CN105543325B - 芽胞杆菌生物被膜形成能力评估方法及应用的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速便捷评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基组合，包括第一液体培养基和第二液体培养基，利用第一液体培养基和第二液体培养基的差异性来筛选生物被膜促进物质，同时还可以评估不同浓度的待测物质促进生物被膜形成能力的效果。

Description

芽胞杆菌生物被膜形成能力评估方法及应用的培养基
技术领域
本发明涉及芽胞杆菌生物被膜形成能力评估领域，具体地说是涉及评估和研究芽胞杆菌是否具有生物被膜形成能力以及形成能力强弱的方法及所应用的培养基，为筛选促进生物被膜形成能力的物质以及进一步开发这一类型的芽胞杆菌用于生物农药和生物肥料提供支持。
背景技术
生物被膜(biofilm)指细胞通过胞外基质紧密结合在一起形成的群体。生物被膜为细菌提供保护，使细菌防御各种环境因子及其组合、形形色色的抗生素、捕食者和人类的免疫系统。
芽胞杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性细菌，可以产生内生芽胞，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无害，不污染环境。它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖和与繁殖，而且生产芽胞杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方便，存储期长，是一种理想的生防微生物。由于自然界获得的芽胞杆菌还需要在实验室开展进一步的评估，其中用于土传病害治理的芽胞杆菌要想发挥良好的防效，还需要具备良好的土壤和植物根际定殖能力。而芽胞杆菌能在土壤和植物根际良好定殖的关键是其生物被膜形成能力的强弱，因此评估芽胞杆菌类生防菌株生物被膜形成能力的强弱对于进一步开发芽胞杆菌用于生物农药或生物肥料的产业化开发具有重要意义。此外，一些针对土传病害的生物农药，由于施用时需要接种到土壤中，待其萌发并在土壤中定殖才能进一步发挥作用，而土壤环境条件复杂，不合适的土壤理化因素如pH、盐度、营养源以及微生物因素如病原菌分泌毒素的存在等，都会影响到芽胞的萌发并最终发挥效果。筛选和寻找促进芽胞杆菌在土壤和植物根际快速形成生物被膜的物质，有助于提高这一类生物农药或生物制剂的田间应用效果及其稳定性。
在革兰氏阳性细菌中，枯草芽胞杆菌的生物被膜形成研究成为模式和典范。枯草芽胞杆菌最著名的特点是在饥饿和高种群密度时形成感受态和芽胞，除此之外，还发现许多枯草芽胞杆菌能够在固体平板上形成复杂具褶皱的菌落，并在液体表面形成薄皮，这种在固体表面或液体表面形成的结构即生物被膜。枯草芽胞杆菌生物被膜形成及其基因调控得到了深入的研究。
目前被深入研究生物被膜形成机制的枯草芽胞杆菌菌株为NCIB3610菌株。枯草芽胞杆菌生物被膜的形成涉及到多种转录调控因子，其中最核心的转录调控因子是SinR、SinI和两种新鉴定的蛋白，YlbF和YmcA。转录调控因子SinR是控制枯草芽胞杆菌生物被膜形成转换的主调控因子。SinR在枯草芽胞杆菌细胞中组成型表达，并在运动的细胞中抑制控制基质产生基因的转录，间接促进细胞之间保持分开和运动。当条件有利于生物被膜形成时，SinR的活性受到拮抗。SinI和两种新鉴定的蛋白(YlbF和YmcA)，直接和/或间接拮抗SinR的活性，SinR活性降低后导致细胞的运动能力丧失，细胞之间形成链状并开始分泌胞外基质，并最终形成稳定的具有三维结构的生物被膜。胞外基质由胞外多糖(EPS)和蛋白质TasA组成。
目前在微观水平对枯草芽胞杆菌生物被膜的研究依赖超薄切片技术和高放大倍数荧光显微镜技术。在宏观水平对枯草芽胞杆菌生物被膜形成的研究则依赖于枯草芽胞杆菌在不同液培养基表面形成的薄皮或固体培养基表面形成的菌落。目前常用的几种培养基配方如下：
