CN105592845B - 拉帕酚f在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
提供了一种用于抑制肿瘤细胞生长的方法,所述方法包括向需要治疗的个体给药包括治疗有效量的拉帕酚F的组合物。还提供了包括拉帕酚F和药学上可接受的载体的组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013.05.07提交的美国临时申请NO.61/820,542的优先权,其公开通过引用引入本文。
背景技术
癌症在美国和世界范围内仍然是主要的健康问题。在美国,2012年诊断出估计新增超过150万预计新的癌症病例且癌症患者中有577190名死于癌症。癌症造成的死亡占美国全部死亡的近4/1。虽然增强的早期肿瘤诊断和管理显著提高患者的存活率,但仍然需要发展和发现新的抗癌疗法,因为有些患者对目前的抗癌药物表现出不敏感或治疗一段时间后出现抗药。
发明内容
本发明提供一种用于抑制肿瘤细胞生长的方法和组合物。如在本文中所用,术语肿瘤细胞和癌细胞可互换使用。在一个实施方式中,所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞。在另一个实施方式中,所述肿瘤细胞为血癌细胞(血液肿瘤细胞)。一方面,所述组合物包括药学上可接受的载体中的拉帕酚F。一方面,所述方法包括向个体给药包括治疗有效量的拉帕酚F的组合物。
附图说明
图1:A.拉帕酚F的化学结构。B和C.通过细胞菌落形成实验(B)证明的或相差显微镜检查(C)显示的拉帕酚F抑制各种组织类型中肿瘤细胞生长。所示细胞用拉帕酚F(50 μM)处理72小时或未用拉帕酚F(50μM)处理。D和E.3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)实验的结果显示拉帕酚F以时间依赖性方式和剂量依赖性方式抑制不同癌细胞株中的肿瘤细胞的生长。F和G.用拉帕酚F(50μM)对MCF10A非致癌性乳腺上皮细胞处理3天(F)或6天(G)。处理后,收集细胞进行MTT实验(G)或在相差显微镜(F)下拍摄照片。H.菌落形成实验的结果显示拉帕酚F通过A549(肺)、HCT116(结肠)和DU145(前列腺)肿瘤细胞抑制菌落形成。I-N.MTT实验的结果显示拉帕酚F抑制白血病细胞株、黑色素瘤细胞株和肉瘤细胞株中的细胞生长。
图2:拉帕酚F诱导G1和G2细胞周期阻滞。(A)对用溶剂(DMSO)或拉帕酚F(50 μM)处理72小时的细胞进行流式细胞仪细胞周期分析。(B)对用拉帕酚F(50μM)处理 72小时的RKO细胞进行DAPI染色。还显示出有丝分裂细胞相对于总细胞的数量(有丝分裂指数,MI)。
图3:拉帕酚F对关键细胞周期调节蛋白的调控。A-D.用溶剂(DMSO)或拉帕酚F(50μM)对指定细胞处理指定的时间且通过蛋白免疫印迹法分析不同的细胞周期调节蛋白的蛋白表达。“C”:溶剂处理的对照组。
图4:拉帕酚F对半胱天冬酶激活的影响。用溶剂(DMSO)或拉帕酚F(50μM)对指定细胞处理指定的时间。使用指定的抗体通过蛋白免疫印迹法分析半胱天冬酶8、9和3 (由半胱天冬酶原水平的降低来表示)的激活。“C”:溶剂处理的对照组。
图5:p21在拉帕酚F-介导的细胞周期蛋白B/CDK1下调和G2阻滞中的作用。(A和B)对拉帕酚F未处理(DMSO)或处理(拉帕酚F)的p21-精通(p21-proficient)(亲代的)和 p21-缺陷(p21基因敲除)的HCT116细胞进行细胞周期蛋白B和CDK1的蛋白表达分析(A);或在表达靶向p21转录的两个不同区域的任意序列shRNA或P21-特异性shRNA的细胞中分析细胞周期蛋白B和CDK1的蛋白表达(B)。C和D.表达任意序列shRNAi或两个不同的 p21shRNA的RKO细胞和MDA-MB-231细胞的细胞周期分析。细胞未经处理(DMSO)或用拉帕酚F(25μM)处理72小时,并通过流式细胞仪确定细胞周期谱图。
图6:拉帕酚F诱导野生型p53细胞和缺陷-p53的细胞中p21-启动子的激活。A和BMCF-7、MDA-MB-231和RKO细胞未经处理或用拉帕酚F(50μM)处理48小时;然后将细胞分成两部分;一部分用于通过Northern杂交分析p21mRNA表达(A)且另一部分用于通过蛋白免疫印迹法进行p21蛋白分析(B)。使用全长p21cDNA作为Northern杂交分析的探针。C和D.不同p53状态的拉帕酚F处理和未处理的细胞中p21启动子荧光素酶活性。 RKO细胞和MCF-7细胞表达野生型-p53蛋白而MDA-MB-231表达突变型-p53。HeLa细胞具有人乳头状瘤病毒;且p53蛋白在这些细胞中是非功能性的。转染了p21启动子荧光素酶构建体的细胞未经处理(DMSO)或用拉帕酚F(50μM)处理24小时,然后分析荧光素酶活性。
