CN105555956B - 针对神经胶质瘤细胞的适体 - Google Patents

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Abstract

提供了能够结合与癌细胞相关的配体的适体。所述配体可特别地与脑癌，诸如神经胶质瘤相关。所述适体可在治疗上用于预防和/或治疗此类癌症。适体可与抗癌剂或与检测部分缔合。还提供了采用此类适体的药物组合物和治疗方法。

Description

针对神经胶质瘤细胞的适体
技术领域
本发明涉及适体、适体的配体结合片段以及寡核苷酸。本发明还涉及这些剂在预防和/或治疗癌症以及诊断癌症中的用途。公开的剂及方法特别地可用于脑癌诸如神经胶质瘤。
发明背景
在2010年，仅在UK就有9,156例脑癌新病例(Cancer Research UK)。在世界范围，估计每年有445,000例脑癌新病例(Cancer Research UK)。对于被诊断为患有GBM(WHO IV级)的患者，观察到平均少于5％的幸存者的预后超过5年(Ohgaki和Kleihues,2005；Schwartzbaum等人，2006)。由于人口逐年增长，所以脑癌的发生率将随之增长，突显出对改进的诊断、预后和响应于治疗的预测的需求。在UK以及世界范围内，本发明均具有满足这一需求的潜力。
脑肿瘤手术的目的是最大程度去除肿瘤组织并使对周围正常脑组织以及血管结构的附带损伤(collateral damage)最小化(Thoman等人，2006)。几项研究已经证明目前的疗法受限于无效的早期诊断、药物浓度不足以到达肿瘤、药物毒性以及不良的治疗监控(Li等人，2009；Jiang等人，2010；Esposito等人，2011)。对于科学研究者(包括制药产业)来说，发现能够仅杀死癌细胞同时不伤害正常细胞的药物一直是个挑战。用于癌症的靶向药物递送需要这样的自动引导装置(homing device)：由于自动引导装置的受体的过表达，所述自动引导装置可将药物特异性地运载至癌细胞。分子靶向已是神经胶质瘤的诊断和治疗中的新颖的方法之一。该方法基于鉴定可表达独特受体或抗原的神经胶质瘤癌细胞群体，所述独特受体或抗原被用作靶向分子用于治疗目的(Cibiel等人，2011；Meyer等人，2011)。
发明内容
很多生物递送系统已被选择性地用于使用在文献中受到重点关注的适体和单克隆抗体将成像探针靶向肿瘤细胞(Heilig，2004；Shangguan等人，2008；Cibiel等人，2011)。由于小且高度结构化的单链DNA或RNA分子的适体的高度限定的三维结构，所述三维结构有助于所述适体以纳摩尔级亲和力和高特异性与其靶向的分子以高亲和力结合(Cerchia等人，2009；Bayrac等人，2011)，所以本项目将使用小且高度结构化的单链DNA或RNA分子的所述适体作为理想的靶向剂。
根据本发明的第一方面，提供了适体或该适体的配体结合片段，所述适体包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
根据本发明的第一方面的适体基于其结合与癌细胞相关的配体的能力来选择。该结合特性意味着本发明的适体在很多应用中具有效用，所述应用包括但不限于：治疗用途、诊断用途和研究用途。关于这些用途的更多细节在本公开内容的别处列出。
如由SEQ IDNO:2的适体所示例的，本发明的适体显示出能够跨越血脑屏障的出乎意料且有益的特性。该特性是有优势的原因在于血脑屏障否则可对被施用至身体、能够到达大脑内存在癌症诸如神经胶质瘤的部位的剂(诸如治疗剂或成像剂)构成重要障碍。出乎意料的是先前公布的结果已表明为了使适体跨越血脑屏障，必须将它们与靶向部分缀合。本发明的适体跨越血脑屏障而不需要添加此类靶向部分的能力因此是预料不到的优势。