(1)DSM培养基：Hamon and Lazazzera(2001)报道了评估和研究枯草芽胞杆菌生物被膜形成的方法，在该文章中，作者使用了PVC材质的96孔微量滴定板作为培养容器，培养基配方(DSM)为：LB培养基加0.15M的硫酸铵、100mM的磷酸钾(pH7)、34mM柠檬酸钠、1mM硫酸锰和0.1％的葡萄糖。其测定不同时间点芽胞杆菌生物被膜形成强度时采用了结晶紫染色的方法，将微量滴定板中未粘附成膜的游离细胞去除，并用缓冲液(0.15M硫酸铵、100mM磷酸钾(pH7)、34mM柠檬酸钠、1mM硫酸锰)清洗。粘附到微孔中的细菌使用1％的结晶紫染色20min，多余的结晶紫去除并用水漂洗。结晶紫染色后的细胞用200μL由80％和20％丙酮组成的洗脱液溶解，并测定溶解液OD570的读数，用于评估生物被膜厚度。这个方法非常适合与测定芽胞杆菌形成薄皮的能力。
(2)MSgg培养基：Branda et al.(2004)在研究枯草芽胞杆菌生物被膜时提出了液体MSgg培养基，具体配方为5mM磷酸钾(pH7.0)、100mM磷酸丙基吗啉(pH7.0)、2mM氯化镁、700μM氯化钙、50μM氯化锰、50μM氯化铁、1μM氯化锌、2μM硫胺素、0.5％甘油、0.5％谷氨酸、50μg/mL色氨酸、50μg/mL苯丙氨酸。固体MSgg培养基在液体MSgg培养基中加入1.5％的琼脂。培养容器为培养皿。枯草芽胞杆菌在液体MSgg上能够形成稳定的具有皱褶的薄皮，在固体MSgg培养基上则形成具有三维结构的菌落。
(3)LB+Mn+甘油：Shemesh and Chai(2013)研究甘油和Mn促进枯草芽胞杆菌生物被膜形成研究时使用的培养基为LB培养基中加入1％(v/v)甘油和0.1mM硫酸锰。
(4)MSN培养基：Beauregard et al.(2013)研究植物多糖对枯草芽胞杆菌薄皮形成影响时采用的培养容器为24孔微量滴定板，采用的培养基为MSN，配方为5mM磷酸钾(pH7.0)、0.1M磷酸丙基吗啉(pH7.0)，2mM氯化镁、0.05mM氯化锰、1μM氯化锌、2μM硫胺素、700μM氯化钙、0.2％氯化铵。用于测定芽胞杆菌根际定殖能力时，在其中加入0.05％的甘油，或加入0.05％的植物多糖用于测定薄皮的形成。该培养基从MSgg培养基演变而来。由于培养基中未提供芽胞杆菌生长所需的碳源，芽胞杆菌接入上述培养基中不能形成薄皮，加入芽胞杆菌能够使用的碳源后，芽胞杆菌将会在微量滴定板中形成薄皮。
上述4种培养基均可以用于定性或定量研究枯草芽胞杆菌生物被膜形成，其中DSM培养基比较适合研究薄皮，制备成固体培养基后，枯草芽胞杆菌不能生长出具有褶皱的菌落。MSgg培养基既适合薄皮也适合菌落的生长。LB+Mn+甘油的培养基也适合薄皮和菌落的生长。MSN培养基适合评估碳源与枯草芽胞杆菌薄皮形成关系。也可以用上述培养基培养出薄皮后，利用结晶紫染色的方法对菌株的生物被膜形成能力进行定量评估。但是，除了MSN培养基属于专门设计用于评估生物被膜促进因子研究的培养基外，其它培养基因其本身就具备促进芽胞杆菌生物被膜形成能力，不适合用于生物被膜形成能力及促进因子的评估。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种快速便捷评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基组合。
本发明的该目的是通过如下方案实现的：
一种评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基，其特征在于，所述培养基包括：
第一液体培养基，所述第一液体培养基包含的溶质及浓度为，100mM磷酸三钾，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％胰蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制备过程中，先将所述磷酸三钾溶入水并调整pH为7.0；所述第一液体培养基的最终pH为7.0；
第二液体培养基，所述第二液体培养基包含的溶质及浓度为，100mM磷酸三钾，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％细菌学蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制备过程中，先将所述磷酸三钾溶入水并调整pH为7.0；所述第二液体培养基的最终pH为7.0。
由于第一液体培养基和第二液体培养基中使用蛋白胨的不同，芽胞杆菌接入第一液体培养液和第二液体培养基后会经历的生长抑制时间不同，通过观察在第一液体培养基和第二液体培养基形成薄皮的形态、时间长短就可以判断出芽胞杆菌生物被膜形成能力。
