CN105598465B - 荧光金纳米颗粒的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荧光金纳米颗粒的制备方法和应用。荧光金纳米颗粒的制备：以体积份数计，将0.2‑1.0份100mmol/L N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸水溶液、0.2‑1.0份100mmol/L 氯金酸水溶液和0.5‑5.0份体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌1‑60min，然后向上述混合液中加入3.8‑8.3份的超纯水，搅拌并在加热温度为50‑90℃，回流2‑48h，待冷却后取出，透析干燥后，得到荧光金纳米颗粒。本发明制备工艺简单，避免了毒性较大的还原剂硼氢化钠的使用，反应条件简单，对环境友好，所制得的金纳米颗粒荧光量子产率高、Stocks位移值大，荧光寿命长，稳定性好，可用于汞离子的检测和细胞成像。

Description

荧光金纳米颗粒的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及金纳米颗粒的制备，特别涉及一种核壳型的水溶性荧光金纳米颗粒的制备方法和应用。
背景技术
重金属污染对生态环境的危害日益加剧，重金属中毒的现象屡见不鲜，各种重金属正毒害着人类的身心，尤其是Hg、Pb、Cd和Cu的危害不容忽视，虽然环境中重金属离子的浓度不大，但是一旦它们被释放到环境后，不易被去除，在环境中长期累积，直接或间接地对人类的健康和各种生物的生存造成了威胁。因此研发出一种新型的、操作简便的、样品易处理的方法成为分析化学领域的一个热点。此外，生命科学的迅速发展还要求人们从单细胞和单分子水平上原位、活体、实时地了解物质之间的相互作用以及生命的过程。近年来新兴的单分子光学成像技术以其高的灵敏度和分辨率正好适应这一发展的要求。理想的光学探针应该具有信号强、稳定，不易发生光漂白、能够与宿主分子可控结合和化学惰性等特点。纳米材料由于其独特的光学特性、良好的生物相容性、长期稳定性、容易修饰以及良好的光学可调性等优点，在生物传感、细胞成像及癌症治疗等生物化学方面得到了广泛应用。我们之前报道的工作中(Analytical Chemistry,2009,81(4),1676–1695；分析科学学报,2013，29(5)：599-604.)以N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯金酸为反应物，甲醇/冰醋酸为溶剂制备金纳米颗粒时，需加入强还原剂硼氢化钠将氯金酸中的三价金还原为零价金，再生成金纳米颗粒，反应需分步进行，且反应中用到的强还原剂硼氢化钠强烈刺激粘膜、上呼吸道、眼睛及皮肤，吸入后可因喉和支气管的痉挛、炎症和水肿，化学性肺炎和肺水肿而致死，毒性较大。而且制得的金纳米颗粒荧光量子产率和荧光寿命短，限制了其使用范围。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种荧光金纳米颗粒的制备方法，该方法工艺简单，避免使用毒性较大的还原剂硼氢化钠，所制得的金纳米颗粒荧光量子产率高、荧光寿命长。
为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种荧光金纳米颗粒的制备方法，包括步骤：以体积份数计，将0.2-1.0份100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.2-1.0份100mmol/L氯金酸水溶液和0.5-5.0份体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液混合，搅拌1-60min，然后向上述混合液中加入3.8-8.3体积份的超纯水，搅拌并在加热温度为50-90℃，回流2-48h，待冷却后取出，透析干燥后，得到荧光金纳米颗粒。
作为优选的方案，以体积份数计，将0.4-0.6份100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.4-0.6份100mmol/L氯金酸水溶液和1-3份体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液混合，搅拌15-40min，向上述混合液中加入6-8体积份的超纯水，搅拌并在加热温度为60-80℃，回流12-36h。
作为更优选的方案，本发明提供的方法是将0.6mL 100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.4mL 100mmol/L氯金酸水溶液和2.0mL体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌30min，然后向上述混合液中加入7.0mL的超纯水，搅拌并在加热温度为70℃，回流24h。
本发明制得的荧光金纳米颗粒可以在汞离子的检测中应用，也可以在细胞成像中应用。
与现有技术相比，本发明采用天然的生物分子N-乙酰基-L-半胱氨酸为还原剂及配体保护剂制备了一种具有良好生物相容性的核壳型水溶性荧光纳米颗粒。本发明避免了毒性较大的还原剂硼氢化钠的使用，反应条件简单，所得的荧光金纳米颗粒具有较大的Stocks位移，荧光发射峰在590nm左右，在紫外灯光下，以黑色背景观察时，呈现强烈的橙色荧光，荧光量子产率可达14％，室温保存稳定性可达6个月以上。