图7:拉帕酚F通过减少其半衰期抑制突变型-p53的表达。A-C.拉帕酚F对表达野生型p53的细胞(MCF-7和RKO)中的野生型p53蛋白表达具有最小的影响;然而拉帕酚F 大大减少了突变型-p53蛋白在MDA-MB-231、MDA-MB-468和T47D细胞中的表达(B和 C)。D和E.拉帕酚F的处理降低了MDA-MB-231细胞中突变型-p53蛋白的半衰期。首先用拉帕酚F(50μM)或未用拉帕酚F对细胞处理24小时,然后向细胞培养基中加入放线菌酮(50μg/ml)培养0-8小时并在加入放线菌酮后0、2、4、6和8小时收集细胞。对样品进行蛋白质印记分析并确定用拉帕酚F处理或未用拉帕酚F处理的细胞的突变型-p53的半衰期。F和G.拉帕酚F降低了T47D细胞中突变型-p53蛋白的半衰期。按所述确定突变型-p53 的半衰期。
图8:拉帕酚F下调通常在人类癌症中过度表达并与致癌性转化有关联的多种致癌蛋白的表达。A-C.拉帕酚F抑制c-Myc(A)、MDM2(B)和HuR(C)的表达。未对细胞进行处理(“C”)或用拉帕酚F(50μM)处理指定时间并使用指定的抗体进行蛋白质印迹分析。
图9:拉帕酚F对作为异种移植物的Hela肿瘤细胞的生长抑制作用。用溶剂或拉帕酚F (5毫克/千克/天或10毫克/千克/天)(静脉注射)对荷瘤小鼠处理15天。如在方法和材料中所述的对肿瘤尺寸、肿瘤体积和动物体重进行监测。结果表示为平均值±SEM。相比于拉帕酚F组,*P<0.05。B中所列照片显示取自未经处理(溶剂,N=7)或用拉帕酚F(5mg/kg, N=7;和10mg/kg,N=6)处理的小鼠的实际肿瘤。
具体实施方式
我们已经确定了拉帕酚F的抗肿瘤(抗癌)细胞增殖作用并证明了其在肿瘤细胞株中的细胞生长抑制活性和在动物模型中的肿瘤抑制活性。我们的结果表明拉帕酚F对代表包括结肠、乳腺、肺、宫颈、前列腺、白血病、黑色素瘤和肉瘤细胞的不同组织的多种肿瘤细胞株发挥强烈的生长抑制作用。
在一个实施方式中,本发明提供了用于抑制癌细胞生长的组合物和方法。所述组合物包括拉帕酚F。所述方法包括向个体给药治疗有效量的包括拉帕酚F的组合物。已知拉帕酚F 的结构。在图1A中还提供了拉帕酚F的结构。
在一个实施方式中,本发明提供了一种用于抑制实体肿瘤细胞生长的方法,所述方法包括向个体给药治疗有效量的包括拉帕酚F的组合物。在另一个实施方式中,本发明提供了一种用于抑制包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的血液肿瘤(血癌)细胞生长的方法,所述方法包括向个体给药治疗有效量的包括拉帕酚F的组合物。
不希望受任何特定理论的束缚,我们的研究表明拉帕酚F主要通过诱导G1和G2细胞周期阻滞介导其生长抑制作用。除了其对细胞周期调控的作用,拉帕酚F还触发一些肿瘤细胞株中细胞死亡。不同细胞株响应于拉帕酚F处理的细胞周期谱图并不相同,比如,MCF-7细胞主要在G1被阻滞而RKO和MDA-MB-231细胞主要在G2被阻滞。拉帕酚F调控一些关键的细胞周期调节因子(p21、p27、细胞周期蛋白B和CDK1和CDK2)的表达(图3)。拉帕酚F诱导的p21和p27的诱导以及CDK1的抑制可足以阻止从G1到S的细胞周期进程。同样地,CDK1和细胞周期蛋白B的强烈抑制可足以将细胞阻滞在G2。我们的研究进一步确定p21对拉帕酚F介导的细胞周期蛋白B和CDK1的下调和G2-阻滞是至关重要的。在 p21-缺失的细胞中拉帕酚F介导的细胞周期蛋白B和CDK1的减少消失(图5),而且进一步地,在缺乏p21的情况下,拉帕酚F介导的G2细胞周期阻滞也被显著改变(图5)。因此,我们的结果表明p21诱导在拉帕酚F介导的细胞反应中是重要的事件且在拉帕酚F介导的细胞周期蛋白B/CDK1抑制和G2细胞周期阻滞中起关键作用。
我们的研究还表明拉帕酚F诱导p21mRNA表达的强烈诱导,p21mRNA表达的强烈诱导可以表明在转录水平发生响应拉帕酚F的p21的激活。由于增加的p21启动子活性,可出现由拉帕酚F增强的p21mRNA表达(图6)。值得注意的是,在表达野生型p53(RKO和 MCF-7)的细胞中以及在具有突变型和非功能性p53(MDA-MB-231和HeLa)的细胞中发生拉帕酚F处理后的p21启动子激活。此外,在缺乏p53基因(p53-/-)的细胞中可以诱导 p21。这表明拉帕酚F触发的p21的诱导以p53依赖性的方式发生。
表型,拉帕酚F还诱导表达野生型-p53(MCF-7和RKO)或突变型/非功能性p53(MDA-MB-231和HeLa)的细胞中的生长抑制。拉帕酚F还降低突变型-p53表达并减少突变型-p53蛋白半衰期(图7)。我们的发现表明拉帕酚F抑制突变型-p53表达并对拉帕酚F 在靶向具有突变型-p53的肿瘤细胞中的用途提供支持。