本发明的另一目的在于提供一种快速便捷评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的方法。
本发明的该目的是通过如下方案实现的：
一种应用前述培养基评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的方法，其特征在于，
将待测菌株用固体LB平板划线，挑取单菌落于液体LB培养基中，在37℃下以180rpm的速度振荡培养20小时，使菌液的OD600值达到0.8以上；
然后用新鲜的LB培养基稀释菌液，使菌液的OD600达到0.02，用作待测菌种液，要求待测菌种液中芽胞杆菌的浓度达到106CFU/mL；
将灭菌后的第一液体培养基和第二液体培养基分别加入无菌平板中，将待测菌种液按照0.08％～0.1％的接种量滴加在2种培养基的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h、48h、72h观察薄皮的形成；
如果能够在第一液体培养基中形成完整的薄皮，但不能在第二液体培养基中形成完整薄皮的菌株，判定为属于生物被膜形成能力中等菌株；
如果在第一液体培养基和第二液体培养基中仅能形成漂浮的残缺不全的薄皮，则判定为无生物被膜形成能力或生物被膜形成能力弱的菌株；
如果能够同时在第一液体培养基和第二液体培养基中形成薄皮的，则判定为生物被膜形成能力强的菌株；
在第一液体培养基中越早形成结构稳定薄皮的菌株，则被判定为生物被膜形成能力越强。
由于第一液体培养基和第二液体培养基中使用蛋白胨的不同，芽胞杆菌接入第一液体培养液和第二液体培养基后会经历的生长抑制时间不同，通过观察在第一液体培养基和第二液体培养基形成薄皮的形态、时间长短就可以判断出芽胞杆菌生物被膜形成能力。
本发明的再一目的在于提供一种快速便捷评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法。
本发明的该目的是通过如下方案实现的：
一种应用前述培养基评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法，其特征在于，
将选取的芽胞杆菌菌株用固体LB平板划线，挑取单菌落于液体LB培养基中，在37℃下以180rpm的速度振荡培养，20小时，使菌液的OD600值达到0.8以上；
然后用新鲜的LB培养基稀释菌液，使菌液的OD600达到0.02，用作试验菌种液，要求试验菌种液中芽胞杆菌的浓度达到106CFU/mL；
将灭菌后的第一液体培养基和第二液体培养基分别加入无菌平板中，将试验菌种液按照0.08％-0.1％的接种量滴加在2种培养基的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h，48h、72h观察薄皮的形成；
观察如果在第一液体培养基上能够在12h～24h内形成薄皮，但不能在第二液体培养基上在12h～24h内形成薄皮的或超过72h仅在第二液体培养基上形成破碎的不完整漂浮物；
则再次取灭菌后的第二液体培养基，并将待测物质加入第二液体培养基中，形成第三液体培养基；将第三液体培养基加入无菌平板中，并将试验菌种液按照0.08％-0.1％的接种量滴加在该培养基的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h、48h、72h观察薄皮的形成；如果在第三液体培养基上能够在12h～24h内形成薄皮或超过72h能在第三液体培养基上形成结构完整的薄皮，则得出待测物质具有生物被膜促进能力；反之亦然。
进一步的，再次取灭菌后的第二液体培养基，并将不同浓度的待测物质加入第二液体培养基中，形成含有不同浓度待测物质的第三液体培养基；将含有不同浓度待测物质的第三液体培养基分别加入无菌平板中，之后，将试验菌种液按照0.08％-0.1％的接种量分别滴加在该培养基的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h，48h、72h观察薄皮的形成；在12h～24h内，如果越早能够在第三液体培养基上形成薄皮的，则得出该浓度的待测物质具有较强的生物被膜促进能力。
