CN105548568A - 一种基于elisa检测dna-蛋白交联体的方法 - Google Patents

一种基于elisa检测dna-蛋白交联体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于ELISA检测DNA-蛋白交联体的方法，整合了细胞核抽提/裂解/Tris饱和酚回收的DPC提取、DPC中基因组DNA的SYBR？Green？Ⅰ定量、全能核酸酶消化基因组DNA以增强DPC中抗原在ELISA板上的包被能力等样品处理方法和技术。利用该方法，成功检测出O6-烷基转移酶(MGMT)在氮芥染毒后与DNA的交联体(M-DPC)显著增加，与文献报道一致。该方法快速、简便、灵敏，也可以应用于某些其它交联蛋白的检测。

Description

一种基于ELISA检测DNA-蛋白交联体的方法
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种与诊断相关的基于ELISA方法检测在某些理化因素作用下，直接或间接产生的DNA-蛋白交联物。
背景技术
生物机体中，DNA-蛋白的相互作用，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、转录因子、DNA损伤修复蛋白等与基因组DNA非共价结合的相互作用(non-covalentinteraction)，在细胞增殖和维持遗传基因的完整性等方面发挥了重要作用。然而，药/毒物暴露下形成的共价结合(Covalentinteraction)的交联型DNA-蛋白复合体(DNA-Proteincrosslinkingcomplex，DPC)，由于阻碍了DNA的复制和转录，是一种严重的DNA损伤方式。甲醛，辐射，氮芥，顺铂等都可以引起DPC生成，并引起细胞增殖旺盛的组织，如骨髓、肿瘤等的药物敏感性增加(WongVC,CashHL,MorseJL,LuS,ZhitkovichA:S-phasesensingofDNA-proteincrosslinkstriggersTopBP1-independentATRactivationandp53-mediatedcelldeathbyformaldehyde.CellCycle2012,11:2526-37.IdeH,ShoulkamyMI,NakanoT,Miyamoto-MatsubaraM,SalemAM:RepairandbiochemicaleffectsofDNA-proteincrosslinks.MutatRes2011,711:113-22.)。DPC致细胞损伤和基因突变的毒性效应已经得到确证(NakanoT,OuchiR,KawazoeJ,PackSP,MakinoK,IdeH:T7RNApolymerasesbackedupbycovalentlytrappedproteinscatalyzehighlyerrorpronetranscription.JBiolChem2012,287:6562-72.NakanoT,MitsusadaY,SalemAM,ShoulkamyMI,SμgimotoT,HirayamaR,UzawaA,FurusawaY,IdeH:InductionofDNA-proteincross-linksbyionizingradiationandtheireliminationfromthegenome.MutatRes2015,771:45-50.NakanoT,Miyamoto-MatsubaraM,ShoulkamyMI,SalemAM,PackSP,IshimiY,IdeH:TranslocationandstabilityofreplicativeDNAhelicasesuponencounteringDNA-proteincross-links.JBiolChem2013,288:4649-58.)，近年来在DPC损伤修复机制上也有一些突破性的进展，如最近《Cell》发表文章，证实DPC可以通过复制依赖的水解酶修复(DuxinJP,DewarJM,YardimciH,WalterJC:RepairofaDNA-proteincrosslinkbyreplication-coupledproteolysis.Cell2014,159:346-57.StingeleJ,SchwarzMS,BloemekeN,WolfPG,JentschS:ADNA-dependentproteaseinvolvedinDNA-proteincrosslinkrepair.Cell2014,158:327-38.)。但总的说来，DPC在作用机制尚有诸多不明之处。较其它的DNA损伤方式，如核酸碱基上加合烷化物、联间/内交联形成等，DPC引起的细胞损伤，突变效应更严重，修复更加困难。检测细胞或组织样本中总DPC(TotalDPC,T-DPC)水平对于研究DPC的形成及细胞损伤修复机制，临床评估药物敏感性等有重要意义。