本发明制得的荧光金纳米颗粒探针对汞离子显示了高的灵敏性和选择性，可应用于汞离子的检测，检测限为0.2nM。此外，该水相合成的金纳米颗粒具有良好的生物相容性，高亮度及不闪烁的特征可作为较好的荧光探针用于单分子检测及生物成像领域。通过结合激光共聚焦扫描显微技术，获取了该新型荧光纳米颗粒在活细胞内的荧光成像，发展了基于纳米粒子探针的光学成像新方法以实现高灵敏、稳定、快速的生物成像。
附图说明
图1是实施例6荧光金纳米颗粒的透射电子显微镜图。
图2是实施例6荧光金纳米颗粒的紫外吸收光谱及荧光激发和发射光谱。
图3是实施例6荧光金纳米颗粒的光稳定性图。
图4是对比例荧光金纳米颗粒的紫外吸收光谱及荧光激发和发射光谱。
图5是实施例6荧光金纳米颗粒对汞离子响应的工作曲线。
图6是实施例6荧光金纳米颗粒同各种金属离子作用后的荧光柱状图。
图7是实施例6荧光金纳米颗粒的细胞成像图。
具体实施方式
实施例1
将0.2mL 100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、1.0mL 100mmol/L氯金酸水溶液和5.0mL体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌60min，然后向上述混合液中加入3.8mL的超纯水，搅拌并在加热温度为90℃，回流48h，待冷却后取出，透析干燥后，得到荧光金纳米颗粒。该金纳米颗粒的荧光发射峰在550nm左右，Stocks位移为150nm，在紫外灯光下，以黑色背景观察时，呈现强烈的黄橙色荧光，量子产率为1.0％，荧光寿命为0.7μs。
实施例2
将0.4mL 100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、1.0mL 100mmol/L氯金酸水溶液和4.0mL体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌50min，然后向上述混合液中加入4.6mL的超纯水，搅拌并在加热温度为80℃，回流36h，待冷却后取出，透析干燥后，得到荧光金纳米颗粒。该金纳米颗粒的荧光发射峰在560nm左右，Stocks位移为170nm，在紫外灯光下，以黑色背景观察时，呈现强烈的黄橙色荧光，量子产率为2.5％，荧光寿命为1.5μs。
实施例3
将0.4mL 100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.6mL 100mmol/L氯金酸水溶液和3.0mL体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌40min，，然后向上述混合液中加入6.0mL的超纯水，继续搅拌并在加热温度为70℃，回流36h，待冷却后取出，透析干燥后，得到荧光金纳米颗粒。该金纳米颗粒的荧光发射峰在590nm左右，Stocks位移为250nm，在紫外灯光下，以黑色背景观察时，呈现强烈的橙色荧光，量子产率为6.0％，荧光寿命为6.3μs。
实施例4
将1.0mL 100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.4mL 100mmol/L氯金酸水溶液和1.0mL体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌15min，然后向上述混合液中加入7.6mL的超纯水，搅拌并在加热温度为60℃，回流12h，待冷却后取出，透析干燥后，得到荧光金纳米颗粒。该金纳米颗粒的荧光发射峰在600nm左右，Stocks位移为250nm，在紫外灯光下，以黑色背景观察时，呈现强烈的橙红色荧光，量子产率为8.0％，荧光寿命为3.9μs。
实施例5
将1.0mL 100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.2mL 100mmol/L氯金酸水溶液和0.5mL体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌1min，然后向上述混合液中加入8.3mL的超纯水，搅拌并在加热温度为50℃，回流2h，待冷却后取出，透析干燥后，得到荧光金纳米颗粒。该金纳米颗粒的荧光发射峰在610nm左右，Stocks位移为250nm，在紫外灯光下，以黑色背景观察时，呈现强烈的橙红色荧光，量子产率为5.0％，荧光寿命为2.4μs。
实施例6
将0.6mL 100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.4mL 100mmol/L氯金酸水溶液和2.0mL体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌30min，然后向上述混合液中加入7.0mL的超纯水，搅拌并在加热温度为70℃，回流24h，待冷却后取出，透析干燥后，得到荧光金纳米颗粒。将该金纳米颗粒配置成0.1mg/mL的水溶液，滴于附有碳膜的铜网上，真空干燥后进行测试，测得荧光金纳米颗粒的粒径<2nm，如图1。把2mL的PBS缓冲液(10mmol/L)体系和200μL金纳米荧光颗粒溶液加到荧光比色皿中，测定其紫外吸收光谱及荧光激发和发射光谱，如图2所示，该金纳米颗粒的荧光发射峰在590nm左右，Stocks位移为250nm，在紫外灯光下，以黑色背景观察时，呈现强烈的橙色荧光，量子产率为14％，荧光寿命为8.5μs。将该荧光金纳米颗粒水溶液室温放置，定期检测其在590nm处的荧光强度，如图3所示，6个月后荧光强度值基本保持不变，说明该荧光金纳米颗粒对外界空气、溶液体系等具有很好的光稳定性。
