CN105588869B - 一种利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法 - Google Patents

一种利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法，步骤包括：(1)传感器制备及表征；(2)传感器标定或校准；(3)废水中芳香族污染物检测。本发明方法可有效解决传统芳香族污染物检测方法步骤繁琐、难以在线检测的问题，具有工艺简便、测定准确、特异性高、反应快速、灵敏度高、操作简单等特点，实现了多种酚类、芳香胺类物质混合物的同时分别检测，应用前景广阔。

Description

一种利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中 芳香族污染物的方法
技术领域
本发明涉及一种检测废水中芳香族污染物的方法，尤其涉及一种利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法。属于电化学分析测试领域。
背景技术
近年来，针对有机难降解污染物的监测及治理方案的研究越来越成为环境监测领域的热点。随着科学技术的进步及生活水平的提高，工农业生产以及居民生活向环境排放的污染物越来越多，其中芳香族有机化合物是一类稳定性强，危害较大，难以生物降解的物质，其中尤以酚类及芳香胺类污染物的危害最为严重。
酚类物质常存在于煤气、焦化、炼油、冶金等工业领域排放的废水中，目前环境监测常以苯酚和甲酚等作为污染指标。含酚废水流入农田会使农作物减产或枯死，流入地下则会造成地下水污染。环境水体被酚污染后会使水生生物生长受到影响，严重时甚至导致死亡。酚类物质侵入人体，可能导致贫血、眩晕、瘙痒等各种神经系统症状。
芳香胺类物质是染料、农药、助剂、感光材料等的中间体，由于其对水生环境的长期破坏以及对组织细胞的毒性，已成为检测环境污染程度的重要指标。其中邻苯二胺、对苯二胺等随着工业污水的排放直接渗入土壤和地下水，严重污染了农作物和饮用水资源，对人体造成伤害。此外，许多芳香胺类物质具有致癌性。
目前已知的对于芳香族污染物的检测方法有：
1、气相色谱-质谱法(Muller,L.,Fattore,E.,Benfenati,E.Determination ofaromatic amines by solid-phase microextraction and gas chromatography-massspectrometry in water samples.J.Chromatogr.A 1997,791:221-230.Weiss,T.,Angerer,J.Simultaneous determination of various aromatic amines andmetabolites of aromatic nitrocompounds in urine for low level exposure usinggas chromatography-mass spectrometry.J.Chromatogr.B,2002,778.)
2、高效液相色谱法(Zhao,L.M.,Zhu,L.Y.,Lee,H.K.Analysis of aromaticamines in water samples by liquid liquid liquid microextraction with hollowfibers and high-performance liquid chromatography.J.Chromatogr.A 2002,963:239-248.胡秋芬，杨光宇，黄章杰等.固相萃取-高效液相色谱法测定水中酚类物质.分析化学,2002,30(5):560-563)
3、分光光度法(国标HJ 503-2009)，但其中关于芳香族污染物检测方法尚存在急需解决的关键问题如：
1、上述方法1需要进行繁琐的衍生化过程。
2、上述方法2对于组份多而复杂的样品，由于传质阻力大而分离效果不够理想，且需要消耗大量易对环境造成二次污染的有机溶剂。
3、上述方法3步骤繁琐、测试准确度低、检测限高。
4、在上述方法中样品必须通过浓缩或富集、预处理等复杂繁琐的过程，且仪器昂贵无法携带，检测时间长，难以满足在线、灵敏、快速检测的需求。
基于此，建立一种准确、特异、快速、灵敏、简单的分析手段来检测环境中芳香族污染物具有重要现实意义和市场需求。
发明内容
针对现有检测方法的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法。
本发明方法是基于已知的辣根过氧化物酶传感器开发的，所述纳米多孔金的辣根过氧化物酶传感器具有以辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系，检测采用的电化学方法设定为差分脉冲伏安法(DPV)，以有效提高电化学检测的分辨力。
本发明所述利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法，步骤是：