O6-甲基转移酶(O6-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT)，一种23kDa的蛋白，与DNA烷化损伤修复密切相关，是目前唯一发现的在哺乳细胞中能够直接移除O6位点烃化加合物的修复酶，被认为在维持基因组稳定性和肿瘤形成中极为重要(PeggAE:MultifacetedrolesofalkyltransferaseandrelatedproteinsinDNArepair,DNAdamage,resistancetochemotherapy,andresearchtools.ChemResToxicol2011,24:618-39.)。MGMT是一种有限的消耗性酶，补充缓慢。MGMT在临床的肿瘤化疗，药物开发中均有重要作用。有报道，在造血组织高表达外源性MGMT可增加细胞对烷化剂的耐受(SchambachA,BaμMC:VectordesignforexpressionofO6-methylguanine-DNAmethyltransferaseinhematopoieticcells.DNARepair(Amst)2007,6:1187-96.)。这说明MGMT表达水平与细胞的烷化剂耐受密切相关。我们的前期研究发现，在氮芥等双功能烷化剂作用后，MGMT无法发挥移除DNA加合物的正常功能，因为此时MGMT被交联在DNA上形成MGMT-DNAcrosslink(M-DPC)无法释放。与其它的DPC损伤一样，M-DPC被证实具有致DNA复制损伤和突变的多重作用。在一些MGMT丰富的组织或细胞中，双功能烷化剂引起的M-DPC的增加被认为是动物/细胞毒性反应的重要原因(KalapilaAG,PeggAE:Alkyltransferase-mediatedtoxicityofbis-electrophilesinmammaliancells.MutatRes2010,684:35-42.KisbyGE,OlivasA,ParkT,ChurchwellM,DoergeD,SamsonLD,GersonSL,TurkerMS:DNArepairmodulatesthevulnerabilityofthedevelopingbraintoalkylatingagents.DNARepair(Amst)2009,8:400-12.)。检测细胞或组织样本中M-DPC水平在此情况下有重要意义。
虽然自上世纪70年代，人们就发现DPC存在于多种染毒组织、细胞中，但由于相关技术在普通实验室难以开展，针对DPC的检测难以应用，能够形成DPC的药物通常伴有大量的非DPC损伤，欲获得较高纯度的DPC样本通常需要使用超速离心等复杂手段。DPC的检测技术近年来有了进步，实现了以DNA加合物快速回收(RADAR，rapidapproachtoDNAadductrecovery)—狭缝印迹(slotblotting)(RADAR-SB)的联合检测方法，这也为本项目开发快速检测DPC的ELISA试剂盒奠定了基础。根据我们对文献的调研和分析，DPC检测技术的主要发展历程如下：
技术1，SDS-KCl检测法检测T-DPC。这是一种上世纪70-80年代开发的方法，简便易行，但线性范围窄，灵敏度差。其原理为SDS可以和游离蛋白及DPC上交联蛋白结合，而不和DNA结合，样品中加入KC1溶液时DPC和蛋白质沉淀下来，而游离的DNA留在上清液中。向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白质使DPC中的DNA游离出来，用荧光法测定此DNA的含量以及原液中DNA的含量，计算交联DNA和总DNA的比值，进而得出DNA和蛋白质的交联程度。DPC系数＝交联DNA/(交联DNA+游离DNA)。
技术2，超速离心-热裂解法检测特异蛋白交联DPC(Michaelson-RichieED,LoeberRL,CodreanuSG,MingX,LieblerDC,CampbellC,TretyakovaNY:DNA-proteincross-linkingby1,2,3,4-diepoxybutane.JProteomeRes2010,9:4356-67.)。是之前主流的DPC检测方法，该法制备的DPC纯度高，交联蛋白活性保存好，缺点是步骤繁琐，需应用到超速离心机等昂贵设备，一般实验室无法开展。实验原理为DPC通过氯化铯密度梯度超高速(大于100,000g)长时间离心后，胞核成分被分离在不同的层面上，收集纯净的DPC。将DPC加热后使交联有DPC的碱基从DNA上分离下来，便可以进行HPLC-MS或者WesternBlotting，以分析交联蛋白的种类和含量。
