤组织切片用DAPI染色并进行免疫荧光标记以检测PECAM-1和α-SMA来确定治疗的肿瘤组织中的周细胞覆盖率。将组织中α-SMA+区域比例和α-SMA+周细胞覆盖率绘图，并且显示于图4B中。因此，这些研究说明两种研究的抗Olfml-3抗体均能够显著降低如用PECAM-1表达和周细胞覆盖率所量度的肿瘤组织血管形成。
表1.抗体序列。
实施例3-用46A9BO抗Olfml-3单克隆抗体进行的毒性研究
为评估抗Olfml-3单克隆抗体的潜在毒性，用高剂量(750μg)46A9BO或作为对照的总体大鼠IgG注射小鼠。在处理之后，处死小鼠，并且使其经受病理性分析。使染色的器官组织切片经受显微检查以检测任何毒性征象。当在46A9BO处理的动物与对照之间比较肺、肝、心脏或肾组织切片时，未见组织构造差异。因此，即使在高剂量下施用时，抗Olfml-3单克隆抗体在鼠类模型系统中也不展现可检测的毒性。
实施例4-用9F8BO和46A9BO抗Olfml-3单克隆抗体进行人组织染色
进一步研究抗Olfml-3单克隆抗体用于对人组织进行免疫荧光(IF)染色的有效性。使用抗Olfml-3单克隆抗体和针对VE-钙粘着蛋白的抗体，单独或组合地观察冷冻人组织切片。举例来说，正常乳房组织相对于转移性导管乳腺癌(样品H14003743)的IF研究显示肿瘤组织中的9F8标记被显著增强，此与VE表达基本上相一致。同样，正常组织相对于子宫上皮和平滑肌癌肉瘤肿瘤(样品H14003537)的IF研究显示肿瘤组织中的9F8标记被显著增强，再次与VE表达基本上相一致。用46A9抗体进行的进一步IF研究也显示相对于正常组织，人结肠腺癌切片(样品H14002691)中的46A9染色被显著增加。这些组织中的46A9与VE-钙粘着蛋白染色基本上相一致。
***
本文公开和要求保护的所有方法都可鉴于本公开在不进行过度实验下进行和执行。尽管本发明的组合物和方法已关于优选实施方案加以描述，但将对本领域技术人员明显的是可在不脱离本发明的构思、精神和范围下对本文所述的方法以及在方法的步骤方面或在步骤的顺序方面应用变化。更具体来说，将明显的是在化学与生理两方面均相关的某些试剂可替代本文所述的试剂，同时将获得相同或类似结果。对本领域技术人员明显的所有所述类似替代物和修改都被视为在如由随附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。
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Claims (45)

1.一种分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
(a)与46A9BO的VHCDR1(SEQIDNO：7)、9F8BO的VHCDR1(SEQIDNO：21)或Z14A7的VHCDR1(SEQIDNO：13)至少80％同一的第一VHCDR；
(b)与46A9BO的VHCDR2(SEQIDNO：8)、9F8BO的VHCDR2(SEQIDNO：22)或Z14A7的VHCDR2(SEQIDNO：14)至少80％同一的第二VHCDR；
(c)与46A9BO的VHCDR3(SEQIDNO：9)、9F8BO的VHCDR3(SEQIDNO：23)或Z14A7的VHCDR3(SEQIDNO：15)至少80％同一的第三VHCDR；
(d)与46A9BO的VLCDR1(SEQIDNO：10)、9F8BO的VLCDR1(SEQIDNO：24)或Z14A7的VLCDR1(SEQIDNO：16)至少80％同一的第一VLCDR；
(e)与46A9BO的VLCDR2(SEQIDNO：11)、9F8BO的VLCDR2(SEQIDNO：25)或Z14A7的VLCDR2(SEQIDNO：17)至少80％同一的第二VLCDR；以及
(f)与46A9BO的VLCDR3(SEQIDNO：12)、9F8BO的VLCDR3(SEQIDNO：26)或Z14A7的VLCDR3(SEQIDNO：18)至少80％同一的第三VLCDR。
2.如权利要求1所述的分离抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQIDNO：7至少80％同一的第一VHCDR；
(b)与SEQIDNO：8至少80％同一的第二VHCDR；
(c)与SEQIDNO：9至少80％同一的第三VHCDR；
(d)与SEQIDNO：10至少80％同一的第一VLCDR；
(e)与SEQIDNO：11至少80％同一的第二VLCDR；以及
(f)与SEQIDNO：12至少80％同一的第三VLCDR。
3.如权利要求2所述的分离抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQIDNO：7同一的第一VHCDR；
(b)与SEQIDNO：8同一的第二VHCDR；
(c)与SEQIDNO：9同一的第三VHCDR；
(d)与SEQIDNO：10同一的第一VLCDR；
(e)与SEQIDNO：11同一的第二VLCDR；以及
(f)与SEQIDNO：12同一的第三VLCDR。
4.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
(a)与9F8BO的VHCDR1(SEQIDNO：21)至少80％同一的第一VHCDR；
(b)与9F8BO的VHCDR2(SEQIDNO：22)至少80％同一的第二VHCDR；
(c)与9F8BO的VHCDR3(SEQIDNO：23)至少80％同一的第三VHCDR；
(d)与9F8BO的VLCDR1(SEQIDNO：24)至少80％同一的第一VLCDR；
(e)与9F8BO的VLCDR2(SEQIDNO：25)至少80％同一的第二VLCDR；以及
(f)与9F8BO的VLCDR3(SEQIDNO：26)至少80％同一的第三VLCDR。
5.如权利要求4所述的分离抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQIDNO：21同一的第一VHCDR；
(b)与SEQIDNO：22同一的第二VHCDR；
(c)与SEQIDNO：23同一的第三VHCDR；
(d)与SEQIDNO：24同一的第一VLCDR；
(e)与SEQIDNO：25同一的第二VLCDR；以及
(f)与SEQIDNO：26同一的第三VLCDR。
6.如权利要求1所述的分离抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQIDNO：13至少80％同一的第一VHCDR；
(b)与SEQIDNO：14至少80％同一的第二VHCDR；
(c)与SEQIDNO：15至少80％同一的第三VHCDR；
(d)与SEQIDNO：16至少80％同一的第一VLCDR；
(e)与SEQIDNO：17至少80％同一的第二VLCDR；以及
(f)与SEQIDNO：18至少80％同一的第三VLCDR。
7.如权利要求6所述的分离抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQIDNO：13同一的第一VHCDR；
(b)与SEQIDNO：14同一的第二VHCDR；
(c)与SEQIDNO：15同一的第三VHCDR；
(d)与SEQIDNO：16同一的第一VLCDR；