将领会到有可能能够对本发明的第一方面的适体或其配体结合片段做出一些改变，而不丢失这些适体和片段的基本功能。因此，本发明还提供了寡核苷酸，所述寡核苷酸与SEQ ID NO:1至3或6至11中的任一个共有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，其中所述寡核苷酸保留了与所讨论的适体相同的结合特性。为了简洁的目的，并且除了上下文另外需要处之外，在本公开内容中提及“本发明的适体”还应该被认为包括基于此类适体的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸的结合特性和本发明的适体的片段的配体结合性质可例如，使用在实验结果部分描述的方法诸如流式细胞技术被容易地确定。对于本发明的第一方面的寡核苷酸或适体片段的结合特性和配体结合藉以可在实验上被确立的其他合适技术对于本领域技术人员将是明显的。
不偏离以上所考虑的，对于基于本文公开的适体序列的变体，在合适的实施方案中，本发明的第一方面的适体可由选自由以下组成的组的核酸序列组成：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11。
本发明的适体或其配体结合片段结合与癌细胞相关的配体的能力使这些剂高度适用于治疗性应用。技术人员将领会到本发明的适体结合与癌细胞相关的配体的能力使这些适体非常适用于其中希望使抗癌剂靶向肿瘤的治疗性应用。
仅通过举例的方式，已经设计出许多这样的治疗策略，其中与癌细胞的要素(例如在此类癌细胞的表面上表达的标志物)结合的剂被用于靶向递送治疗性有效负载。将领会到本发明的适体良好适用于如此使用。
此类实施方案可治疗性地使用与抗癌剂缔合的本发明的适体或其配体结合片段。适体和抗癌剂可经由任何合适的方式彼此缔合。适体和抗癌剂可直接或间接地彼此缔合。在该上下文中，就“间接地缔合”而言意指适体与载体缔合，且抗癌剂与载体而不是直接与适体本身缔合。
仅通过举例的方式，在一个合适的实施方案中，适体和抗癌剂可彼此缀合。在合适的实施方案中，抗癌剂可由合适的载体包封，或附接(例如共价地或非共价地)至合适的载体。在此类实施方案中，合适的载体的实例可选自由以下组成的组：纳米颗粒(诸如纳米壳)和树枝状聚合物。合适地，纳米颗粒可包封抗癌剂或由抗癌剂包被。树枝状聚合物也可包封抗癌剂、或可使抗癌剂附接至树枝状聚合物的外周基团。
抗癌剂可以是本领域技术人员已知的期望被靶向癌细胞部位，诸如肿瘤的任何此类剂。仅作为非限制性示例，在合适的实施方案中，抗癌剂可选自由以下组成的组：放射性核素；纳米颗粒，诸如纳米壳；纳米笼；基因沉默剂；和细胞毒性化合物。在合适的实施方案中，可将本发明的适体与这些抗癌剂的任一个或任何组合缔合。
放射性核素和细胞毒性化合物可具有杀死被靶向的癌细胞的固有能力，而纳米颗粒(诸如纳米壳)或纳米笼当被照射时能够吸收能量，以使得其温度增加，允许它们杀死被靶向的癌细胞-该技术有时被称为光动力疗法。光动力疗法还可利用近红外染料，当被照射时，所述近红外染料降解以释放能够杀死附近细胞的活性氧(reactive oxygen species)。将领会到这类染料还构成了可与根据本发明的适体缔合的抗癌剂。
基因沉默剂能够通过干扰转录或翻译来阻止或抑制基因表达的过程。取决于待沉默的基因的性质，基因沉默剂可具有固有的抗癌活性或可适合于被用作其他抗癌疗法的辅助物。
基因沉默剂的合适的实例可选自由以下组成的组：siRNA分子、核酶和反义寡核苷酸。待沉默的基因可参考所选择的本发明的适体(与基因沉默剂缔合的)与之结合的细胞的已知特性来选择。例如，待沉默的基因可以是编码适体与之结合的配体的基因。
如在本公开内容中别处讨论的，发明人已鉴定了由SEQ ID NO:2(也被称为SA43或GL43)组成的本发明的适体，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3与Ku异二聚体中的配体(Ku70或Ku80)结合。不希望被任何假设所束缚，发明人认为被这些适体结合的配体最有可能是Ku70。