技术3，FITC标记检测T-DPC(ShoulkamyMI,NakanoT,OhshimaM,HirayamaR,UzawaA,FurusawaY,IdeH:DetectionofDNA-proteincrosslinks(DPCs)bynoveldirectfluorescencelabelingmethods:distinctstabilitiesofaldehydeandradiation-inducedDPCs.NucleicAcidsRes2012,40:e143.)。Ide,H.等于2012年报道了使用FITC标记DPC中蛋白来检测T-DPC的方法，该方法对T-DPC的检测技术进行了革新。原理为采用超高速密度梯度离心后收集得到DPC样品，并在pH8.0的硼酸缓冲液中，将DPC上蛋白进行FITC标记，然后续通过荧光分光光度仪上读取FITC的荧光数值，或者slotblotting(狭缝印记)的方法转移到NC膜，通过抗体结合和显色确定某一蛋白的水平。
技术4，DNAzol法检测特异蛋白交联DPC(KiianitsaK,MaizelsN:Ultrasensitiveisolation,identificationandquantificationofDNA-proteinadductsbyELISA-basedRADARassay.NucleicAcidsRes2014,42:e108.KiianitsaK,MaizelsN:ArapidandsensitiveassayforDNA-proteincovalentcomplexesinlivingcells.NucleicAcidsRes2013,41:e104)。Maizels,N.等从2013年始，在《NucleicAcidsRes》上接连发表了2篇文献，提出了一种创新性的DPC提取、纯化以及特异蛋白交联DPC的检测方法，称之为RADAR-SB联合检测方法。该实验检测不需复杂的仪器设备，方法大为简化。实验原理为利用商品化的含异硫氰酸胍的DNA提取试剂(如DNAzol等)处理得到DPC样本。该方法于2015年被进一步优化，即提取过程中添加二氧化硅以增加DPC在溶液中沉积的效率。纯化后的DPC通过狭缝印记的方法转移到NC膜，通过抗体结合、显色。
ELISA是一种基于免疫反应的方法，具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，在临床检验或者科研实验中有广泛应用。常用的ELISA类型有，双抗源/抗体夹心法，间接法测抗体，竞争法，捕获包被法测抗体。2014年Maizels,N.等尝试了基于ELISA方法检测DPC，在采用了多种类型的ELISA方法来检验DNA拓补异构酶TOP1/TOP2a-DNA交联体，发现都不能很好地检出，原因在于DPC中的DNA成分影响了交联蛋白与ELISA板上包被抗体的结合能力。采用核酸酶消化DPC中DNA后，再进行DPC的检测，信号大大提高(KiianitsaK,MaizelsN:ArapidandsensitiveassayforDNA-proteincovalentcomplexesinlivingcells.NucleicAcidsRes2013,41:e104)。因此，在ELISA检测DPC的过程中，控制DPC中核酸含量是一个关键性的技术指标。目前尚不能确定该方案能否适用于其它交联蛋白的检测，因为使用RADAR提取DPC可能有部分蛋白构象改变，抗原活性丢失而无法被抗体识别。因此，针对不同交联蛋白形成的DPC的检测要通过实验确定该蛋白是否具有抗原活性。
DPC检测技术向着简便化，快速化发展，基于ELISA方法检测DPC是重要的方向。申请人依托前期国家自然基金的资助，开展了氮芥引起的DPC损伤机制研究。结合新近报道的DPC的检测方法，我们建立了基于ELISA的DPC检测方法，该方法的成功建立将在DPC的科学研究和临床检测中有广泛的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于ELISA的快速、准确的DPC检测方法，解决现有技术进行DPC检测时程序繁琐、费时等问题。该方法不需要使用特殊、大型仪器设备，可在普通实验室即可开展。
一种基于ELISA检测DNA-蛋白交联体的方法，包括如下步骤：
(1)以DNA提取试剂提取DNA-蛋白交联体混合物，以NaOH溶液溶解DNA-蛋白交联体；
(2)DNA-蛋白交联体混合物中核酸浓度定量检测，