我们的结果还表明拉帕酚F显著抑制大量致癌蛋白的表达;这些致癌蛋白包含c-Myc, MDM2和HuR蛋白(图8)。所有这些表明蛋白(c-Myc、MDM2和HuR)在多种人类肿瘤中通常是过度表达的且与癌细胞中的致癌表型的致癌转化和保持有关。C-Myc和MDM2还是抗癌药物发展的重要治疗靶标。我们的研究表明拉帕酚F通过抑制多种致癌蛋白可以有效地抑制过度表达这些致癌蛋白的癌细胞的生长。
拉帕酚F对移植到裸鼠上的HeLa肿瘤发挥了强烈的生长抑制作用(图9)。已知HeLa细胞具有扰乱p53的功能的人类乳头状瘤病毒。p53失活是人类癌细胞的共同特征且许多人类癌症具有有缺陷的p53,基于从我们的研究获得的知识,拉帕酚F可用于抑制具有野生型p53以及突变型p53的肿瘤细胞的生长。如在本文提供的示例中所述,我们观察到相比于溶剂-处理的群组,以每天5毫克/千克/天或10毫克/千克/天的剂量(p<0.001)给予15天抑制了54%(p<0.001)和64%(p<0.001)的异种移植的HeLa细胞肿瘤的生长。另外,动物表现出容忍拉帕酚F的治疗,在治疗期间体重没有明显变化。
目前,在临床使用中存在大量靶向细胞周期调控的抗癌药物;例如,长春花生物碱(长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛)、紫杉烷类(紫杉醇或多西紫杉醇)和秋水仙碱。这些药物来源于植物且共有一个共同的诱导有丝分裂阻滞的作用机制。这些药物被认为通过改变微管聚合电位和阻止正常的有丝分裂纺锤体的形成实现了这种作用。癌细胞可以通过包括例如改变微管动力学;改变β-或α-微管蛋白同种型水平或成分;影响药物结合的微管蛋白发生突变;调控微管蛋白/微管动力学调控蛋白的蛋白修饰的多种机制对这些化疗药物形成耐药。这种细胞变化预计将改变微管和微管靶向药物之间的相互作用从而引起耐药性。我们的研究已经确定拉帕酚F通过调控细胞周期调控蛋白主要将细胞周期进程阻滞在G1期和 G2期而发挥作用。拉帕酚F的作用机制似乎不同于上述微管靶标药物的作用机制。因此,导致对上述微管靶标药物耐药的机制可能不会影响拉帕酚F的作用。因此,在一个实施方式中,拉帕酚F还可用于其它抗癌药物失效的病例中。可选地,由于它们的作用机制不同,在一个实施方式中,本发明组合物可以与其它抗癌药物(如顺铂、阿霉素、依托泊苷、博来霉素、西妥昔单抗和曲妥单抗)联合使用。这种联合可以用于抑制p53野生型肿瘤以及p53- 缺陷肿瘤的生长。
在一个实施方式中,本发明提供了一种用于抑制肿瘤生长的方法。所述方法包括向已经被诊断出患有肿瘤的个体给药包括拉帕酚F的组合物。
在一个实施方式中,可以在如药物制剂的组合物中提供拉帕酚F。用于治疗和/或预防途径使用的组合物可通过将拉帕酚F与任何合适的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂进行混合来制备。用于与所述试剂混合的合适的组合物的一些示例可以见于:Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2005)21版,Philadelphia,PA.Lippincott Williams& Wilkins。本领域技术人员将意识到的是,考虑到待治疗个体的如大小、性别、健康和年龄因素,以及与个体形成癌症相关的危险因素,如职业、行为或家族病史相关参数,通过给药途径和其他熟知变量对在所述方法中使用的任何拉帕酚F制剂至少部分指示特定给药方案的形式和特征。基于该标准,本领域技术人员可以确定向个体给药的有效量。在一个实施方式中,可以给药1毫克/千克/天至10毫克/千克/天的剂量和其间的至第十个小数点的所有的量和所有期间的范围的量的拉帕酚F。剂量(高于或低于10毫克/千克/天)和给药频率可以由临床医生认为合适地进行调整。可以在1天至30天或根据需要在更长的时间范围内进行给药。
在我们的研究中,惊奇地观察到在含有HeLa异种移植的动物上的腹腔注射没有显示出任何显著作用而静脉注射显示出显著作用。因为IP给药后的药物吸收在到达体循环和肿瘤靶点之前首先经过门脉循环和肝脏。我们的结果显示当通过IP途径给药时拉帕酚F是没有效果的,可以表明拉帕酚F可能在肝脏中由于首过代谢被改性。因此,可以使用可以绕开首过代谢的包括肠胃外、肿瘤内、肺内、鼻内和颅内注射的任何合适的方法和途径向个体给药包括拉帕酚F的组合物。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下注射。在本领域技术人员的能力范围内确定对特定肿瘤的合适的给药路径。在某些实施例中,所述方法可以先于传统的抗癌疗法进行、与传统的抗癌疗法同时进行,或继传统的抗癌疗法之后进行,该传统的抗癌疗法包含但不限于化疗、外科手术、放射治疗。