技术人员将领会到Ku异二聚体的生物学功能在于DNA修复，并因此该适体将特别地非常适合靶向已被暴露于辐射或DNA损伤剂的癌细胞。
此外，认识到本发明的适体能够与Ku异二聚体内的配体结合可使此类适体令人注目地用于基因沉默剂的靶向。仅通过举例的方式，当包含SEQ ID NO:1、2或3的本发明的适体(或其配体结合片段)与针对Ku70和/或Ku80的基因沉默剂缔合时，此类适体可与其他抗癌疗法组合使用，在所述其他抗癌疗法中使用放射性或其他DNA损伤方法杀死癌细胞。本发明的适体有效地靶向表达Ku异二聚体的癌细胞，并然后阻止或抑制表达(并且因此抑制该异二聚体的功能)的能力将减少DNA修复，并因此增加基于DNA损伤的疗法的效果。
因此，可期望包含SEQ ID NO:1、2或3的适体或此类适体的配体结合片段包含阻止或抑制Ku70和/或Ku80的基因表达的基因沉默剂。合适的基因沉默剂(诸如siRNA分子)可由技术人员参考编码Ku70和/或Ku80的基因和mRNA的已知序列来选择或设计。根据这些实施方案的适体适于被用作使用DNA损伤剂(例如化学治疗剂或放射物)的癌症疗法的辅助物。
事实上，由本发明的适体和基因沉默剂的这些组合提供的优势是本发明的另外的方面提供了与阻止或抑制Ku70和/或Ku80的基因表达的基因沉默剂缔合的包含SEQ ID NO:1、2或3的适体或该适体的配体结合片段。基因沉默剂可选自由以下组成的组：siRNA分子、核酶和反义寡核苷酸。
在另外的方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的适体或其配体结合片段，及药学上可接受的赋形剂。本发明的适体可任选地与抗癌剂以以上考虑的方式缔合。在合适的实例中，药物组合物可以为可注射的组合物的形式。可选地，可将药物组合物配制为用于口服施用。
本发明还提供了用于在预防和/或治疗癌症中使用的根据本发明的适体或以上考虑的那样的药物组合物。如本文别处所讨论的，待预防和/或治疗的癌症可以是脑癌。可将药物组合物配制为以药物组合物的剂量单位提供治疗有效量的适体。可选地或另外地，可将药物组合物配制为提供治疗有效量的与适体缔合的抗癌剂。
在另外的方面，本发明提供了预防和/或治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的药物组合物施用至需要其的受试者。
如以上提及的，本发明的适体及其配体结合片段适用于诊断应用。在此类应用中，适体或配体结合片段可与检测部分缔合。在本发明的这些实施方案的上下文中的检测部分可以是可与适体缔合的且其检测提供对适体定位的指示的任何化合物或基团。因此，对与本发明的适体缔合的固定检测部分的检测可指示本发明的适体已与例如患者中的或来自患者的样品中的癌症相关配体结合。
仅通过举例的方式，合适的检测部分可选自由以下组成的组：放射性核素、染料、荧光团、纳米颗粒(诸如纳米壳)、纳米笼和显色剂(例如酶，诸如辣根过氧化物酶，其能够在显色底物中引起显色变化)。
使纳米颗粒诸如纳米壳或纳米笼适于被用作抗癌剂的纳米颗粒诸如纳米壳或纳米笼的特性(在生物组织吸收很低的光谱区域中吸收辐射的能力，所述区域诸如近红外区)还使这些剂适于被用作检测部分。
例如以以上考虑的方式，任选地与检测部分缔合的本发明的适体可被用于癌症的诊断或临床分级。在本发明的一方面，提供了诊断罹患癌症的受试者中的癌症或对罹患癌症的受试者中的癌症分级的方法，所述方法包括对患者提供一定量的与检测部分组合的本发明的适体，并确定检测部分在受试者中的保留，并从而确定适体在受试者中的保留。本发明的适体(及缔合的检测部分)的保留可指示在受试者中癌症的存在。另外，适体(及缔合的检测部分)在受试者中的保留可指示受试者罹患的癌症的临床分级。