(3)以定量的核酸浓度上样DNA-蛋白交联体混合物，以全能核酸酶完全消化后，进行ELISA检测。
所述步骤(2)采用SYBRGreenⅠ的基因组DNA定量方法，使用的SYBRGreenⅠ核酸染料1:10000稀释，采用多功能酶标仪检测，激发波长470nm，发射波长520nm。
所述检测的DNA线性范围为50pg/ul-2ng/ul。
所述步骤(3)采用全能核酸酶进行DNA降解后，使用包被缓冲液混匀后15-25℃包被2-5h。
所述步骤(1)使用细胞核抽提-裂解-Tris饱和酚/氯仿回收法，DPC沉淀经75％乙醇洗涤，离心去上清，采用8mMNaOH进行溶解。
所述DNA-蛋白交联体为总DPC，其中含有DNA-MGMT交联体。
本发明实验原理：使用全能核酸酶消化提取的DPC中的核酸，再使用ELISA包被液将DPC中抗原包被固定至ELISA板上。使用一抗抗体与抗原结合后，加入HRP标记的二抗，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的M-DPC含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
本发明采用氮芥盐酸盐染毒前后的人支气管上皮(16HBE)细胞，按经典基因组DNA提取原理提取DPC，得到DPC混合物，包括游离的DNA和结合的有DNA的DPC。采用SYBRGreenⅠ的基因组DNA定量方法，能将DPC混合物中定量测定出核酸的浓度。以确定的核酸浓度上样DPC混合物，经全能核酸酶消化DNA后，仅余下蛋白质，该蛋白质按常规的ELISA检测方法，将不同DPC含量下检测得到的OD值进行计算，得出ELISA检测方法的线性范围。
通过对比，ELISA的方法检出的M-DPC变化与Slotblotting法测出的结果一致，与文献报道类似。
提取基因组DNA使用了常规的细胞核抽提、Tris饱和酚/氯仿-75％乙醇沉淀的经典回收法，简单易行，可以使用基于此原理的各种商品试剂盒；用SYBRGreenⅠ定量基因组DNA，方法简单，结果准确，保证了上样量的一致性；全能核酸酶消化DPC中的DNA及其用于ELISA板的包被和检测都是经典方法。上述方法在结合实现了快速、准确、高通量、线性范围广，与现有其它方法相比有明显优势。
附图说明
图1：SYBRGreenI法检测dsDNA含量，
其中：(A)采用小牛胸腺DNA制作的dsDNA浓度-荧光值的标准曲线；(B)人支气管上皮细胞株16HBE经氮芥染毒后，采用RADAR方法提取的DPC稀释100倍后检测所得的dsDNA浓度值。
图2：采用200μM氮芥染毒16HBE样本进行线性关系比较。(A)ELISA方法中不同DNA上样量在加入TMB20min后显色差异。总DNA上样量，其中A:30ng；B:100ng；C:300ng；(B)ELISA和Slot-blot法检测M-DPC的线性关系比较。
图3：Slotblotting和ELISA检测氮芥染毒16HBE3h后M-DPC水平，
其中(A)Slotblotting方法检测M-DPC的膜显影结果；(B)Slotblotting方法与ELISA方法检测M-DPC结果的统计比较。
(注:与Slotblotting方法的ctrl比较，**P<0.01；与ELISA方法的ctrl比较，##P<0.01)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明所用的实验材料均己公开，本申请人实验室可以对公众发放。
1.DPC的提取及纯化
胰酶消化收集氮芥盐酸盐染毒前后的人支气管上皮(16HBE)细胞，PBS洗涤2次后以适量的PBS重悬细胞，按经典的基因组DNA提取原理提取DPC。加入等量的2Xcelllysisbuffer(20mMTris-HCl/10mMMgCl2/2％v/vTriton-X100/0.65Msucrose)，冰上放置5min后2,000g4℃离心10min。沉淀加入生理盐水-EDTA溶液(75mMNaCl/24mMEDTA/1％(w/v)SDS,pH8.0)，包含RNaseA(10μg/mL)以及蛋白酶抑制剂(1mMPMSF；1μg/mLpepstatin；0.5μg/mLleupeptin；1.5μg/mLaprotinin)，在37℃下摇床轻微震荡2h。加入2倍体积的Tris饱和酚溶液，10,000g4℃离心10min。吸取上清，加入2倍体积的Tris饱和酚:氯仿(1:1)溶液，10,000g4℃离心10min后，吸取上清。加入10％体积的3M醋酸钠，再加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后-70度放置15min。4,000g4℃离心5min，弃上清，加入适量的70％的乙醇，4,000g4℃离心5min，弃上清。晾干10-20s，加入8mMNaOH溶液溶解DPC产物。
