CN105567807B - 一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征是利用细胞内特异表达的靶标microRNA分子作为催化剂，催化金纳米粒子‑量子点组装体的去组装反应，重复利用单个microRNA分子将多个QD与GNP进行解离，使预先被猝灭的QD荧光信号恢复并被多级放大，从而实现对活细胞内靶标microRNA分子的高灵敏度检测与成像，并以此作为区分肿瘤细胞和正常细胞的依据。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学、纳米材料等领域，具体涉及一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，具体包括活细胞内microRNA分子催化金纳米粒子与量子点之间的去组装反应，改变GNP与QD之间的荧光共振能量转移效应，对QD的荧光信号进行放大，从而实现对活细胞中靶标microRNA分子高特异性和高灵敏度的检测方法，并以此实现对肿瘤细胞和正常细胞的准确区分。
背景技术
量子点（quantum dots，英文简称QDs）是一种尺度小于或者近似激子波尔粒径的半导体纳米晶体。相比于传统的有机分子染料，其具有独特且优异的光学性质，比如激发谱宽且连续分布，发射波长可调，荧光量子产率高，荧光寿命长，抗光漂白性强等，因而在生物标记成像、光电子器件，光伏太阳能材料等领域具有广泛的应用前景。QDs独特的荧光性质使得其能够作为荧光共振能量转移效应的理想供体；同时由于高效的表面等离子共振效应和对可见波段光谱的强烈吸收性能，金纳米粒子（英文简称GNP）能够作为荧光共振能量转移效应的理想受体。
DNA分子是遗传信息的载体，其由于Watson-Crick碱基互补配对原则而具有可编程性；以toe-hold（中文名叫立足点，它是DNA链取代反应中需要的条件）介导的DNA链取代反应，可以实现DNA双链与单链之间有序的取代反应。以含有PS段（即磷硫键，P-S）和PO段（即磷氧键，P-O）的DNA作为模板分子来合成量子点的方法，不仅能够简单而直接地对QD表面进行DNA共价偶联修饰，还能够通过调节PS段的长度以及量子点的粒径大小来精确控制量子点表面的DNA分子的数量；同时外部的PO段仍处于自由伸展状态，保持着DNA的可编程性。同样，由于巯基（-SH）与Au原子之间强烈的共价键结合能力，修饰了-SH的DNA分子能够轻易地被修饰到GNP的表面，所修饰的DNA分子同样保持着可编程性。因此，上述方法所获得的DNA修饰的QD和GNP，可以通过DNA分子实现程序化地可控地自组装并形成具有高效荧光共振能量转移效应的GNP-QD纳米组装体。
MicroRNA是一类关键的非编码性微小RNA分子，其对于细胞中基因表达有着重要的调控作用。MicroRNA的非正常表达往往跟多种疾病，特别是肿瘤的发生发展有着密切的关联。因此对microRNA的特异性和高灵敏度的检测将具有十分重要的意义。现有的microRNA分子的检测方法，主要集中于体外检测，包括聚合酶链式反应（即PCR）和分子信标（即Molecular Beacon）的方法。体外检测首先要求将microRNA分子从细胞中提取出来。然而提取过程不仅耗时耗力，也往往会对原有的microRNA分子产生污染，如提取过程的效率问题往往导致获得的microRNA分子的浓度少于细胞中的实际值；或者因为核酸酶的影响，使得microRNA分子在提取过程中被部分降解等。因此发展一种在活细胞中直接的、特异性和高灵敏度的microRNA分子的检测方法将会具有重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，解决了目前microRNA分子的检测方法提取过程效率低、灵敏度不够高的问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，包括以下步骤：
第一步，通过DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD通过DNA碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体，所述DNA1和DNA2均能够与DNA3进行碱基互补配对，所述DNA1含有至少一个巯基，所述DNA2含有磷硫键；在组装体中，由于QD与GNP之间的高效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光性能被暂时淬灭；其中，所述GNP的粒径范围为5 nm~100 nm；所述QD的发射波长范围从450 nm~750 nm；