在一个实施方式中,可以向经诊断患有对另一种抗癌药物(如长春花生物碱(长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛)、紫杉烷类(紫杉醇或多西紫杉醇)和秋水仙碱)没有响应的肿瘤的个体给药包括拉帕酚F的组合物。
预计对本发明对其提供治疗方法的肿瘤类型不存在特定的限制。在实施方式中,所述肿瘤为实体瘤或血液肿瘤(如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)。示例包括但并不一定局限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假粘液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、头部和颈部癌症、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胸腺瘤、原发性巨球蛋白血症。所述肿瘤可以呈现为野生型-p53或可以呈现突变型-p53或具有破坏p53功能的病毒(如人类乳头状瘤病毒)。
以下示例进一步描述本发明。其为示例性的且不应被解释为限制本发明。
预计本发明适于治疗所有年龄段的个体的任何肿瘤。在一个实施方式中,所述个体为哺乳动物。本发明预计适于人类和兽医目的。
我们的研究还确定拉帕酚F抑制大量的致癌蛋白(如突变型-p53、c-Myc、MDM2和HuR)的表达(图7和图8)。突变型-p53、c-Myc和MDM2是抗癌治疗的靶标。人类癌症中通常观察到升高表达的c-Myc和MDM2。突变型-p53的状态或MDM2的过度表达和/或 c-Myc的过度表达对于癌细胞中的致癌性转化和致癌表型的维持很重要。图7和图8中所示的我们的结果表明拉帕酚F能够抑制这些致癌蛋白的表达,且这些特征是该新型抗癌药物的重要优势。当同时靶向和抑制多个致癌蛋白时,更有可能实现癌细胞的生长抑制。临床研究显示单一靶向抗癌药物常常在给药药物一段时间后在患者中形成耐药性。发生这种情况主要是由于与单一靶向相关的改变/突变。通过同时靶向多个致癌蛋白,拉帕酚F可以降低在癌细胞中形成耐药性的可能性。在一个实施方式中,可以向经诊断患有表达突变型-p53或过度表达MDM2和/或HuR和/或c-Myc致癌蛋白的肿瘤的个体给药拉帕酚F。
提供以下示例以进一步说明本发明。
示例
材料和方法
细胞株、细胞培养条件和试剂
将人类癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、Hs578T(乳腺)、RKO和HT29 (结肠)、A549(肺、非小细胞)、DU145(前列腺)和包括K562、HL60、Jurkat(白血病)、A375、Mol103(黑色素瘤)和U20S(骨肉瘤)的其他几种肿瘤细胞株保持在添加有10%的胎牛血清(FBS)(Gemini生物制品,West Sacramento,CA)的杜尔伯科改良伊格尔培养基 (DMEM)中。HCT116结肠癌细胞株[p21-精通(p21+/+)or p21-缺陷(p21-/-)]生长在具有 10%FBS的RPMI-1640培养基中。HeLa宫颈癌细胞株生长在具有10%FBS的DMEM或 RPMI-1640培养基中。人类非致瘤性乳腺上皮MCF-10A细胞生长在具有在SingleQuotsTM试剂盒(Lonza,Walkersville,MD)中提供的补充剂的乳腺上皮细胞生长培养基中。
慢病毒-介导的shRNA沉默
p21shRNA构建体来自Open Biosystems公司(Huntsville,AL)。任意序列shRNA构建体(Addgene质粒1864)购自Addgene公司(Cambridge,MA)。所用的p21RNAi靶向序列如下:p21RNAi-1:5′-cgctctacatcttctgcctta-3′(SEQ ID NO:1)和p21 RNAi-2:5′-gagcgatggaacttcgacttt-3′(SEQ ID NO:2)。按照由Addgene提供的方案进行病毒生产和感染。
MTT法
按如下进行MTT细胞增殖实验。简而言之,接种在12孔板内用药物处理或未用药物处理的细胞用0.5mg/ml的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)培养1-4 小时。将所得的甲臜沉淀溶于具有0.04M盐酸的异丙醇。用Bio-Rad SmartSpec 3100读取 570nm处的吸光度,在690nm处读取背景减除。
荧光素酶实验
按如下进行荧光素酶实验。简而言之,将瞬时转染了p21-启动子荧光素酶构建体的细胞用或未用拉帕酚F(50μM)处理。二十四小时后,通过具有LUMAT LB9507光度计(Berthold Technologies,Germany)的荧光素酶检测系统(Thermo Scientific,Rockford,IL)对每个细胞裂解物的萤光素酶活性进行分析。