本发明的适体的另一个应用在于它们作为研究试剂的潜在用途。存在一些这样的情形：其中使能够特异性地结合与癌细胞相关的配体的剂可得可以是期望的。仅通过举例的方式，这些情形可包括细胞培养测定或细胞分离测定。适于以该方式使用的本发明的适体或其配体结合片段可包含检测部分，所述检测部分可以是以上讨论的那样的检测部分。例如，在期望将本发明的适体用于促进细胞的流式细胞分选的研究试剂的情况中，如先前所考虑的，可将适体与荧光团缔合。可选地，可将作为研究试剂使用的本发明的适体与其他功能部分缔合。仅通过举例的方式，可将适体与磁珠结合，所述磁珠允许表达由本发明的适体结合的配体的细胞藉以可被分离的选择性策略。
虽然本发明的适体可能够结合与大范围的癌症相关的配体，并因此可应用于例如任何此类癌症的治疗、诊断或分级，但是在优选实施方案中，所讨论的癌症可以是脑癌。可受益于本发明的适体的治疗或诊断应用的脑癌的合适的实例包括，但不限于选自由以下组成的组的那些：神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经鞘肿瘤。在这些实例中，本发明的适体特别地可用于关于神经胶质瘤的治疗或诊断应用。
在另外的实施方案中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含本发明的适体或其配体结合片段。本发明的试剂盒可包含本文公开的发明的一种、多于一种、或所有的适体。本发明的试剂盒可任选地包含另外的成分，诸如可用于结合的适体的定位的检测部分。本发明的试剂盒可包含在组织化学产品中常规的稀释剂或显色底物。本发明的试剂盒可包含关于使用本发明的适体实践诊断测试的信息。
附图说明
现将参考以下的实验结果及附图进一步描述本发明，其中：
图1展示了图示在一些细胞类型中用Cy3标记的适体和DAPI核复染剂的共聚焦成像的结果的代表性显微照片。
图2展示了用一些细胞类型在使用Cy3标记的适体的流式细胞研究中得到的代表性图。
图3图示了本发明的适体被神经胶质瘤细胞主动吸收。
图4归纳了在图3中示出的数据。
图5展示了示出在非癌性脑或来自I-IV级神经胶质瘤的样品中用本发明的适体或阴性对照适体标记的结果的代表性显微照片。
图6图示了SEQ ID NO:2(GL43)的适体的细胞结合是神经胶质细胞或神经元细胞特异性的。
图7示出了在其上来自U87细胞的蛋白已被分离的染色的SDS-PAGE凝胶的图像。标记SA44IP和SA43IP的泳道包含使用本发明的适体通过免疫沉淀(IP-由于不使用抗体，更适当地称为适体沉淀(aptamerprecipitation)，AP)分离的蛋白。
图8示出了在其上来自1321N1细胞的蛋白已被分离的染色的SDS-PAGE凝胶的图像。标记SA44IP和SA43IP的泳道包含使用本发明的适体通过免疫沉淀(IP-由于不使用抗体，更适当地称为适体沉淀，AP)分离的蛋白。
图9示出了在其上来自IV级多形性胶质母细胞瘤原代细胞系9114的细胞的蛋白已被分离的染色的SDS-PAGE凝胶的图像。标记SA44AP和SA43AP的泳道包含使用本发明的适体通过适体沉淀(AP)分离的蛋白。
图10示出了在其上来自IV级多形性胶质母细胞瘤原代细胞系9111的细胞的蛋白已被分离的染色的SDS-PAGE凝胶的图像。标记SA44AP和SA43AP的泳道包含使用本发明的适体通过适体沉淀(AP)分离的蛋白。
图11图示了来自已通过质谱分析的图7中示出的凝胶的区域的前5种显著的蛋白命中(hit)。
图12图示了来自已通过质谱分析的图8中示出的凝胶的区域的前5种最显著的蛋白命中。
图13图示了对U87细胞的裂解物进行的蛋白免疫印迹的结果。该图示出了本发明的适体SA43的适体沉淀并从而将Ku70从细胞裂解物“拉下”的能力，由此证明SA43对Ku复合物的特异性。标记“输入物”的泳道是全细胞裂解物。标记“SA43”、“SA44”和“对照”的泳道分别图示了在U87细胞裂解物内被本发明的适体SA43、对照适体“SA44”结合的产物，及无适体的全细胞裂解物。将来自凝胶的蛋白转移至硝酸纤维膜上，并将该膜用Ku70特异性的抗体探测。如可以看出的，仅“输入物”和“SA43”泳道包含Ku蛋白，指示了SA43的特异性。
具体实施方式
实验结果1