第二步，用脂质体将所述GNP-QD纳米组装体和DNA4一起转染到活细胞中共培养，DNA4能够与DNA3进行碱基互补配对；之后，在活细胞中表达的靶标microRNA分子的催化作用下，所述GNP-QD纳米组装体发生催化去组装，使GNP与QD相分离，此时由于QD与GNP之间的荧光共振能量转移效应消失，QD本身的荧光信号获得恢复，细胞能够发出荧光；所述靶标microRNA分子为活细胞中任意高表达的microRNA分子；
第三步，通过细胞的荧光成像，实现对靶标microRNA分子的特异性和高灵敏的定性检测。
上述技术方案中的有关内容解释如下：
1、上述方案中，较佳的方案是所述QD的成分选自CdTe、CdSe、CdS二元量子点中的任意一种，或选自ZnHgSe、CdHgSe、ZnInS、ZnCdSe合金量子点中的任意一种，或选自CdSe/ZnS、ZnSe/ZnS、CdTe/ZnS核壳型量子点中的任意一种，在或者选自单质量子点Si、P、C中的任意一种。
2、上述方案中，所述DNA1和DNA2都是单链DNA，并且均能与DNA3进行碱基互补配对，以此，DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD组装起来。
3、上述方案中，由于活细胞中microRNA分子数量很少，而进入到活细胞中的GNP-QD纳米组装体数量较多，因此microRNA只能进行有限次的反应，microRNA只能与GNP-QD纳米组装体按照摩尔比为1:1进行反应，加入了DNA4就可以使microRNA进行循环放大反应，也就是说重复利用单个microRNA分子将多个QD与GNP进行解离，使预先被猝灭的QD荧光信号恢复并被多级放大。
4、上述方案中，所述脂质体的作用是主要是用来转染DNA4-1。脂质体是一个比较成熟的商品化试剂，用来向活细胞中转染外界物质，常常用作基因转染。在上述方案中，主要借助它来转染DNA4，因为单独的DNA4是不能进入到细胞的。当然脂质体也可以将GNP-QD转入细胞，所以GNP-QD的转染不仅能依靠自身具有的转染特性，还能借助脂质体的转染作用，结果是GNP-QD的转染效率会大大增加。
5、上述方案中，当GNP-QD组装体进入到不表达靶标microRNA分子的正常细胞中时，GNP-QD的去组装反应不会被诱发，QD不会从组装体上游离出来，其荧光不会恢复，细胞也不会发出荧光。
本发明设计原理以及有益效果是：
本发明在上述已有的技术基础上，提出了一种基于纳米组装体的催化放大去组装和QD荧光成像方法，实现在活细胞中直接的、特异性和高灵敏度的microRNA分子检测的方法。首先将修饰有DNA的GNP和QD通过DNA碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体。在组装体中，由于QD与GNP之间的高效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光被暂时淬灭。当GNP-QD组装体进入到肿瘤细胞后，在其表达的靶标microRNA分子的作用下，通过miRNA与DNA分子之间的程序化反应对GNP-QD组装体进行催化去组装，使组装体中的QD游离出来并恢复其荧光信号，从而实现对靶标microRNA分子的检测。总之，通过细胞的荧光成像，能够实现对靶标microRNA分子的特异性和高灵敏检测，并可以用做区分肿瘤细胞和正常细胞的依据。这种活细胞中microRNA检测的方法依据的核心原理是GNP与QD之间因为DNA介导的程序化组装和催化去组装，使得相互之间的距离发生变化从而导致的荧光共振能量转移效应的发生和消失。
附图说明
附图1为本发明实施例一的由DNA1和DNA2-1分别修饰的粒径为13 nm的GNP和发射波长为630 nm CdTe量子点，通过DNA3-1组装成GNP-QD组装体的电镜图；
附图2为本发明实施例一的在存在DNA4-1的前提下，GNP-QD组装体在细胞外与靶标microRNA-21分子作用6小时后，在365nm紫外灯下获得的荧光照片；microRNA-21与DNA3-1的摩尔比例从左至右依次是0，1.0，0.1，0.02，0.01，0.004，0.002，0.001，0.0005；
