CN105547789A - 一种分离吐温-80的柱色谱方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分离吐温-80的柱色谱方法，及其在含吐温-80的药品质量控制中的用途。其特征在于，对于含吐温-80的供试药品水溶液试样，以水可浸润型两亲高分子聚合物基质反相材料为固定相，以与水互溶的有机溶剂与水组成的混合溶剂体系为流动相，在常压至中压条件下进行梯度洗脱，使吐温-80与目标的药品质量控制成分因色谱特性差异而被不同组成的溶剂分别洗脱，从而实现二者的快速分离，以有效消除药品中共存的吐温-80与目标质量控制成分的相互干扰。本发明为含吐温-80的药品质量控制提供了一种快速简便、并具有良好重现性和准确度的试样前处理手段。

Description

一种分离吐温-80的柱色谱方法及其用途
技术领域
本发明涉及药品质量控制方法。具体来说，涉及一种分离吐温-80的柱色谱方法，及其在含吐温-80的药品质量控制中的应用。
背景技术
吐温-80（聚山梨酯80）是一种最常用的聚山梨酯类多元醇型非离子表面活性剂，对电解质有显著的抵抗力，亲水性强，作为O/W型乳化剂、增溶剂、湿润剂、分散剂或稳定剂，被广泛应用于外用、口服或注射用的液体、半固体及固体制剂中，如注射液、口服液、乳剂、混悬剂、透皮贴剂等。根据不同剂型和用途需要，其用量通常在0.1%-15%的范围内进行调整。目前，各种市售注射剂中最常用的增溶剂即为吐温-80，用量一般在0.5%-2%。
实践证明，吐温-80的加入对于提高难溶性药物的溶解度，改善制剂的澄明度，以及提高制剂稳定性和生物利用度都十分有效。但大量吐温-80的共存，对于薄层色谱鉴别、光谱测定等都可能产生不利影响。特别是对于含生物碱的制剂，由于吐温-80含有类同生物碱的基团，具有与生物碱类似的化学反应特性，其共存会对基于生物碱沉淀或显色反应的定性、定量分析结果产生严重干扰，因此必须在分析前将其分离去除。如何有效消除吐温-80的干扰，已成为相关药物制剂质量控制中备受关注的关键技术问题之一【郑玲.吐温-80对钩藤生物碱薄层分离干扰之排除.中成药1993,13(1):33；戴述诚,等.吐温-80对柴胡注射液紫外吸收光谱的影响.中国兽药杂志2011,45(10):52-53.】。
作为一种非离子表面活性剂，吐温-80在常见极性和非极性溶剂中的溶解度都很高，因此，常规液-液萃取手段难以实现药物制剂中目标质量控制成分与大量共存吐温-80的有效分离。文献报道，在强碱性条件下加热煮沸一定时间，吐温-80可因酯键水解而被破坏【陈代懿.关于含吐温-80的中药注射剂用生物碱反应作为鉴别试验的讨论.中成药研究1987,1:8.】。但通常在如此剧烈的水解条件下，药物制剂中的目标质量控制成分同样可能被破坏。与此同时，在吐温-80被水解破坏后，试样的澄明度和稳定性均显著降低，对后续的分析、测定将产生新的干扰和影响。目前，适用于含吐温-80的药物制剂中吐温-80与目标质量控制成分快速、有效分离的方法尚属空白。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作快速、简便，且具有良好重现性和准确度的柱色谱分离方法，应用于药物制剂中大量共存辅料吐温-80与目标质量控制成分的分离，以有效消除其对制剂质量控制的干扰。
本发明的目的可通过以下技术方案顺利实现。对于含吐温-80的供试药品水溶液试样，以水可浸润型两亲高分子聚合物基质反相材料为固定相，以与水互溶的有机溶剂与水组成的混合溶剂体系为流动相，在常压至中压条件下进行梯度洗脱，使吐温-80与目标的药品质量控制成分因亲水性不同导致的色谱特性差异而被不同组成的溶剂分别洗脱，从而实现二者的快速分离，以有效消除药品中共存的吐温-80对目标质量控制成分分析的干扰。
本发明所采用的色谱柱既可以是商业来源的水可浸润型高分子聚合物基质固相萃取（SPE）小柱，也可将商业来源的水可浸润型两亲高分子聚合物基质材料在常压下自行填装制作。色谱柱的规格可根据待分析药品试样的实际情况和分析方法的具体需要进行选择，在操作上十分便于实现。