(1)传感器制备及表征：以辣根过氧化物酶/纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，组装三电极体系的纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器；其中，所述辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极事先在0.5MH2SO4中进行循环伏安法扫描15圈，以还原峰峰电流表征NPG/GCE电极的有效面积；
(2)传感器标定或校准：步骤(1)制得传感器初次使用时，需将其放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，分别加入终浓度为0.05～250μM的邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内分别检测加入的已知相应浓度的邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品的电流响应，分别做出电流响应的浓度-电流标准曲线，备用；其中，邻苯二酚标准品的出峰电位在0.12V、对氨基苯酚标准品的出峰电位在0.04V、邻苯二胺标准品的出峰电位在0.21V、对苯二胺标准品的出峰电位在0.10V，所述出峰电位是否出现为判定溶液中邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺是否存在的依据；当传感器再次使用时，将其放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，加入终浓度为50μM的对氨基苯酚标准品，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内检测对氨基苯酚标准品的电流响应，将所得响应电流代入浓度-电流标准曲线，计算其实测浓度，以校准电极误差；再以同样方法校准电极对邻苯二酚、对苯二胺、邻苯二胺的误差；待电极误差校准后，备用；
(3)检测废水中芳香族污染物：将步骤(2)标定或校准后的传感器放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，加入200μL待检废水水样，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内检测水样的电流响应，当出峰电位在0.04V时，可判定水样中含对氨基苯酚；当出峰电位在0.12V时，可判定水样中含邻苯二酚；当出峰电位在0.10V时，可判定水样中含对苯二胺；当出峰电位在0.21V时，可判定水样中含邻苯二胺；当出峰电位在0.04V、0.10V、0.12V或0.21V有多个出现时，即判定水样中含有多个所述出峰电位对应的芳香族类物质；进一步将检测水样的电流响应代入浓度-电流标准曲线计算，即可对应得到该水样中相关对氨基苯酚、邻苯二酚、对苯二胺、邻苯二胺的含量；
上述步骤(2)或(3)所述磷酸盐缓冲液反应体系是：15mL pH 7.0浓度为50mM磷酸盐缓冲液，其中含有10μL 30％(v/v)H2O2。所述磷酸盐优选为磷酸钠。
上述利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法中，所述辣根过氧化物酶/纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)优选以如下方法制得：
(1)纳米多孔金制备：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于纯硝酸中，在20～30℃温度下，腐蚀10～30分钟，制得纳米多孔金薄膜；
(2)酶固定化：将辣根过氧化物酶溶于pH 7.0浓度50mM磷酸盐缓冲液中，制得浓度为1～20mg/mL酶溶液；然后将制得纳米多孔金薄膜浸入酶溶液，使辣根过氧化物酶附着固定于纳米多孔金薄膜表面，固定时间为6～24小时；
(3)电极制备：将步骤(2)制备的辣根过氧化物酶/纳米多孔金复合体，贴于与玻碳电极表面，真空干燥1～2小时，制得辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极。
本发明公开的利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法中，采用了以辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系。其突出优势在于辣根过氧化物酶/纳米多孔金复合体在检测中可以提供对不同种类芳香族化合物的选择性。实验测试电极性能显示：电极对酚类、芳香胺类化合物的线性检测范围为2～180μM，检测限为0.11～0.66μM，灵敏度为26.5～187.3μA cm-2mM-1，在电极表面不经过处理的情况下进行连续测试，测量标准差为0.88％～2.72％，将电极保存在4℃冰箱中4周后，响应电流剩余96％～98.2％。
本发明所具有的实质性特点和显著技术进步在于：
1、本发明提供了一种基于纳米多孔金的辣根过氧化物酶传感器的芳香胺类物质检测方法，基于辣根过氧化物和纳米多孔金共催化氧化芳香胺类物质的特点，该方法可有效解决传统芳香族污染物检测方法步骤繁琐、难以在线检测的问题；
2、本发明提供的检测方法，利用辣根过氧化物酶/纳米多孔金共催化原理检测废水中芳香族污染物，检测限(0.11～0.66μM)、测量标准差(0.88％～2.72％)显著降低；
