CN105594598A - 一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法，该方法以扬麦14成熟胚为材料，在诱导培养基中，25±1℃，暗培养，10天为继代周期的条件下，继代1-3次获得具有较高再生率的胚性愈伤组织。本发明以扬麦14成熟胚为实验对象，诱导培养基(MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L？2，4-D+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝胶，PH5.8)为培养条件，25±1℃，10天为继代周期，对扬麦14成熟胚诱导继代培养。结果发现继代1-3次胚性愈伤组织生成率和再生率均保持上升趋势；继代次数超过5次则抑制扬麦14成熟胚胚性愈伤组织的再生能力。

Description

一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法

技术领域

本发明属于作物遗传育种和植物组织培养领域，具体涉及成熟胚体外继代诱导胚性愈伤组织的方法。

背景技术

1.小麦的育种目标

小麦(Triticumaestivum)是世界主要粮食作物之一，其产量和品质关系到社会经济生活。随着人口增加以及国家经济的发展，需要更多的粮食满足人们的生活需求。但是水土流失导致农田不断减少以及全球气候变暖使得近几年的粮食产量增长并不明显。据相关数据分析，分析近几年的全球小麦单产，发现小麦单产不稳定，且增幅较小，小麦的增产已经成为人们关注的问题之一。

面对如此大的挑战，任何可以提高粮食产量的方法都值得去利用。针对粮食作物品种改良，人们主要采取传统育种和转基因的方式。两者的本质区别是：前者通过去雄杂交促进亲本基因组的变异，后期以优良性状为指标，利用田间试验，筛选获得所需优良性状的小麦品种。利用转基因技术引起植物基因定向变异并产生优良性状，相比于传统杂交育种，转基因技术可打破生殖隔离，进一步扩大植物基因变异的范围。植物组织培养是小麦转基因技术的关键，传统育种在自然条件下进行，所以周期长、受气候环境影响大。转基因技术利用组织培养，整个过程可在培养箱和温室进行，有效避免环境因素的影响。转基因技术主要包括：基因克隆、目的基因功能鉴定、目的基因插入植物基因组并通过生理鉴定获得品种改良并具有商业价值的植株。植物基因组插入外源基因的方法有基因枪法和农杆菌转化法和花粉管通道法等。

2.小麦转化方法

小麦为异源六倍体植物、基因组大、基因调控困难，同时小麦外植体所诱导的愈伤组织普遍存在愈伤胚性差、分化率低、转化细胞再生困难等问题，是举世公认的最难转化的栽培作物。科学家通过各种方法实现对小麦的转化，但目前最主要的小麦转化技术是基因枪法和农杆菌介导。世界第一株转基因小麦是Vasil在1992年通过基因枪法将gus、bar基因导入小麦品种Pavon。1997年Cheng首次利用农杆菌介导法将GUS和nptⅡ转入了小麦。除了基因枪和农杆菌介导法，花粉管通道法、显微注射法、激光微束穿刺法、PEG法和电击法等也受到越来越多的关注。

3.小麦愈伤组织诱导：

根据christy在1987年对小麦组织培养形成愈伤组织分类，可将其分为3类：胚性愈伤组织(E)、非胚性愈伤组织(NE)和可转化成胚性愈伤组织的光滑紧致愈伤(SC)。E型愈伤颜色呈白色或淡黄色,有光泽，结节状,一触易碎成颗粒状，细胞球形状；NE型愈伤易碎，颜色呈褐色或者灰色；SC型愈伤主要特征是光滑紧致，而且具有很强的增生能力，可转化为E型愈伤。成熟胚的E型愈伤主要是从SC型愈伤组织转化而来，小麦幼胚的胚性愈伤组织可直接从胚诱导出E类愈伤。另外小麦的胚相比于其它组织，SC型愈伤比率更高，这也一方面说明用小麦胚作为外植体的优势。胚状体可以直接由单个细胞分化成完整植株、生命力旺盛，大大缩短成苗周期。