细胞周期分析和有丝分裂指数
按如下通过流式细胞仪确定细胞周期谱图。为了确定有丝分裂指数,用或未用拉帕酚F 处理的细胞以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。在荧光显微镜下计数有丝分裂细胞的数量。每个样品计数超过600个细胞且实验重复至少三次。
蛋白质印迹分析和Northern印迹分析
通过标准方案完成蛋白质印迹分析。抗体来源如下:p21和GAPDH的抗体来自SantaCruz Biotechnology公司(Santa Cruz,CA);细胞周期蛋白B1抗体来自BD bioscience公司(San Jose,CA);p27抗体来自Cell Signaling Technology公司(Danvers,MA);CDK1和CDK2来自Assay Biotechnology公司(Sunnyvale,CA)。进行Northern印迹分析且用全长p21cDNA作为探针来探测p21cDNA的表达。
体内研究
所有动物研究得到批准并根据广州中医药大学的动物伦理委员会的动物保健和使用指南(文件号syxk(粤)2008-0001)执行。首先在背部用5×106个HeLa细胞对BALB/c裸鼠(雌性,4-5周龄)进行皮下注射以建立肿瘤异种移植。肿瘤注射后9天,将具有90mm3-290mm3的肿瘤体积的小鼠随机分为3组;小鼠的每个治疗组中的平均起始肿瘤体积分别为161.28±23.9mm3(溶剂对照)、160.7±17.7mm3(用5mg/kg的拉帕酚F处理的小鼠)和 144.5±20.5mm3(用10mg/kg的拉帕酚F处理的小鼠)。然后通过静脉注射用拉帕酚F(5 毫克/千克/天,N=7,或10毫克/千克/天,N=6)或用等体积的溶剂(含有5%的DMSO和 5%的吐温80的5%的葡萄糖溶液,5毫克/千克/天,N=7)处理15天。每4天通过用卡尺测量两个垂直直径来监测肿瘤的大小。以体积=长×宽2×0.5计算肿瘤体积。每天对小鼠的死亡和体重情况进行监测。在第15天通过按照指南处死小鼠终止动物实验(肿瘤大小超过对照动物的20mm的平均直径)。然后对肿瘤异种移植进行剥离并称重。所有的结果均表示为平均值±标准平均误差(SEM)。采用单因素方差分析对各种治疗方法的效果进行分析且认为P值<0.05具有统计学意义。
结果
从牛蒡中分离的拉帕酚F的提取和结构表征。在室温下用甲醇(MeOH,80%)提取风干粉末状的牛蒡的种子。通过在真空中除去甲醇得到甲醇提取物。浆状甲醇提取物进一步通过石油醚、氯仿(CHCl3)和乙酸乙酯分别进行萃取。然后将氯仿提取物(100g)在硅胶和ODS柱上用CHCl3/MeOH(99:1至90:10)和MeOH/H2O(30:70至60:40)洗脱来反复进行柱色谱;在这些提取和纯化步骤之后,与12种其它化合物一起得到无色无定形粉末命名为AL12的化合物。对于结构鉴定,测量所有分离的化合物的光谱数据;在TU-1901紫外分光光度计(Purkinje General,中国)上进行紫外吸收光谱;在API 2000 LC/MS/MS装置或 MAT95XP质谱仪上测量电喷雾质谱(ESI-MS);在Bruker DRX-400仪器上用甲基硅烷(TMS) 作为内标记录1H和13C核磁共振(NMR)。基于包括ESI-MS m/z 749([M+Cl]-)、UV(MeOH) λ最大(logε):232(4.28),282(4.00)nm的光谱数据信息,AL12的化学结构被鉴定为拉帕酚F,且1H-NMR和13C-NMR(补充信息)的数据遵守已报道的那些。本研究中使用的拉帕酚F的纯度通过HPLC测定为99.19%。拉帕酚F的化学结构示于图1A。
如下为拉帕酚F的1H NMR光谱(400MHz,CDCl3):
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):6.61(1H,s,H-2),6.48(1H,s,H-6),2.98 (1H,dd,J=14.0,4.8Hz,H-7β),2.84(1H,dd,J=14.0,7.2Hz,H-7α),2.59(1H,m,H-8), 6.43(1H,s,H-2’),6.53(1H,s,H-6’),2.57(1H,dd,J=13.6,7.2Hz,H-7’β),2.50(1H, dd,J=14.4,7.2Hz,H-7’α),2.49(1H,m,H-8’),4.20(1H,dd,J=9.2,6.8Hz,H-9’β),3.89 (1H,dd,J=11.2,5.6Hz,H-9’α),6.92(1H,s,H-2”),6.82(1H,d,J=8.0Hz,H-5”),6.86 (1H,d,J=2Hz,H-6”),5.44(1H,d,J=7.6Hz,H-7”),3.54(1H,dd,J=12.8,5.6Hz,H-8”), 3.88(1H,m,H-9”β),3.87(1H,m,H-9”α),6.92(1H,s,H-2”’),6.84(1H,m,H-5”’), 6.86(1H,d,J=2.0Hz,H-6”’),5.45(1H,d,J=7.6Hz,H-7”’),3.54(1H,dd,J=12.80,5.6 Hz,H-8”’),3.88(1H,m,H-9”’β),3.87(1H,m,H-9”’α),3.78,3.82(3H各,s,2×OMe), 3.81(6H,s,2×OMe)。