(e)与SEQIDNO：17同一的第二VLCDR；以及
(f)与SEQIDNO：18同一的第三VLCDR。
8.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
(i)与46A9BO的VH结构域(SEQIDNO：1)至少约80％同一的VH结构域和与46A9BO的VL结构域(SEQIDNO：2)至少约80％同一的VL结构域；
(i)与9F8BO的VH结构域(SEQIDNO：19)至少约80％同一的VH结构域和与9F8BO的VL结构域(SEQIDNO：20)至少约80％同一的VL结构域；或
(iii)与Z14A7的VH结构域(SEQIDNO：3)至少约80％同一的VH结构域和与Z14A7的VL结构域(SEQIDNO：4)至少约80％同一的VL结构域。
9.如权利要求8所述的抗体，其中所述抗体包含与46A9BO的所述VH结构域(SEQIDNO：1)同一的VH结构域和与46A9BO的所述VL结构域(SEQIDNO：2)同一的VL结构域。
10.如权利要求8所述的抗体，其中所述抗体包含与9F8BO的所述VH结构域(SEQIDNO：19)同一的VH结构域和与9F8BO的所述VL结构域(SEQIDNO：20)同一的VL结构域。
11.如权利要求8所述的抗体，其中所述抗体包含与Z14A7的所述VH结构域(SEQIDNO：3)同一的VH结构域和与Z14A7的所述VL结构域(SEQIDNO：4)同一的VL结构域。
12.如权利要求8所述的抗体，其中所述抗体是46A9BO、9F8BO或Z14A7抗体。
13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是重组的。
14.如权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。
15.如权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。
16.如权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或去免疫抗体。
17.如权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体被缀合于显像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。
18.一种组合物，其包含于药学上可接受的载体中的如权利要求1至17中任一项所述的抗体。
19.一种分离的多核苷酸分子，其包含编码如权利要求1至16中任一项所述的抗体的核酸序列。
20.一种包含抗体VH结构域的重组多肽，所述抗体VH结构域包含46A9BO的VH结构域的CDR1-3(SEQIDNO：7、8和9)；9F8BO的VH结构域的CDR1-3(SEQIDNO：21、22和23)；或Z14A7的VH结构域的CDR1-3(SEQIDNO：13、14和15)。
21.一种包含抗体VL结构域的重组多肽，所述抗体VL结构域包含46A9BO的VL结构域的CDR1-3(SEQIDNO：10、11和12)；9F8BO的VL结构域的CDR1-3(SEQIDNO：24、25和26)；或Z14A7的VL结构域的CDR1-3(SEQIDNO：16、5和6)。
22.一种分离的多核苷酸分子，其包含编码如权利要求20或21所述的多肽的核酸序列。
23.一种宿主细胞，其包含一种或多种编码如权利要求1至12中任一项所述的抗体或如权利要求20或21所述的重组多肽的多核苷酸分子。
24.如权利要求23所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。
25.一种制造抗体的方法，其包括：
(a)在细胞中表达一种或多种编码如权利要求1至12中任一项所述的抗体的VL和VH链的多核苷酸分子；以及
(b)从所述细胞纯化所述抗体。
26.一种治疗受试者的血管生成相关病状的方法，其包括向所述受试者施用有效治疗所述血管生成相关病状的量的根据权利要求1至17中任一项所述的抗体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述血管生成相关病状包括癌症。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤、转移性肿瘤或非转移性肿瘤。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈部癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体被全身性施用。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体被静脉内、皮内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用。
32.如权利要求26所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少第二抗癌疗法。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
34.如权利要求26所述的方法，其中所述血管生成相关病状是眼部新血管形成、动静脉畸形、冠脉再狭窄、外周血管再狭窄、肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、胰腺炎、肠病、缺血性心血管病变或慢性炎性疾病。
35.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
36.一种包含根据权利要求1至17中任一项所述的抗体的组合物，其用于治疗受试者的血管生成相关病状。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述血管生成相关病状包括癌症。
38.如权利要求37所述的组合物，其中所述癌症是实体肿瘤、转移性肿瘤或非转移性肿瘤。
39.如权利要求37所述的组合物，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈部癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
40.如权利要求36所述的组合物，其中所述组合物用于全身性施用。
41.如权利要求36所述的组合物，其中所述组合物被配制以静脉内、皮内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用。
42.如权利要求36所述的组合物，其进一步包含至少第二抗癌剂。
43.如权利要求36所述的组合物，其中所述血管生成相关病状是眼部新血管形成、动静脉畸形、冠脉再狭窄、外周血管再狭窄、肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、胰腺炎、肠病、缺血性心血管病变或慢性炎性疾病。
44.如权利要求36所述的组合物，其中所述受试者是人受试者。
45.一种根据权利要求1至17中任一项所述的抗体的用途，其用于制造用以治疗血管生成相关病状的药剂。
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