进一步的，在第一液体培养基、第二液体培养基及第三液体培养基中，分别加入1.5％的琼脂制成第一固体培养基、第二固体培养基及第三固体培养基，倒板后，将试验菌种液5μL滴加在平板中央，30℃静置培养，别在12h、24h，48h、72h观察菌落的形成；如果在第一固体培养基上能够在12h～24h内形成完整菌落，不能在第二固体培养基上在12h～24h内形成完整菌落的或超过72h仅在第二固体培养基上形成不完整菌落，但在第三固体培养基上在12h～24h内形成完整菌落的或超过72h后在第三固体培养基上形成向周围扩散的菌落，则说明待测物质具有生物被膜促进能力。
所述待测物质为Mn离子。
所述Mn离子以硫酸锰的形态加入。
由于第一液体培养基和第二液体培养基的不同在于第二液体培养基中使用细菌学蛋白胨，并同样含有合适的碳源和氮源，但由于细菌学蛋白胨的存在，芽胞杆菌接入第二液体培养基后会经历一个较长时间的生长抑制，如果某种物质如Mn离子，能够快速打破菌株的生长抑制，就能够促进菌株在第二液体培养基上快速形成稳定的薄皮；从而可以达到利用第一液体培养基和第二液体培养基的差异性来筛选生物被膜促进物质。同时，利用这种方法还可以评估不同浓度的待测物质促进生物被膜形成能力的效果。对于在第一液体培养基和第二液体培养基的基础上加入琼脂制成第一固体培养基和第二固体培养基而言，则可以起到辅助评估不同浓度的待测物质促进生物被膜形成能力的效果。
附图说明
图1A、图1B分别为枯草芽胞杆菌R31在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮；
图2A、图2B分别为枯草芽胞杆菌TR21在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮；
图3A、图3B分别为解淀粉芽胞杆菌R21g9在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮；
图4A、图4B分别为短芽胞杆菌L1在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮；
图5A、图5B分别为胶质芽胞杆菌L2在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮；
图6A、6B、6C、6D、6E为对照组及不同浓度Mn对枯草芽胞杆菌R31在第二液体培养基中形成薄皮的影响；
图7A、7B、7C、7D、7E为对照组及不同浓度Mn对枯草芽胞杆菌R31在第二固体培养基固体平板上形成菌落的影响；
具体实施方式
下面结合附图，通过具体的实施例阐述评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基，利用培养基评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的方法和评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法；但下述实施例不能被理解为对本发明的限制。
实施例1：利用液体培养基评估不同芽胞杆菌的生物被膜形成能力
本实施例对不同分类单元的芽胞杆菌开展了生物被膜形成能力评估。涉及的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌R31菌株(Bacillus subtilis)(CCTCC NO：M 209261)、枯草芽胞杆菌TR21菌株(B.subtilis)(CCTCC M 2010019)、解淀粉芽胞杆菌R21g9菌株(B.amyloliquefaciens)(陈燕红等.一株香蕉枯萎病生防解淀粉芽胞杆菌的分离、鉴定及其拮抗物质研究.广东农业科学，2013，40(2)：68-72)和短芽胞杆菌L1菌株(Brevibacillussp.)和胶质芽胞杆菌L2菌株(B.mucilaginosus)(牛春艳，分解黑水虻蛹皮的产几丁质酶生防芽胞杆菌筛选、鉴定和产酶特性研究，中山大学硕士研究生论文，2011)。
一、培养基制备
所述培养基包括第一液体培养基和第二液体培养基。
一)第一液体培养基的制备：
(1)按如下配方称取各原料：三水磷酸三钾26.631g，三水柠檬酸三钠9.999g，7水硫酸镁0.2465g，硫酸铵19.821g，牛肉膏3g，NaCl 5g，胰蛋白胨10g，葡萄糖1g；
(2)先将磷酸三钾在烧杯中加入900mL蒸馏水，溶解后调pH7.0，然后分别加入上述试剂，搅拌均匀，补足蒸馏水到1000mL，调整培养基溶液的pH值至7.0；115℃灭菌20min。