如下为拉帕酚F的13C NMR光谱(100MHz,CDCl3):
13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ(ppm):128.4(C,C-1),112.8(CH,C-2),147.2(C, C-3),145.6(C,C-4),132.6
(C,C-5),114.3(CH,C-6),34.8(CH2,C-7),46.6(CH,C-8),178.7(C,C-9), 128.9(C,C-1’),113.2(CH,C-2’),147.1(C,C-3’),145.6(C,C-4’),132.8(C,C-5’), 114.3(CH,C-6’),38.4(CH2,C-7’),41.3(CH,C-8’),71.3(CH2,C-9’),131.0(C,C-1”), 108.8(CH,C-2”),146.7(C,C-3”),144.3(C,C-4”),116.6(CH,C-5”),119.4(CH, C-6”),88.0(CH,C-7”),53.5(CH,C-8”),64.0(CH2,C-9”),131.4(C,C-1”’),108.8 (CH,C-2”’),145.7(C,C-3”’),144.2(C,C-4”’),117.3(CH,C-5”’),119.3(CH,C-6”’), 88.0(CH,C-7”’),53.4(CH,C-8”’),64.0(CH2,C-9”’),56.0(CH3,C-3’-和C-3”OMe), 56.1(CH3,C-3”-和C-3”’-OMe)。
拉帕酚F在多种肿瘤细胞株中呈现出生长抑制。
通过最初的细胞毒性筛选实验,我们发现拉帕酚F对不同组织类型(如结肠(HT29、RKO、HCT116)、乳腺(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、Hs578T)、肺(A549)、宫颈(Hela)和其他组织类型)的肿瘤细胞株呈现出强烈的生长抑制作用(图1B和1C)。我们还发现其他肿瘤类型(诸如前列腺癌(DU145)、白血病(K562、HL60和Jurkat)、肉瘤(U2OS)和黑色素瘤(A375、Mol 103))在用拉帕酚F处理后也呈现出生长抑制(图1H 和1N)。拉帕酚F介导的细胞生长抑制为时间依赖性和剂量依赖性的(图1D和1E)且MCF-7、 MDA-MB-231和RKO细胞的预计绝对EC50分别为13.3、16.8和25.2μM。有趣的是,我们还发现当在相同的条件下处理(3天)(图1F)或将延长处理至六天(图1G)时拉帕酚F对 MCF10A非癌性乳腺上皮细胞呈现出最小的细胞毒性。
拉帕酚F诱导G1和G2的细胞周期阻滞和细胞死亡。我们试图确定拉帕酚F介导的细胞生长抑制的作用机制。图2A显示拉帕酚F处理的和未处理的细胞的流式细胞仪分析结果。流式细胞仪分析结果表明拉帕酚F显著增加了2N G1-期的群体或4N G2-(或M)-期的群体(图2A)。似乎在拉帕酚F引起的响应中存在一些变化。例如,MCF-7和HeLa细胞主要被阻滞在2N G1-期而MDA-MB-231和RKO细胞主要被阻滞在4N G2-(或M)-期(图2A)。拉帕酚F不仅在一些细胞株(如HeLa、MDA-MB-231和RKO)中诱导细胞阻滞,拉帕酚F 还在细胞群体的亚群中诱导细胞死亡。图2A显示在拉帕酚F处理的HeLa细胞中还观察到亚-2N细胞死亡群体(sub-G1)的显著增加(从1%至15%)。我们还注意到当拉帕酚F处理时间延长至96小时时,细胞死亡群体进一步增加(数据未显示)。为了鉴定在拉帕酚F处理后4N-群体是否被阻滞在G2期或有丝分裂期,确定了有丝分裂指数(MI)。图2B显示在用溶剂(DMSO)处理的细胞中,有丝分裂细胞核为约3-5%(左侧,箭头)。另一方面,在拉帕酚F处理的细胞群体中,没有观察到有丝分裂细胞核(图2B,右侧)。这些结果是可再现的且表明4N-细胞群体代表G2期而不是有丝分裂阶段。进一步地,拉帕酚F处理的细胞中的细胞核相比于溶剂处理的细胞中的细胞核更大;在拉帕酚F处理的细胞中还注意到凋亡片段细胞核(图2B,右侧,箭头)。这些结果表明拉帕酚F诱导细胞周期阻滞在G1和G2期且它还触发肿瘤细胞亚群中的细胞死亡。