在以下的研究中调查并证明了本发明的适体结合与癌细胞相关的配体，以及该结合的特异性。
将本发明的适体(如在以下列出的)用于标记所培养的癌细胞和非癌细胞，并对此类细胞进行流式细胞术，并还用于标记非癌性脑组织的组织学切片以及从I至IV级神经胶质瘤采集的组织的切片。
使用的适体如下：
●SEQ ID NO:1(也被称为SA44或GL44)
●SEQ ID NO:2(也被称为SA43或GL43)
●SEQ ID NO:3(也被称为SA56或GL56)
作为对照，也遵循相同的标记方案，使用SEQ ID NO:4(也被称为CL44)或随机产生的如下序列(被称为“neg适体”)：
Figure GDA0001755836810000091
以下提供了所进行的研究的更多细节。
材料和方法
细胞系和细胞培养物：
使用不同级别的人神经胶质瘤细胞系执行本实验，所述人神经胶质瘤细胞系包括1321N1(II级星形细胞瘤)、U87MG(IV级胶质母细胞瘤)、T98G(IV级胶质母细胞瘤)和非癌性胎儿星形胶质细胞SVGp12(表2.1)。细胞系获取自European Collection of CellCultures(ECACC)，UK和American Type Culture Collection(ATCC)。还使用了两种其他的非神经胶质瘤细胞系，包括MCF-7(乳腺癌)和T24(膀胱癌)。对于每个细胞系所使用的培养基和补充物根据ECACC和ATCC的建议。将所有细胞系保持在具有5％CO2和75cm2组织培养瓶(Thermo Scientific Nune,UK)的37℃加湿培育箱中。当细胞系达到70-80％汇合时收获细胞系，并在第5-25代之间使用。
细胞摄取和定位：
共聚焦显微术：
培养神经胶质细胞系(1321N1、U87MG、T98G和SVGp12)、乳腺癌细胞系(MCF-7)和膀胱癌细胞系(T24)并以1x104个细胞/ml(在用FBS和青霉素/链霉素混合物补充的它们的单独培养基中)的接种密度接种在24孔板的盖玻片上。然后将汇合的细胞系与特定浓度的适体在37℃下孵育90分钟。然后将细胞用PBS洗涤3次以去除未结合的适体。然后将细胞用4％多聚甲醛(PFA)在室温下固定15分钟。在固定之后，将细胞用具有DAPI的VECTASHIELD封固介质(Vector laboratories,UK)复染以对细胞核染色。使用Zeiss LSM 510META共聚焦显微镜应用相同的仪器设置(放大器增益：1，检波器增益：1092，放大器偏移：-0.06)来获取与细胞结合的适体的图像。
流式细胞术测定
允许神经胶质细胞系(1321N1、U87MG、T98G和SVGp12)、乳腺癌细胞系(MCF-7)和膀胱癌细胞系(T24)在24孔板上生长直至其达到80％汇合。将细胞用1x PBS洗涤并与合适浓度的适体一起在37℃(5％CO2)下孵育90分钟。随后将细胞用1x PBS洗涤3次，接着添加1x胰蛋白酶到每个孔中并在37℃下孵育2分钟，以使粘附细胞脱附。在胰蛋白酶处理2分钟之后，温和地轻拍孔板并在倒置光学显微镜下观察，以确保细胞的脱附。然后加入0.3ml体积的培养基，并且然后将细胞悬浮液转移至微量离心管。然后以224g对细胞离心5分钟。在离心之后，将上清液吸出，并且然后轻弹细胞块并用300μl的1x PBS重悬并充分混合，且备用于流式细胞分析。在使用在488nm处激发且在578nm处发射的PE(藻红蛋白)激光器的流式细胞仪上来进行分析，其中对每个样品收集10,000个事件。
使用生物素标记的适体的免疫组织化学：
本研究还包括对来自BTNW库的来自45名不同患者的具有不同神经胶质瘤级别(包括I级、II级、III级、IV级胶质母细胞瘤和非癌性脑)的一系列组织切片进行适体筛选。