本发明所述的以与水互溶的有机溶剂与水组成的混合溶剂体系为流动相进行洗脱，该洗脱过程具体来说是：先以水、或水与有机溶剂组成的混合溶剂体系为流动相，先行洗脱吐温-80；再以与水互溶的有机溶剂或与水互溶的有机溶剂与水组成的混合溶剂体系为流动相，洗脱药物制剂中的目标质量控制成分。
具体实施方式
以下以含吐温-80的苦木注射液经柱色谱分离去除吐温-80后的总生物碱定量分析为具体实施例，以进一步说明本发明及其应用，但并不构成对本发明权利要求所保护范围的限制。
生物碱是一类重要的天然含氮有机化合物，不仅在植物界中分布广泛，而且具有抗炎、抑菌、解痉、平喘、降压、镇痛、抗肿瘤等多种多样的生物活性，是很多常用中草药的主要化学和生物活性成分。如《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第20册收载的苦木注射液，其主要药效成分及质量控制成分即为生物碱，规格为每支2mL，含总生物碱不低于0.50mg。该制剂处方中同时含0.6~0.8%（w/v）的吐温-80作为增溶剂。在现行部颁标准（WS3-B-3887-98）中，采用重量法测定苦木注射液的总生物碱含量。单次测定即需消耗10支（20mL）注射液样品，而且需要经历反复的调节酸碱度、有机溶剂萃取、洗涤、转移、干燥等一系列繁琐的操作过程，结果的重现性和可靠性均难以保证，亟待改进。
基于本发明提供的柱色谱方法，可实现苦木注射液中总生物碱与共存吐温-80的快速分离，有效去除吐温-80对生物碱特征呈色反应的干扰。在此基础上，建立了一种适用于苦木注射液中总生物碱含量快速测定的光度分析方法，所得结果与现行标准的重量法无显著差异，灵敏度、专属性和重现性较重量法均显著改善。该方法可在其他含吐温-80的药品质量控制中进行推广。
一、材料、试剂与仪器
苦木注射液(2mL/支)，江西青峰药业；4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮对照品，实验室自制（纯度>99.0%）；固相萃取小柱（PhenomenexStrata-X，200mg/3mL，33μm），广州菲罗门科学仪器有限公司；INLUCK精细聚合物填料（INLKPOLY50/65,50-65μm），北京英莱克科技发展有限公司；紫外可见分光光度计，岛津UV2550；甲醇（色谱纯），北京百灵威科技有限公司；水，杭州娃哈哈集团有限公司；碱式硝酸铋、碘化钾、冰醋酸，分析纯。
二、实验方法
1、柱色谱分离制备待测总生物碱供试溶液
（1）SPE柱分离
1）取PhenomenexStrata-X聚合物反相SPE小柱（填料为表面修饰的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，规格：200mg/3mL，33μm），先后以～20倍柱体积的甲醇及水浸润、洗脱，活化后待用；
2）精密量取苦木注射液5mL，上样；
3）在1mL/min～3mL/min流速下，以～3倍柱体积水先行淋洗，分离去除试样中的吐温-80；
4）继续在1mL/min～3mL/min流速下，以～2倍柱体积甲醇淋洗。收集洗脱液至10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得待测总生物碱供试溶液；
（2）填充柱分离
1）取INLUCK精细聚合物填料INLKPOLY50/65，50-65μm，表面修饰的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物）400mg，装填于玻璃小柱中（直径=0.90cm），先后以～10倍柱体积的乙醇及水浸润、洗脱，活化后待用；
2）精密量取苦木注射液5mL，上样；
3）在1mL/min～3mL/min流速下，以～3倍柱体积水先行淋洗，分离去除试样中的吐温-80；
4）继续在1mL/min～3mL/min流速下，以～2倍柱体积甲醇淋洗。收集洗脱液至10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得待测总生物碱供试溶液。
2、显色测定