4.胚性愈伤组织诱导：

胚性愈伤组织即植物体细胞胚状体的形成主要通过两个途径：染色体上参与染色质模型重建基因突变引起与胚发育相关基因的异常的过表达，已分化的细胞通过形成感受态细胞形式变成脱分化细胞，最终形成胚状体；另一方面，在体外培养条件下，植物细胞与周围组织经过切割形成生理隔离，同时培养环境中的外在生长因子对植物细胞造成生长压力，促进细胞内源生长因子的改变，细胞经过植物干细胞的形式间接实现体细胞胚状体生成。植物转基因技术主要是利用第二种方式获得愈伤组织。

从生理角度可以将胚状体的体外诱导分为四个阶段：第一阶段,体外植物激素将植物组织诱导形成愈伤组织；第二阶段,经过一段时间外源因子作用，愈伤组织形成球形胚；第三阶段,球形胚转化为鱼雷形胚；第四阶段,鱼雷形胚逐渐发育成熟,最终进人发芽阶段；

5.影响胚性愈伤组织诱导因素：

5.1基因型不同品种由于基因型不一样会影响产生胚性愈伤能力，这在小麦、水稻和玉米等植物的组织培养过程中，均可发现。明凤等在2000年对辽10、7742、7757、新克旱9和Roblin小麦继代后，统计生成胚性愈伤组织比率，辽10小麦在接种414天后，78％的胚性愈伤组织生成，而新克旱9愈伤组织已经褐化。2005年高武军等以6种玉米自交系为材料，发现基因型对玉米胚性愈伤组织生成启着显著影响，GY237的胚性愈伤诱导率达到71.3％，而农艺性状较好的材料却很难诱导出胚性愈伤。同样，刘书梅等2011年发现籼稻品种龙特普较梗稻品种日本晴更容易诱导出结构紧密，颜色鲜黄的胚性愈伤组织。

5.2外植体类型许雪梅等2009年以红皮云杉未成熟胚的不同部位为材料，研究其对胚性愈伤组织诱导的影响。结果发现不同部位的外植体对胚性愈伤诱导有很大的影响，全胚和胚轴上部的诱导率最高分别达81.27％和75.96％。

5.3培养基成分培养基不仅为植物细胞体外培养提供营养物质，也为细胞的脱分化、再分化提供外源诱导因子和压力。植物脱分化时期主要受生长素和细胞分裂素的作用，所以对于胚性愈伤组织的生成，激素的调节是关键之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法。

本发明所述的方法，是在诱导培养基(MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝胶，PH5.8)，25±1℃，暗培养，10天为继代周期的条件下，继代1-3次可获得具有较高再生率的胚性愈伤组织。

通过对0到15天的愈伤组织进行称重，并绘制扬麦14愈伤组织相关的生长曲线图，确定愈伤组织在培养到10天，适合更换培养基。以同样的诱导培养基继代1至3次，愈伤组织的质量不断提高，并且出现再生能力强的胚性愈伤组织。继代超过3次后，愈伤组织的再生能力明显受到抑制。本发明的目的是提供一种有利于小麦成熟胚长期继代培养的诱导培养基。

小麦成熟胚长期继代获得的胚性愈伤组织，具有较高的再生能力，是遗传转化的好材料。为了在不影响愈伤的再生能力的情况下，进一步获得更多胚性愈伤组织并延长胚性愈伤组织的保存时间，本发明通过正交实验设计筛选出最有利于小麦成熟胚长期继代培养的诱导培养基。以L-脯氨酸、水解酪蛋白以及2，4-D为影响因素，分别设置3个浓度，共配置9种不同组合的培养基，切取同样大小的扬麦14成熟胚并分别置于9种培养基，实验重复3次。继代5次后，每种培养基的所有愈伤组织均分别转移同样的分化培养基上，统计愈伤的绿点率以及出苗情况。最终以绿点率为标准，分析各个因素的贡献率，以及各因素最佳组合。

本发明通过正交试验确定的最优培养基，是MS+L-脯氨酸700mg/L+酪蛋白水解物1000mg/L+2，4-D2mg/L+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝胶，PH5.8。该培养基诱导的愈伤组织在长期继代的情况下，愈伤组织仍保持淡黄的颜色，而且愈伤组织增长较快；长期继代后，其它培养基诱导的愈伤组织再生能力受到抑制，均未出苗，而最优培养基的愈伤组织再生率最高达到6.7％。