拉帕酚F通过调控关键的细胞周期调控因子影响周期进程。我们研究了拉帕酚F诱导细胞周期阻滞的分子机制。图3A-D显示细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制因子p21和p27在拉帕酚F处理的细胞中的表达水平明显升高,而CDK2、细胞周期蛋白B和CDK1在不同的细胞株中的水平明显降低。确定的是CDK2活性对于G1/S转换是至关重要的;而p21 和p27诱导阻止G1/S转换;另一方面,G2向M转换需要细胞周期蛋白B/CDK1活性且有丝分裂的早期需要细胞周期蛋白B/CDK1。
拉帕酚F对凋亡信号转导的影响。上述结果表明拉帕酚F不仅诱导G1和G2细胞周期阻滞还触发肿瘤细胞群体的亚群中的细胞死亡。接下来,我们试图检测拉帕酚F对凋亡信号转导的影响。我们发现拉帕酚F引起HeLa细胞中半胱天冬酶9和3激活(图4)。然而,在 MCF-7细胞中对于半胱天冬酶8和9没有发现半胱天冬酶激活的明显证据。由于外显子3 中的基因敲除,在MCF-7细胞中没有检测到半胱天冬酶3。在拉帕酚F处理的MDA-MB-231 细胞中观察到半胱天冬酶8、9和3的激活(图4)。因此,这些结果提供表明拉帕酚F激活一些细胞类型中的凋亡信号转导的生化证据。
p21对拉帕酚F介导的G2-阻滞和细胞周期蛋白B/CDK1下调是至关重要的。已经确定的是作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的p21在调控G1向S的转换中发挥着重要作用。然而,很少研究p21在G2-M转换中的作用。我们的上述结果表明p21诱导与细胞周期蛋白B和CDK1的下降以及拉帕酚F处理的RKO和MDA-MB-231细胞中的G2阻滞同时发生(图 3)。先前的研究已经显示由组蛋白脱乙酰酶抑制因子丁酸盐介导的细胞周期蛋白B的下调需要p21诱导;且T-钙粘蛋白介导的G2阻滞也需要p21。因此我们试图确定p21诱导是否对拉帕酚F介导的CDK1/细胞周期蛋白B抑制和G2细胞周期阻滞发挥作用。在本文中,我们首先使用p21-敲除的细胞研究缺失p21是否影响细胞周期蛋白B和CDK1在拉帕酚F处理的细胞中的表达水平。图5A显示由拉帕酚F引起的细胞周期蛋白B和CDK1的下降在p21- 缺陷(p21-/-)细胞(泳道4)中被明显消失。我们还使用慢病毒介导的RNAi敲除方法研究 p21敲除对细胞周期蛋白B和CDK1调控的作用。如图5B所示,在拉帕酚F处理后的任意序列RNAi细胞(泳道2)中观察到的细胞周期蛋白B和CDK1的下降在p21敲除的细胞(泳道4和6)中被削弱。我们进一步研究了p21敲除是否对拉帕酚F介导的G2阻滞有影响。如图5C和5D所示,通过靶向p21转录的不同区域的两种不同的shRNA进行的p21敲除显著降低了阻滞于G2期的细胞的群体。这些结果表明p21对于拉帕酚F介导的细胞周期蛋白 B和CDK1的抑制以及G2阻滞是至关重要的。
拉帕酚F在转录水平以不依赖于p53的方式使p21上调。我们接下来研究拉帕酚F在转录水平或后转录水平是否使p21上调发生。图6显示p21mRNA(6A)和蛋白(6B)的水平在拉帕酚F处理的细胞中均有所提高。这些结果表明在转录水平发生拉帕酚F介导的 p21上调,尽管不能排除在后转录水平发生其他调控。然后我们确定拉帕酚F使p21mRNA 水平升高是否归因于对p21启动子的诱导活性。用拉帕酚F处理或未用拉帕酚F处理后对引入了p21启动子荧光素酶构建体的细胞进行荧光素酶活性的检测。如在图6C中所看到的,在用拉帕酚F处理后,p21启动子活性在四种不同的细胞株(RKO、MCF-7、Hela、 MDA-MB-231)中被显著增强。值得注意的是,RKO和MCF-7细胞表达野生型p53、 MDA-MB-231细胞在280密码子(精氨酸至赖氨酸)处具有p53突变,HeLa细胞拥有使p53 失活的人类乳头瘤病毒。为了进一步确定拉帕酚F介导的p21上调是否是p53依赖性的,使用RKO p53-精通(p53+/+)和p53-缺陷(p53-/-)细胞研究p21的启动子活性。如图6D所示,拉帕酚F导致p53+/+细胞中p21启动子的3.5倍诱导。有趣的是,尽管相比于未处理的p53- 精通(p53+/+)细胞中p21的基础水平,未经处理的p53-缺陷(p53-/-)细胞中的p21的基础水平显著较低,拉帕酚F能够使p53-/-细胞中p21启动子活性上调8.3倍(图6D)。虽然p53 可能有助于p53精通细胞中的p21调控是仍有可能的,但是我们的数据表明拉帕酚F介导的 p21转录诱导可能以不依赖于p53的方式发生。