3、本发明的方法利用辣根过氧化物酶/纳米多孔金复合体的独特性质，实现了多种酚类、芳香胺类物质混合物的同时分别检测，大大提高了工作效率，应用前景广阔。
附图说明
图1为基于纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器对标准品的检测图。
其中：图A为邻苯二酚；图B为对氨基苯酚；图C为邻苯二胺；图D为对苯二胺；图E为传感器对不同底物的传感能力列表。
图2为利用基于纳米多孔金的辣根过氧化物酶传感器对邻苯二胺和对氨基苯酚标准品混合物的检测图。
图3为利用基于纳米多孔金的辣根过氧化物酶传感器检测实际废水中的对氨基苯酚和邻苯二胺的检测图。
具体实施方式
实施例1：一种纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器电极制备
(1)纳米多孔金制备：将厚度为100nm的Au/Ag合金片置于纯硝酸中，在25℃温度下，腐蚀20分钟，制得纳米多孔金薄膜；
(2)酶固定化：将辣根过氧化物酶溶于pH 7.0浓度50mM磷酸盐缓冲液中，制得浓度为10mg/mL酶溶液；然后将制得纳米多孔金薄膜浸入酶溶液，使辣根过氧化物酶附着固定于纳米多孔金薄膜表面，固定时间为16小时；
(3)电极制备：将步骤(2)制备的辣根过氧化物酶/纳米多孔金复合体，贴于与玻碳电极表面，真空干燥1.5小时，制得辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极。
实施例2：一种纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器电极制备
(1)纳米多孔金制备：将厚度为100nm的Au/Ag合金片置于纯硝酸中，在20℃温度下，腐蚀30分钟，制得纳米多孔金薄膜；
(2)酶固定化：将辣根过氧化物酶溶于pH7.0浓度50mM磷酸盐缓冲液中，制得浓度为1mg/mL酶溶液；然后将制得纳米多孔金薄膜浸入酶溶液，使辣根过氧化物酶附着固定于纳米多孔金薄膜表面，固定时间为24小时；
(3)电极制备：将步骤(2)制备的辣根过氧化物酶/纳米多孔金复合体，贴于与玻碳电极表面，真空干燥1小时，制得辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极。
实施例3：一种纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器电极制备
(1)纳米多孔金制备：将厚度为100nm的Au/Ag合金片置于纯硝酸中，在30℃温度下，腐蚀10分钟，制得纳米多孔金薄膜；
(2)酶固定化：将辣根过氧化物酶溶于pH7.0浓度50mM磷酸盐缓冲液中，制得浓度为20mg/mL酶溶液；然后将制得纳米多孔金薄膜浸入酶溶液，使辣根过氧化物酶附着固定于纳米多孔金薄膜表面，固定时间为6小时；
(3)电极制备：将步骤(2)制备的辣根过氧化物酶/纳米多孔金复合体，贴于与玻碳电极表面，真空干燥2小时，制得辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极。
实施例4：利用纳米多孔金的辣根过氧化物酶传感器对邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品的检测
(1)传感器制备及表征：以制得的辣根过氧化物酶/纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，组装三电极体系的纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器；其中，所述辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极如实施例1所述之方法制备，并事先在0.5M H2SO4中进行循环伏安法扫描15圈，以还原峰峰电流表征NPG/GCE电极的有效面积；
(2)传感器标定：将步骤(1)制得传感器放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，分别加入终浓度为0.05～250μM的邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内分别检测加入的已知相应浓度的邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品的电流响应，分别做出电流响应的浓度-电流标准曲线；其中，邻苯二酚标准品的出峰电位在0.12V、对氨基苯酚标准品的出峰电位在0.04V、邻苯二胺标准品的出峰电位在0.21V、对苯二胺标准品的出峰电位在0.10V，所述出峰电位是否出现为判定溶液中邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺是否存在的依据；根据标准曲线，电极对邻苯二酚标准品的线性检测范围为7-150μM，检测限为0.66μM，灵敏度为31.8μA cm-2mM-1；电极对对氨基苯酚标准品的线性检测范围为5-60μM，检测限为0.11μM，灵敏度为187.3μA cm-2mM-1；电极对邻苯二胺标准品的线性检测范围为2-180μM，检测限为0.36μM，灵敏度为67μA cm-2mM-1；电极对对苯二胺标准品的线性检测范围为2-170μM，检测限为0.33μM，灵敏度为26.5μA cm-2mM-1；检测结果如图1所示。在电极表面不经过处理的情况下进行对标准品的连续测试，测量标准差为1.02％，将电极保存在4℃冰箱中4周后，响应电流剩余97.6％；