利用本发明的方法对扬麦14成熟胚诱导继代培养。结果发现继代1-3次胚性愈伤组织生成率和再生率均保持上升趋势；继代次数超过5次则抑制扬麦14成熟胚胚性愈伤组织的再生能力。

附图说明

图1小麦成熟胚诱导愈伤组织生长曲线图。注：横坐标是愈伤组织培养的时间，测试点分别选取0、3、6、9、12、15天。纵坐标是单个愈伤组织平均重量

图2小麦成熟胚愈伤组织诱导(0至15天)体式显微镜照图。注：图中分别是愈伤组织在0、3、6、9、12、15天的形态，图片是由体视显微镜拍摄。

具体实施方式

实施例：

一.实验材料

供试品种：保存一年扬麦14的种子(购买于江苏金土地种业有限公司)

培养基：愈伤组织诱导组成为MS基本培养基(具体成分见表1)、30g/L蔗糖、2.6g/L植物凝胶，2mg/L2，4－D、500mg酪蛋白水解物(表2)。分化培养基由MS基本培养基、30g/L蔗糖、2.6g/L植物凝胶、0.5mg/L激动素、2mg/L玉米素组成。所有培养基PH均为5.8。

表1.

二.实验方法

1.制作成熟胚愈伤组织生长曲线确定继代周期

取实验室上一年保存的扬麦14的种子，挑选籽粒饱满的小麦种子，置于灭完菌干净的三角瓶。经75％酒精灭菌5min后，用0.1％升汞浸泡30min，最后用灭菌水冲洗3～5遍。超净工作台上用解剖刀拨取直径直径1mm大小的幼胚，盾片朝上接种至愈伤诱导培养基上(MS基本培养基，添加500mg/L酪蛋白水解物以及2mg/L2，4-D)，诱导培养基每皿接种30个。(25±1)℃暗培养，分别在0至15天内，每隔3天取出30个愈伤组织置于干净的吸水纸上，去除多余愈伤组织表面沾有的培养基，并称取总重求得平均单个愈伤组织重量。每次处理共重复3次取平均值，作生长曲线图并拍照。

2.确定继代次数

扬麦14成熟胚材料处理按照2.1进行，每皿放置30个。按照1步骤中确定的继代周期范围，愈伤组织分别在继代1至5次后，转移置分化培养基，每个三角瓶接种15个愈伤组织，每个处理重复4次，共60个愈伤组织，25±1℃光照培养一个月后统计出苗率。

三.结果与分析

数据处理公式：

3.1扬麦14成熟胚愈伤组织生长曲线以及确定最佳继代周期

从图1中可以看到0-9天，愈伤组织生长旺盛，9天以后逐步趋于平缓，此时生长缓慢可能受到培养基激素或者营养物质缺乏影响；0-15内的愈伤组织整体颜色呈现白色偏黄且结构紧致，如图2所示，所以选择9至15天更换培养基比较合适。(扬麦14成熟胚愈伤生长图见图2)

1.2确定继代次数对小麦成熟胚诱导影响

表2小麦愈伤组织继代后出苗统计表(n＝60)

从表2中可以得到：随着继代次数的上升，胚性愈伤组织的比率不断上升。在一定范围内，本实验培养基诱导的小麦成熟胚胚性愈伤组织随着继代次数的增加，出苗率不断上升；当继代次数达到4次以上，胚性愈伤组织的出苗率下降；继代5次时，出苗率为0％。继代实验的结果说明：扬麦14在本实验室诱导培养基上继代培养可以促进胚性愈伤组织的生成；但是继代4次以上后，胚性愈伤组织的再生率明显被抑制。

Claims (1)

1.一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法，其特征在于：以扬麦14成熟胚为材料，在诱导培养基中，25±1℃，暗培养，10天为继代周期的条件下，继代1-3次获得具有较高再生率的胚性愈伤组织；所述诱导培养基的组成为：MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝胶；培养基PH5.8。