对于适体染色，每个离体肿瘤组织样品和非肿瘤部分由来自医院的病理学家固定并连续地切片(4mm)，作为福尔马林固定、石蜡包埋的切片。将这些石蜡包埋的组织切片用2次Histoclear更换(每次15分钟)来脱石蜡，并通过梯度乙醇(每个浓度5分钟)再水化。将组织切片用蒸馏水冲洗，并然后在97℃下经受用0.01M柠檬酸盐缓冲液的抗原修复步骤，持续20分钟，然后进行实验。将切片在PBS中冲洗两次，每次2分钟。为了遮蔽内源性生物素结合，遵照制造商的说明，将切片用生物素封闭溶液(Vector laboratories)处理30分钟，并然后用PBS洗涤3次。然后将组织切片与100nM生物素标记的适体一起在室温下孵育60分钟。然后将切片用PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟。然后将切片与
Figure GDA0001755836810000111
ABC试剂一起在室温下孵育30分钟。在用PBS溶液洗涤三次之后，随后将组织切片用200μl的DAB过氧化物酶底物溶液(Dako)在室温下处理10min以显色。遵照常规实验室方案用苏木精溶液对组织切片中的细胞核进行复染色，持续5分钟，以使切片脱水并封固。然后在光学显微镜下检查经处理的组织。
针对细胞系筛选cy3标记的适体
将适体SA44(GL44)、SA43(GL43)、SA56(GL56)、对照适体CL44和“neg”用Cy3荧光染料标记。针对细胞系筛选标记的适体的结合，并利用Z堆栈和3D共聚焦成像来分析它们的结合特异性。在图1中展示了图示共聚焦成像的结果的代表性显微照片。
结合以下细胞系调查了适体的结合：
●U87MG-源自IV级神经胶质瘤的细胞
●1321n1-源自II级神经胶质瘤的细胞
●SVGp12-非癌性胎儿星形胶质细胞
●T98G-来自IV级神经胶质瘤的细胞，尽管与U87MG相比较少致瘤
●T24-膀胱癌细胞系的细胞
●MCF7-乳腺癌细胞系的细胞
与非癌性SVGp12细胞相比，适体SA44(GL44)和SA43(GL43)显示出对U87MG神经胶质细胞系较高的结合能力。如在图1中可以看出的，适体对癌性细胞而不是非癌性细胞是选择性的。
还使用流式细胞术定量了加Cy3标签的适体SA44(GL44)、SA43(GL43)和SA56(GL56)与细胞系的结合。在图2中示出了得到的结果的代表性图。观察到相同的适体结合模式，对U87MG细胞具有特异性，对SVGp12细胞则相反。
本发明的适体到神经胶质瘤细胞的主动摄取
调查本发明的适体被神经胶质瘤细胞主动摄取的研究结果被示于图3中，且在该图中示出的结果被归纳于图4中。
简单来说，图4图示了当本发明的适体与神经胶质瘤细胞系的细胞一起在4℃下孵育时，基本上没有适体被摄取入细胞中。但是，当适体与相同细胞系的实例一起在37℃下(在该温度下细胞的代谢过程是活跃的)孵育时，适体(在此参考SA44或SA43被图示)被摄取入细胞内。该主动摄取(其结果被归纳于图4中)代表了有用的过程，通过该过程本发明的适体能够进入神经胶质瘤细胞中，与这些适体在治疗或诊断(诸如标记)应用中的使用一致。
组织的标记
将本发明的适体(如以上列出的)、对照适体CL44或“neg”阴性对照适体用于标记非癌性脑组织的组织学切片，以及从I至IV级神经胶质瘤采集的组织切片。
总的来说在以下中调查了这些适体(本发明的适体、对照和“neg”适体)中的每一个的结合：
●非癌性脑的9个样品，
●I级神经胶质瘤的7个样品，
●II级神经胶质瘤的9个样品，
●III级神经胶质瘤的10个样品，和
●IV级神经胶质瘤的10个样品。
在图5中展示了示出该标记的结果的代表性显微照片。该图的每幅图图示了不同适体(本发明的适体、对照或neg适体)在非癌性脑或来自I-IV级神经胶质瘤的样品中的标记。
适体的特异性结合通过在标记的部位产生暗染色来图示。样品内的细胞核通过苏木精复染来可视化。
通过查看附图，可以看出与非癌性组织相比，在神经胶质瘤中用本发明的适体(而非对照或neg适体)标记的细胞增加，且标记程度随神经胶质瘤级别的增加而升高。
来自I级(n＝7)、II级(n＝9)、III级(n＝10)、IV级(n＝10)和非癌性脑(n＝9)的45个不同的初级组织用生物素标记的适体来筛选，并利用已建立的IHC评分系统来定量，其详细信息在表1中示出。≤3的总得分被认为是可忽略不计的结合。