附图3为本发明实施例一的在不存在DNA4-1的前提下，图1中GNP-QD组装体在细胞外与靶标microRNA-21分子作用6小时后，在365nm 紫外灯下获得的荧光照片；microRNA-21与DNA3-1的摩尔比例从左至右依次是1，0.1，0.02，0.01，0.004，0.002，0.001；
附图4为附图2和附图3中不同摩尔比例的microRNA-21与DNA3-1，所对应的荧光光谱强度变化曲线；
附图5为细胞外，将提取的不同细胞的microRNA与附图1中GNP-QD组装体分别进行作用，在DNA4-1参与或者不参与的情况下，在365nm 紫外灯下分别获得的荧光照片；
附图6为在活的HeLa细胞中，对由DNA1和DNA2-1分别修饰的GNP和QD并由DNA3-1组装的GNP-QD组装体和DNA4-1，使用脂质体进行转染，并与HeLa细胞共培养6小时后，在荧光显微镜下获得的成像图（左图是荧光图，右图是细胞明场图）；
附图7为在活的MCF-7细胞中，对由DNA1和DNA2-2分别修饰的GNP和QD并由DNA3-2组装的GNP-QD组装体和DNA4-2，使用脂质体进行转染，并与MCF-7细胞共培养6小时后，在荧光显微镜下获得的成像图（左图是荧光图，右图是细胞明场图）；
附图8为在活的MDA-MB-231细胞中，对由DNA1和DNA2-3分别修饰的GNP和QD并由DNA3-3组装的GNP-QD组装体和DNA4-3，使用脂质体进行转染，并与MDA-MB-231细胞共培养6小时后，在荧光显微镜下获得的成像图（左图是荧光图，右图是细胞明场图）；
附图9为在活的HEK-293细胞中，对由DNA1和DNA2-1分别修饰的GNP和QD并由DNA3-1组装的GNP-QD组装体和DNA4-1，使用脂质体进行转染，并与HEK-293细胞共培养6小时后，在荧光显微镜下获得的成像图（左图是荧光图，右图是细胞明场图）。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法
第一步，通过DNA3-1将修饰有DNA1的5 nm金纳米粒子（GNP）和修饰有DNA2-1的发射波长为450 nm锌镉硒量子点（ZnCdSe）按照碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体；所DNA1和DNA2-1均能够与DNA3-1进行碱基互补配对；
第二步，使用脂质体将GNP-QD组装体和DNA4-1一起转染到子宫颈癌细胞（HeLa）中，共培养6小时；
第三步，将HeLa细胞在荧光显微镜下进行荧光成像，以检测其中是否含有靶标microRNA-21。
实施例二：一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法
第一步，通过DNA3-2将修饰有DNA1的13 nm金纳米粒子（GNP）和修饰有DNA2-2的发射波长为550 nm CdTe量子点（CdTe），按照碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体，所DNA1和DNA2-2均能够与DNA3-2进行碱基互补配对；
第二步，使用脂质体将将GNP-QD组装体和DNA4-2一起转染到人乳腺癌细胞（MCF-7）中，共培养6小时；
第三步，将MCF-7细胞在荧光显微镜下进行荧光成像，以检测其中是否含有靶标microRNA-203。
实施例三：一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法
第一步，通过DNA3-3将修饰有DNA1的30 nm金纳米粒子（GNP）和修饰有DNA2-3的发射波长为750 nm的锌汞硒量子点（ZnHgSe），按照碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体；所DNA1和DNA2-3均能够与DNA3-3进行碱基互补配对；
第二步，使用脂质体将将GNP-QD组装体和DNA4-3一起转染到人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）中，共培养6小时；
第三步，将MDA-MB-231细胞在荧光显微镜下进行荧光成像，以检测其中是否含有靶标microRNA-141。
实施例四：一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法