2.DPC中核酸浓度检测
采用凝胶染色用的SYBRGreenⅠ，使用时1:10000倍稀释，待测DNA浓度调整至1ng/ul左右，与SYBRGreenⅠ等份相加，暗处室温孵育10min后，于酶标仪上检测，EX:470nm，Em：520nm。该检测结果为后续相同的上样量提供依据。见图1。
结论：在0.041-30ng/μl区间内SYBRGreenI方法可以对dsDNA进行准确的定量。实验各组DPC样本中的dsDNA浓度不一致，提示后续采用Slotblotting或者ELISA方法检测M-DPC时，DPC样本上样量需基于此DNA含量进行校正。提取DNA后进行的定量是总DNA，包括形成DPC的那部分DNA。该定量是为了调整检测DPC时上样量的一致，由此得到的ELISA结果就说明了不同样本中形成DPC的多少。
3.ELISA方法检测DPC的方案
将含DPC的样品中MgCl2浓度调整到2mM，然后用12.5U的全能核酸酶(Benzonase)37℃消化处理30min，以便消化DNA和RNA。全能核酸酶处理的样品用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(PH9.6)包被，按每孔50-100ul加样到96孔ELISA板，并在室温下孵育1-2小时或过夜4℃。后续DPC孵育和清洗均在室温进行。PBST(含0.1％Tween-20的PBS)洗涤酶联孔板3到4次，并使用封闭液(含10％BSA的PBS)封闭1h。特异性一抗孵育2-3小时，洗涤四次，再用HRP偶联的相应二抗孵育30-45min，洗涤4次。加入100μlTMB高灵敏度底物溶液，将板在暗处孵育20min，并通过加入50μl反应停止液终止反应。在450nm下读取吸光度，并通过去除570nm处酶联板的本底值进行校正。样品一式两份或一式三份运行。见图2。
结论：随着抗原用量的增加，显色愈加深。提示当DPC上样量在一定范围内时，ELISA法可对M-DPC中抗原含量进行精确的定量。图1显示ELISA对M-DPC的检测阈值在1μg总DNA，我们在用Slotblot时上样量一般在5-10μg总DNA，因此ELISA的灵敏度稍高。
4.方法的线性关系
使用200μM氮芥染毒细胞DPC样本。DPC上样量分别为30ng、100ng和300ng，并以DPC溶剂(8mMNaOH)上样作为阴性对照(ctrl)。将不同DPC含量下检测得到的OD值进行计算，得出ELISA检测方法的线性范围。见图2(B)。
5.M-DPC含量的检测--slotblotting法与ELISA法的比较
比较检测结果见图3。
结论：MGMT在DNA上滑动(stripping)是该酶的一特点，此状态下MGMT可与DNA有正常的交联，因此，对照组M-DPC也略有检出。氮芥染毒后的M-DPC有显著增加，且对氮芥剂量有依赖。ELISA的方法检出的M-DPC变化与Slotblotting法测出的结果一致，与文献报道类似。

Claims (6)

1.一种基于ELISA检测DNA-蛋白交联体的方法，包括如下步骤：
(1)以DNA提取试剂提取DNA-蛋白交联体混合物，以NaOH溶液溶解DNA-蛋白交联体；
(2)DNA-蛋白交联体混合物中核酸浓度定量检测，
(3)以定量的核酸浓度上样DNA-蛋白交联体混合物，以全能核酸酶完全消化后，进行ELISA检测。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(2)采用SYBRGreenⅠ的基因组DNA定量方法，使用的SYBRGreenⅠ核酸染料1:10000稀释，采用多功能酶标仪检测，激发波长470nm，发射波长520nm。
3.根据权利要求2所述的方法，所述步骤(2)检测的DNA线性范围为50pg/ul-2ng/ul。
4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)采用全能核酸酶进行DNA降解后，使用包被缓冲液混匀后15-25℃包被2-5h。
5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)使用细胞核抽提-裂解-ris饱和酚回收法，DPC沉淀经75％乙醇洗涤，离心去上清，采用8mMNaOH进行溶解。
6.根据权利要求1所述的方法，所述DNA-蛋白交联体为总DPC，其中含有DNA-MGMT交联体。
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