表1
染色强度的得分 比例染色的得分
0＝未染色 0＝未染色
1＝弱染色 1＝<1％染色
2＝中等染色 2＝1-10％染色
3＝强染色 3＝11-33％染色
4＝34-66％染色
5＝67-100％染色
为了确定统计学差异，对流式细胞术数据进行K-S和Shapiro-Wilk正态性检验，并利用Mann-Witney检验来分析结果。对于组织切片，进行Fisher精确检验，从而总得分高于3的组织切片被认为是阳性的。
这些统计学分析的结果在表2中示出，其中P<0.05被认为是统计学上显著的。
表2
Figure GDA0001755836810000131
实验结果2
以上描述的研究通过加入3个另外的非癌性患者组织样品和5个另外的II级神经胶质瘤患者组织样品来扩展，以给出以下的组：
●非癌性脑的12个样品，
●I级神经胶质瘤的7个样品，
●II级神经胶质瘤的14个样品，
●III级神经胶质瘤的10个样品，和
●IV级神经胶质瘤的10个样品。
该扩展组的统计学分析提供了本发明的适体区分如在表3中所列出的非癌性脑或来自I-IV级神经胶质瘤的样品的能力的进一步说明。
表3
Figure GDA0001755836810000141
图6图示了SEQ ID NO:2(GL43)的适体的细胞结合是神经胶质或神经元细胞特异性的。如所显示的，该适体不标记组织样品中的Purkinje细胞(A图中未标记的)、内皮细胞(B图)或脑膜瘤细胞(C图)。
实验结果3
如下调查了被本发明的适体结合的配体。
两种人神经胶质瘤细胞系(1321N1：II级星形细胞瘤；及U87MG：IV级胶质母细胞瘤)的细胞如之前提及的来培养，并然后裂解以获得它们表达的蛋白的提取物。
然后将这些提取物的样品与SEQ ID NO:2的适体或SEQ ID NO:1的适体一起在允许适体与其相应的配体结合的条件下孵育。然后将能够与适体结合的经标记的珠加入至该孵育混合物中。
然后允许珠、适体和与适体结合的配体沉淀并被收集(被称为“免疫沉淀”“IP”)。包含提取物的未结合蛋白的上清液(被称为“输入物”)也被保留。
然后将免疫沉淀物和输入物单独地处理，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白。使用考马斯蓝对凝胶染色以允许蛋白条带可视化。示例性的染色凝胶的图像在图7和8中示出。
然后将包含条带的凝胶的部分切割并处理，以允许通过质谱法对存在的蛋白进一步分析，所述条带包含已通过免疫沉淀从提取物分离的蛋白。被移除用于另外的调查的区域的示例性实例在图7和图8中示出。
在该图7中，“SA44IP”和“SA43IP”分别指示包含与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的适体一起孵育后产生的免疫沉淀物的泳道。标记“输入物1”和“输入物2”的泳道包含来自在免疫沉淀之后剩余的相应上清液的蛋白。
通过质谱分析产生的结果在图11和12中示出。在此，具体提供了在通过质谱法进一步分析的凝胶的区域的每个中鉴定出的前五个显著蛋白。已知鉴定的蛋白形成Ku异二聚体或与Ku异二聚体缔合，因此将该异二聚体的成员(Ku70和/或Ku80)鉴定为适体SA43(SEQID NO:2)的配体。
被适体SA44(SEQ ID NO:1)结合的配体的相应分析的数据未示出。结论及另外的研究
本发明的适体，特别是SA44适体和SA43适体(也被称为GL44和GL43)在与U87Mg细胞的结合选择性上与SVGp12细胞相比显示出显著的差异(p<0.05)。
SA43(GL43)适体在对I、III和IV级神经胶质瘤组织的结合选择性上与非癌性脑组织相比显示出显著的差异(p<0.05)。
另外的研究将包括SA43(GL43)适体与不同的生物标志物诸如GFAP和CD31的共定位，以证实它们在组织切片中的定位。