1）精密量取经上述分离过程制得的总生物碱供试溶液2mL，置10mL量瓶中，加入2mL改良碘化铋钾显色剂，用0.1mol/LHCl定容至刻度，摇匀，即得供试显色溶液；
2）精密量取浓度（Cb）～100μg/mL的苦木生物碱对照品4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮甲醇溶液2mL，或甲醇2mL，同1）进行显色，分别得对照显色溶液和参比溶液；
3）以参比溶液为参比，在505nm处分别测定供试和对照显色溶液的吸光度，按下式计算苦木注射液试样中总生物碱含量：
注射液中总生物碱含量（μg/mL)=
其中，Cb为对照品溶液的浓度；As、Ab分别为供试和对照显色溶液的吸光度值。
结果以4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮（C15H10N2O3）计。
三、结果与结论
1、本法测定结果及与重量法比较
针对10个批次的苦木注射液样品，分别采用本发明建立的柱色谱分离-显色光度法和部颁标准的重量法进行总生物碱含量测定，结果见表1。
表1.10批苦木注射液总生物碱含量测定结果
针对两种方法的测定结果，采用EXCEL进行成对双样本均值t检验，结果P（双尾）=0.19，>0.05，表明针对苦木注射液总生物碱的含量测定，两种方法不存在显著性差异。
2、回收率测定
取已经测定总生物碱含量的苦木注射液试样，加入不同量对照品溶液，按实验方法进行操作，测定加标后的总生物碱量，计算加标回收率和RSD（%）。结果见表2。
低、中、高浓度的平均加标回收率分别为97.3%、98.2%、97.1%，总体平均回收率为97.5%，RSD0.89%，表明该方法对于苦木注射液总生物碱含量测定具有良好的准确度和精密度。
表2.生物碱加标回收率测定结果
3、结论
基于本发明提供的柱色谱方法，可实现苦木注射液中总生物碱与共存吐温-80的快速分离，有效去除吐温-80对生物碱特征呈色反应的干扰。在此基础上所建立的显色光度分析方法，适用于苦木注射液中总生物碱含量的测定，所得结果与重量法无显著差异，准确度和精密度良好，且简便、快捷，完全可以替代现行部颁标准中的重量法用于苦木注射液的质量控制。该方法也适于在其他含吐温-80的药品质量控制中进行推广。

Claims (7)

1.一种分离吐温-80的柱色谱方法，其特征在于，以水可浸润型两亲高分子聚合物基质反相填料为色谱固定相填装色谱柱，以与水互溶的有机溶剂与水组成的混合溶剂体系为流动相进行梯度洗脱，使吐温-80与目标化合物因色谱特性差异而被不同组成的溶剂分别洗脱。
2.根据权利要求1所述的一种分离吐温-80的柱色谱方法，其特征在于，所述的水可浸润型两亲高分子聚合物基质反相填料包括但不限于聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物。
3.根据权利要求1所述的一种分离吐温-80的柱色谱方法，其特征在于，所述的色谱柱为可以为商业化的固相萃取（SPE）柱或者自行填装的色谱柱。
4.根据权利要求1所述的一种分离吐温-80的柱色谱方法，其特征在于，所述的与水互溶的有机溶剂，包括但不限于甲醇、乙醇、丙酮、乙腈，优选为甲醇或乙醇。
5.根据权利要求1所述的一种分离吐温-80的柱色谱方法，其特征在于，所述的梯度洗脱可以在常压至中压条件下进行。
6.一种分离吐温-80的柱色谱方法在含吐温-80的药品质量控制中的应用，其特征在于，该方法作为便捷的预处理手段，对含吐温-80药物制剂中的目标质量控制成分与吐温-80进行快速分离，有效消除目标质量控制成分与吐温-80因共存所产生的相互干扰，从而实现对药品中目标质量控制成分或吐温-80的准确定性、定量分析。
7.根据权利要求6所述的一种分离吐温-80的柱色谱方法在含吐温-80的药品质量控制中的应用，其特征在于，所述的药物制剂包括但不限于含吐温-80的外用、口服或注射用的液体、半固体及固体药物制剂，优先为含生物碱类药效成分的中药制剂。
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