拉帕酚F通过降低突变型-p53的半衰期抑制突变型-p53。已经确定的是突变型-p53不仅失去了作为肿瘤抑制因子的功能,而且获得了有助于致癌性转化的致癌潜力。接下来,我们试图确定拉帕酚F对突变型-p53是否具有调控作用。如图7所示,拉帕酚F似乎对MCF-7 细胞中野生型-p53的水平没有显著影响(图7A)但显著降低了MDA-MB-231细胞中突变型 -p53的水平(B)。为了进一步检测拉帕酚F对p53表达的作用,我们检测了三种其它表达野生型-p53(RKO)或突变型-p53(MDA-MB-468,T47D)的肿瘤细胞株。如图7C所示,拉帕酚F并没有显著影响RKO细胞中野生型-p53的表达水平,而MDA-MB-468和T47D细胞中拉帕酚F处理强烈抑制了突变型-p53。我们还检测了拉帕酚F下调突变型-p53水平的可能机制并为此研究了拉帕酚F对突变型p53蛋白的稳定性的作用。如图7D-7F所示,拉帕酚 F处理导致突变型-p53蛋白半衰期的下降,突变型-p53蛋白半衰期从未经处理的细胞中的>8 小时降低至处理过的MDA-MB-231细胞中的~3小时(图7D和7E)。且在用拉帕酚F处理的T47D细胞(表达突变型p53)中也观察到相同的结果(图7F和7G)。这些结果表明拉帕酚F处理至少部分通过降低突变型-p53蛋白的半衰期下调了突变型-p53的水平。这些结果还表明拉帕酚F部分通过其对降低突变型-p53水平的作用似乎导致肿瘤细胞生长抑制。
拉帕酚F显著下调包括c-My、MDM2和HuR的多种其他致癌蛋白的表达。我们检测了拉帕酚F对c-My、MDM2和HuR的蛋白表达的作用。这些蛋白通常在人类癌症中过度表达且在致癌过程中发挥重要作用;且它们还对保持癌细胞的致癌表型很重要。c-Myc和 MDM2是抗癌药物开发的重要靶标。HuR也已被证明是癌症发展的决定因素且在多种人类癌症类型中的肿瘤侵袭中发挥重要作用。呈现于图8中的我们的结果表明拉帕酚F强烈下调这些癌基因蛋白。我们的结果表明通过抑制包括上述突变型-p53、c-Myc、MDM2和HuR的多种致癌蛋白以及细胞周期进程启动子(如CDK1、CDK2、细胞周期蛋白B),拉帕酚F可以有效地抑制癌细胞生长。拉帕酚F抑制多种致癌靶标的能力令人意想不到且是这种新型抗癌药物的重要优势。
拉帕酚F抑制动物体内的肿瘤生长。使用HeLa细胞作为裸鼠内的异种移植物,我们还研究了拉帕酚F对体内肿瘤生长的作用。肿瘤细胞接种九天后,每天用溶剂或拉帕酚F(5mg/kg或10mg/kg)对小鼠进行一次静脉注射并持续15天。我们的结果(图9)揭示在接受拉帕酚F处理的小鼠体内显著抑制肿瘤生长。如图9A所示,药物处理15天后,相对于溶剂处理群组,拉帕酚F抑制54%(5毫克/千克/天,p<0.001,N=7)和64%(10毫克/千克/ 天,p<0.001,N=6)的肿瘤生长。图9还显示拉帕酚F剂量从5毫克/千克/天增加至10毫克/千克/天进一步降低了肿瘤体积和重量。重要的是,我们没有观察到给予15天的拉帕酚F (5毫克/千克/天和10毫克/千克/天)处理的小鼠致死或体重减轻(图9D)。这些结果表明给以小鼠的拉帕酚F耐受性良好且抑制体内肿瘤生长。因此我们的结果首次表明拉帕酚F 能够有效地抑制移植在动物上的人类肿瘤(HeLa肿瘤)并因此提供表明拉帕酚F具有开发为用于治疗人类癌症的抗癌药物的很大潜力的重要信息。
尽管通过具体的实施方式描述了本发明,但本领域技术人员将认识到可以对本发明进行常规修改且这样的修改意在成为本公开的范围之内。
Claims (12)
1.分离和纯化的拉帕酚F在制备用于减少癌细胞生长的药物中的用途,包括向需要治疗的个体给药有效量的药学上可接受的载体中的所述分离和纯化的拉帕酚F,其中所述需要治疗的个体是患有乳腺癌、肺癌、结肠癌、白血病、黑色素瘤或骨肉瘤的个体。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述拉帕酚F通过避免首过代谢的途径给药。
3.根据权利要求2所述的用途,其中所述途径包括静脉内、肠胃外、肿瘤内、肺内、鼻内、颅内和皮下。
4.根据权利要求3所述的用途,其中所述给药在化疗、手术治疗或放射治疗之前进行,与化疗、手术治疗或放射治疗同时进行,或继化疗、手术治疗或放射治疗之后进行。
5.根据权利要求1所述的用途,其中所述个体对用化疗药物进行的治疗没有响应。
6.根据权利要求1所述的用途,其中所述癌细胞表现为突变型-p53或野生型p53。
7.根据权利要求1所述的用途,其中所述癌细胞在肿瘤内。
8.根据权利要求5所述的用途,其中所述癌细胞表现为突变型p53。
9.根据权利要求5所述的用途,其中所述癌细胞表现为野生型p53。
10.根据权利要求1所述的用途,其中将所述拉帕酚F与至少一种其它化疗药物一起给药。
11.根据权利要求10所述的用途,其中所述至少一种其它化疗药物选自由顺铂、阿霉素、依托泊苷、博来霉素、西妥昔单抗、曲妥单抗、长春花碱、紫杉烷、秋水仙碱以及其组合组成的组。
12.根据权利要求1所述的用途,其中所述需要治疗的个体已被诊断患有肿瘤。
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