上述步骤(2)所述磷酸盐缓冲液反应体系是：15mL pH 7.0浓度为50mM磷酸盐缓冲液，其中含有10μL 30％(v/v)H2O2。所述磷酸盐优选为磷酸钠。
实施例5：利用纳米多孔金的辣根过氧化物酶传感器对邻苯二胺和对氨基苯酚标准品混合物的检测
(1)传感器制备及表征：以制得的辣根过氧化物酶/纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，组装三电极体系的纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器；其中，所述辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极如实施例2所述之方法制备，并事先在0.5M H2SO4中进行循环伏安法扫描15圈，以还原峰峰电流表征NPG/GCE电极的有效面积；
(2)传感器标定：将步骤(1)制得传感器放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，加入0.05-250μM对氨基苯酚标准品、100μM邻苯二胺为混合底物，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内同时检测加入的已知相应浓度的邻苯二酚和邻苯二胺标准品的电流响应，分别做出电流响应的浓度-电流标准曲线；其中，对氨基苯酚标准品的出峰电位在0.04V、邻苯二胺标准品的出峰电位在0.21V，依据出峰电位在0.04V、0.21V出现可判定溶液中含有对氨基苯酚、邻苯二胺；根据标准曲线，电极对对氨基苯酚标准品的线性检测范围为5-120μM，检测限为0.27μM，灵敏度为97.2μA cm-2mM-1，在电极表面不经过处理的情况下通过进行连续测试，对邻苯二胺标准品的测量标准差为2.72％。检测结果如图2所示；
上述步骤(2)所述磷酸盐缓冲液反应体系是：15mL pH 7.0浓度为50mM磷酸盐缓冲液，其中含有10μL 30％(v/v)H2O2。所述磷酸盐优选为磷酸钠。
实施例6：利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物
(1)传感器制备及表征：以制得的辣根过氧化物酶/纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，组装三电极体系的纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器；其中，所述辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极如实施例3所述之方法制备，并事先在0.5M H2SO4中进行循环伏安法扫描15圈，以还原峰峰电流表征NPG/GCE电极的有效面积；
(2)传感器标定或校准：步骤(1)制得传感器初次使用时，需将其放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，分别加入终浓度为0.05～250μM的邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内分别检测加入的已知相应浓度的邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品的电流响应，分别做出电流响应的浓度-电流标准曲线，备用；其中，邻苯二酚标准品的出峰电位在0.12V、对氨基苯酚标准品的出峰电位在0.04V、邻苯二胺标准品的出峰电位在0.21V、对苯二胺标准品的出峰电位在0.10V，所述出峰电位是否出现为判定溶液中邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺是否存在的依据；当传感器再次使用时，将其放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，加入终浓度为50μM的对氨基苯酚标准品，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内检测对氨基苯酚标准品的电流响应，将所得响应电流代入浓度-电流标准曲线，计算其实测浓度，以校准电极误差；再以同样方法校准电极对邻苯二酚、对苯二胺、邻苯二胺的误差；待电极误差校准后，备用；