对比例
本实施例作为对比实施例，与实施例6进行对比，结果如表1所示。
以疏基化合物N-乙酰基-L-半胱氨酸为配体，通过NaBH4还原HAuCl4·3H2O合成了单层配体修饰的金纳米颗粒。具体步骤如下：
称取2.27g NAC，溶解于100mL体积比为6:1的甲醇-冰醋酸混合液中。称取1.82gHAuCl4，溶解于100mL体积比为6:1的甲醇-冰醋酸混合液中。将氯金酸溶液转移至500mL的圆底烧瓶中，冰浴搅拌下向其中加入配置好的NAC甲醇-冰醋酸溶液，当溶液由金黄色变为橙色并有一些白色悬浮物时，一次性快速加入45mL含NaBH4(3.5g)的乙醇超声分散溶液，反应30min，加入200mL丙酮停止反应，离心收集沉淀。用适量水和丙酮将上述沉淀物反复溶解、沉淀并离心洗涤，再用透析膜透析以除去溶液中存在的杂质离子，干燥后得到金纳米颗粒。将该金纳米颗粒配置成0.1mg/mL的水溶液，把2mL的PBS缓冲液(10mmol/L)体系和200μL金纳米颗粒储备液加到荧光比色皿中，测定其紫外吸收光谱及荧光激发和发射光谱，如图4所示，该金纳米颗粒的荧光发射峰在740nm左右，在紫外灯光下，以黑色背景观察时，呈现暗红色荧光，量子产率为0.01％，荧光寿命为305ns。
表1
实施例7
将实施例6制备的金纳米颗粒配置成0.1mg/mL的水溶液，把2mL的PBS缓冲液(10mmol/L)体系和200μL金纳米荧光探针储备液加到荧光比色皿中，分别加入不同浓度的汞离子，以340nm为激发波长，测定其荧光光谱。随着汞离子浓度的增大，金纳米颗粒的荧光逐渐被猝灭，如图5所示，荧光强度的变化与汞离子的浓度呈现性关系，如图5插图所示，图中荧光强度的变化以F0/F表示，其中F0和F分别表示汞离子不存在和存在下金纳米颗粒的荧光强度，汞离子的检测限为2×10-10nmol/L。通过线性拟合得到了金纳米颗粒的回归方程为：Y＝1.25+0.00089X，线性系数为R2＝0.998，基于此该荧光金纳米颗粒可应用于各种水域如湖水、自来水、河水中汞离子的检测。
实施例8
将实施例6制备的金纳米颗粒配置成0.1mg/mL的水溶液，把2mL的PBS缓冲液(10mmol/L)体系和200μL金纳米荧光探针储备液加到荧光比色皿中，再分别加入Hg2+与其它的共存离子(共存离子浓度是汞离子的100倍)K+,Na+,Li+,Zn2+,Mn2+,Ba2+,Ca2+,Cu2+,Cd2+,Mg2+,Pb2+,Br-,F-,NO3 -,SO4 2-,C2O4 2-,B4O7 2-,CO3 2-，以340nm为激发波长，分别测其荧光光谱，绘制不同离子对应590nm处荧光强度的柱状图，见图6。经实验证明，其它离子不干扰体系对汞离子的检测。
实施例9
将实施例6制备的金纳米颗粒配置成0.2mg/mL的水溶液，。取上述100μL荧光金纳米颗粒溶液加入含有贴壁细胞的培养基，置于37℃的5％CO2培养箱中孵育2h后，用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)轻轻清洗三次，以除去培养基中过量的未进入细胞的金纳米颗粒溶液。将细胞固定后在奥林巴斯FV1000激光共聚焦显微镜下，通过线性扫描进行荧光成像(40倍物镜)。分别用波长为405nm的激光激发，收集发射波段为530-630nm的橙色荧光。如图7，金纳米颗粒探针在共聚焦荧光成像仪下显示强的橙色荧光。荧光金纳米颗粒具有很好的细胞膜穿透性，可应用于膀胱癌细胞成像的检测。

Claims (4)

1.一种荧光金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，以体积份数计，将0.4-0.6份100mmol/L N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.4-0.6份100mmol/L氯金酸水溶液和1-3份体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液混合，搅拌15-40min，向上述混合液中加入6-8体积份的超纯水，搅拌并在加热温度为60-80℃，回流12-36h。
2.如权利要求1所述的荧光金纳米颗粒制备方法，其特征在于，是将0.6mL 100mmol/LN-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液、0.4mL 100mmol/L氯金酸水溶液和2.0mL体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶液，搅拌30min，然后向上述混合液中加入7.0mL的超纯水，搅拌并在加热温度为70℃，回流24h。
3.如权利要求1或2所述方法制得的荧光金纳米颗粒在汞离子的检测中应用。
4.如权利要求1或2所述方法制得的荧光金纳米颗粒在细胞成像中应用。
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