另外的研究还将包括产生针对II级神经胶质瘤的适体。
将研究与适体缀合的药物，以探索在将药物靶向递送至癌细胞中的可能的应用。
序列信息
Figure GDA0001755836810000161
对于术语使用的注释：SEQ ID NO:1、2和3的本发明的适体初始分别被称为GL44、GL43和GL56。然后发明人确定这些相同的命名之前已被其他人应用于不同的适体(即不共有以上列出的序列的适体)，并且因此SEQ ID NO:1、2和3适体随后(且优选地)分别被称为SA44、SA43和SA56，以避免混淆。

Claims (18)

1.适体在制备用于治疗需要其的受试者的I级神经胶质瘤或III级神经胶质瘤的药物组合物中的用途，所述适体包含SEQ ID NO:2的核酸序列，所述适体与抗癌剂缔合。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述适体和所述抗癌剂彼此缀合。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述适体和所述抗癌剂彼此间接地缔合。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述抗癌剂与选自由以下组成的组的载体缔合：纳米颗粒和树枝状聚合物。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述纳米颗粒是纳米壳。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述抗癌剂选自由以下组成的组：放射性核素；纳米颗粒；纳米笼；基因沉默剂；以及细胞毒性的化学物质。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述纳米颗粒是纳米壳。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述基因沉默剂选自由以下组成的组：siRNA分子、核酶和反义寡核苷酸。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述基因沉默剂阻止或抑制Ku70和/或Ku80的表达。
10.根据权利要求1至5和7至9中任一项所述的用途，其中所述适体还与检测部分缔合。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述检测部分选自由以下组成的组：放射性核素、染料、荧光团、纳米颗粒、纳米笼和显色剂。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述纳米颗粒是纳米壳。
13.根据权利要求1至5、7至9和11至12中任一项所述的用途，其中所述适体由SEQ IDNO:2的核酸序列组成。
14.适体在制备用于治疗I级神经胶质瘤或III级神经胶质瘤的药物组合物中的用途，所述适体包含SEQ ID NO:2，所述适体与阻止或抑制Ku70和/或Ku80的基因表达的基因沉默剂缔合。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述基因沉默剂选自由以下组成的组：siRNA分子、核酶和反义寡核苷酸。
16.根据权利要求1至5、7至9、11至12和14至15中任一项所述的用途，其中所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。
17.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物被配制为提供治疗有效量的与所述适体缔合的抗癌剂。
18.根据权利要求1或17所述的用途，其中当所述药物组合物被使用时，治疗有效量的所述药物组合物被施用至所述受试者。
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