(3)检测废水中芳香族污染物：将步骤(2)标定或校准后的传感器放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，加入200μL待检废水水样，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内检测水样的电流响应，当出峰电位在0.04V时，可判定水样中含对氨基苯酚；当出峰电位在0.12V时，可判定水样中含邻苯二酚；当出峰电位在0.10V时，可判定水样中含对苯二胺；当出峰电位在0.21V时，可判定水样中含邻苯二胺；当出峰电位在0.04V、0.10V、0.12V或0.21V有多个出现时，即判定水样中含有多个所述出峰电位对应的芳香族类物质；进一步将检测水样的电流响应代入浓度-电流标准曲线计算，即可对应得到该水样中相关氨基苯酚、邻苯二酚、对苯二胺、邻苯二胺的含量；检测过程中，在0.04V及0.21V的分别得到的响应电流分别为5.07μAcm-2及4.44μA cm-2，依据出峰电位可以判定待检废水水样中分别含有对氨基苯酚及邻苯二酚两种物质。将所得响应电流5.07μA cm-2及4.44μA cm-2，代入浓度-电流标准曲线计算，得到该水样中对氨基苯酚含量为16.6mg L-1，邻苯二胺含量为11.3mg L-1，共计27.9mg L-1，检测结果如图3所示；
上述步骤(2)或(3)所述磷酸盐缓冲液反应体系是：15mL pH 7.0浓度为50mM磷酸盐缓冲液，其中含有10μL 30％(v/v)H2O2。所述磷酸盐优选为磷酸钠。

Claims (1)

1.一种利用纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器快速检测废水中芳香族污染物的方法，步骤是：
(1)传感器制备及表征：以辣根过氧化物酶/纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，组装三电极体系的纳米多孔金辣根过氧化物酶传感器；其中，所述辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极事先在0.5M H2SO4中进行循环伏安法扫描15圈，以还原峰峰电流表征NPG/GCE电极的有效面积；
上述辣根过氧化物酶/纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)以如下方法制得：
1)纳米多孔金制备：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于纯硝酸中，在20～30℃温度下，腐蚀10～30分钟，制得纳米多孔金薄膜；
2)酶固定化：将辣根过氧化物酶溶于pH7.0浓度50mM磷酸盐缓冲液中，制得浓度为1～20mg/mL酶溶液；然后将制得纳米多孔金薄膜浸入酶溶液，使辣根过氧化物酶附着固定于纳米多孔金薄膜表面，固定时间为6～24小时；
3)电极制备：将步骤2)制备的辣根过氧化物酶/纳米多孔金复合体，贴于与玻碳电极表面，真空干燥1～2小时，制得辣根过氧化物酶/纳米多孔金/玻碳电极；
(2)传感器标定或校准：步骤(1)制得传感器初次使用时，需将其放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，分别加入终浓度为0.05～250μM的邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内分别检测加入的已知相应浓度的邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺标准品的电流响应，分别做出电流响应的浓度-电流标准曲线，备用；其中，邻苯二酚标准品的出峰电位在0.12V、对氨基苯酚标准品的出峰电位在0.04V、邻苯二胺标准品的出峰电位在0.21V、对苯二胺标准品的出峰电位在0.10V，所述出峰电位是否出现为判定溶液中邻苯二酚、对氨基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺是否存在的依据；当传感器再次使用时，将其放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，加入终浓度为50μM的对氨基苯酚标准品，利用传感器在-0.1V～0.3V区间内检测对氨基苯酚标准品的电流响应，将所得响应电流代入浓度-电流标准曲线，计算其实测浓度，以校准电极误差；再以同样方法校准电极对邻苯二酚、对苯二胺、邻苯二胺的误差；待电极误差校准后，备用；
(3)检测废水中芳香族污染物：将步骤(2)标定或校准后的传感器放入磷酸盐缓冲液的反应体系中，加入200μL待检废水水样，对该水样中相关对氨基苯酚、邻苯二酚、对苯二胺、邻苯二胺的含量检测；
上述步骤(2)或(3)所述磷酸盐缓冲液反应体系是：15mL pH 7.0浓度为50mM磷酸盐缓冲液，其中含有10μL 30％(v/v)H2O2；
其特征在于，
所述对该水样中相关对氨基苯酚、邻苯二酚、对苯二胺、邻苯二胺的含量检测的方法是：利用传感器在-0.1V～0.3V区间内检测水样的电流响应，当出峰电位在0.04V时，可判定水样中含对氨基苯酚；当出峰电位在0.12V时，可判定水样中含邻苯二酚；当出峰电位在0.10V时，可判定水样中含对苯二胺；当出峰电位在0.21V时，可判定水样中含邻苯二胺；当出峰电位在0.04V、0.10V、0.12V或0.21V有多个出现时，即判定水样中含有多个所述出峰电位对应的芳香族类物质；进一步将检测水样的电流响应代入浓度-电流标准曲线计算，即可对应得到该水样中相关对氨基苯酚、邻苯二酚、对苯二胺、邻苯二胺的含量。
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