第一步，通过DNA3-1将修饰有DNA1的100 nm金纳米粒子（GNP）和修饰有DNA2-1的发射波长为600 nm的硒化镉/硫化锌核壳型量子点（CdSe/ZnS），按照碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体；所DNA1和DNA2-1均能够与DNA3-1进行碱基互补配对；
第二步，使用脂质体将将GNP-QD组装体和DNA4-1一起转染到人胚肾细胞（HEK-293）中，共培养6小时；
第三步，将HEK-293细胞在荧光显微镜下进行荧光成像，以检测其中是否含有靶标microRNA-21。
有关实施例一~实施例四的解释说明：
1、对肿瘤细胞和正常细胞的区分的标准：肿瘤细胞中有高表达的microRNA分子，那么GNP-QD组装体进入后，QD就会被解离下来，发出荧光，细胞在荧光显微镜下观察就是亮的。也就是说一旦细胞亮了，那么该细胞里面就有高表达的microRNA，也因此该细胞是肿瘤细胞；反之，细胞在荧光显微镜下不亮，那么该细胞中就不表达这种microRNA，细胞也就是正常的细胞。
2、对附图1至附图9的说明：附图1说明GNP-QD纳米组装体的成功构建；
附图2说明在DNA4-1的参与下，microRNA-21可以催化QD从组装体中去组装，并放大性地恢复QD原有的荧光；
附图3说明在没有DNA4-1的参与下，microRNA-21不能单独催化QD从组装体中去组装，QD原有的荧光不能被恢复；
附图4说明在DNA4-1的参与下，microRNA-21可以催化GNP-QD组装体的去组装反应过程，实现QD荧光信号的放大性恢复，反之，则不会发生荧光放大性恢复；
附图5说明在HeLa、MCF-7和MDA-MB-231等肿瘤细胞中存在着高表达的microRNA-21；而在HEK-293正常细胞中则没有可以被检测到的microRNA-21（1、3、5、7有DNA4-1参与；2、4、6、8没有DNA4-1参与）；
附图6说明Hela细胞中存在着高表达的靶标microRNA-21分子；
附图7说明MCF-7细胞中存在着高表达的靶标microRNA-203分子；
附图8说明MDA-MB-231细胞中存在着高表达的靶标microRNA-141分子；
附图9说明HEK-293细胞中不存在可被检测到的靶标microRNA-21分子。
3、下表为实施例一~实施例四中涉及到的DNA和microRNA序列：
表格中DNA2-1、DNA2-2、 DNA2-3序列中打星号的碱基为PS段，不打星号的那一部分为PO段。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
第一步，通过DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD通过DNA碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体，所述DNA1和DNA2均能够与DNA3进行碱基互补配对，所述DNA1含有至少一个巯基，所述DNA2含有磷硫键；在组装体中，由于QD与GNP之间的高效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光性能被暂时淬灭；其中，所述GNP的粒径范围为5nm～100 nm；所述QD的发射波长范围从450 nm～750 nm；
第二步，用脂质体将所述GNP-QD纳米组装体和DNA4一起转染到活细胞中共培养，DNA4能够与DNA3进行碱基互补配对；之后，在活细胞中表达的靶标microRNA分子的催化作用下，所述GNP-QD纳米组装体发生催化去组装，使GNP与QD相分离，此时由于QD与GNP之间的荧光共振能量转移效应消失，QD本身的荧光信号获得恢复，细胞能够发出荧光；所述靶标microRNA分子为活细胞中任意高表达的microRNA分子；
第三步，通过细胞的荧光成像，实现对靶标microRNA分子的特异性和高灵敏的定性检测。
2.根据权利要求1所述的一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征在于：所述QD的成分选自CdTe、CdSe、CdS二元量子点中的任意一种，或选自ZnHgSe、CdHgSe、ZnInS、ZnCdSe合金量子点中的任意一种，或选自CdSe/ZnS、ZnSe/ZnS、CdTe/ZnS核壳型量子点中的任意一种。
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