得包含如下溶质及浓度的所述第一液体培养基，100mM磷酸三钾(pH7.0)，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％胰蛋白胨，0.1％葡萄糖。分装、灭菌、检定后保存。
二)第二液体培养基的制备：
(1)按如下配方称取各原料：三水磷酸三钾26.631g，三水柠檬酸三钠9.999g，七水硫酸镁0.2465g，硫酸铵19.821g，牛肉膏3g，NaCl 5g，细菌学蛋白胨10g，葡萄糖1g；
(2)先将磷酸三钾在烧杯中加入900mL蒸馏水，溶解后调pH7.0，然后分别加入上述试剂，搅拌均匀，补足蒸馏水到1000mL，调整培养基溶液的pH值至7.0；115℃灭菌20min。
得包含如下溶质及浓度的所述第二液体培养基，100mM磷酸三钾(pH7.0)，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，l％细菌学蛋白胨，0.1％葡萄糖。所述第二液体培养基的pH为7.0。分装、灭菌、检定后保存。
三)液体LB培养基的制备
称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，置入烧杯中，加蒸馏水至1000mL；溶化后，调整培养基溶液的pH值至7.0，得包含如下溶质及浓度的所述液体LB培养基：胰蛋白胨10mg/mL，酵母提取物5mg/mL，NaCl 10mg/mL，所述液体LB培养基的pH为7.0。分装、灭菌、检定后保存。固体LB平板则为在液体培养基中加入1.5％的琼脂粉。
二、试验步骤
(1)菌种活化：从-20℃保藏菌种，在固体LB平板上划线活化过夜，培养温度37℃：
(2)种子液制备：从活化菌种的平板上挑菌落扩散效果明显的单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的试管中，在37℃下，以180rpm的速度振荡培养20h；
(3)薄皮观察平板制备：
将灭菌后的第一液体培养基和第二液体培养基在超净工作台上分别倒入灭菌的平板中，每只平板倒入15mL左右的液体，用于薄皮形成的观察。
R31、TR21、R21g9、L1、L2菌株每种培养基3只平板。共需要液体平板30只。分别用新鲜无菌的第一液体培养基或第二液体培养基将LB培养基发酵的种子液稀释到OD600为0.02，要求试验菌种液中芽胞杆菌的浓度达到106CFU/mL以上。在液体平板上滴加9μL稀释的种子液，30℃静置培养3天(3d)拍照。
3、生物被膜形成
(1)如附图1A、1B所示，分别为经过72小时后，枯草芽胞杆菌R31在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮。
(2)如附图2A、2B所示，分别为经过72小时后，枯草芽胞杆菌TR21在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮。
(3)如附图3A、3B所示，分别为经过72小时后，解淀粉芽胞杆菌R21g9在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮。
(4)如附图4A、4B所示，分别为经过72小时后，短芽胞杆菌L1在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮。
(5)如附图5A、5B所示，分别为经过72小时后，胶质芽胞杆菌L2在第一液体培养基和第二液体培养基中形成的薄皮。
4、生物被膜形成能力的判定
如果能够在第一液体培养基中形成完整的薄皮，但不能在第二液体培养基中形成完整薄皮的菌株，判定为属于生物被膜形成能力中等菌株；
如果在第一液体培养基和第二液体培养基中仅能形成漂浮的残缺不全的薄皮，则判定为无生物被膜形成能力或生物被膜形成能力弱的菌株。
如果能够同时在第一液体培养基和第二液体培养基中形成薄皮的，则判定为生物被膜形成能力强的菌株。
在第一液体培养基中越早形成结构稳定薄皮的菌株，则被判定为生物被膜形成能力越强。
由于第一液体培养基和第二液体培养基中使用蛋白胨的不同，芽胞杆菌接入第一液体培养液和第二液体培养基后会经历的生长抑制时间不同，通过观察在第一液体培养基和第二液体培养基形成薄皮的形态、时间长短就可以判断出芽胞杆菌生物被膜形成能力。
实施例2：利用固体培养基评估不同芽胞杆菌的生物被膜形成能力
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例是利用利用固体培养基评估不同芽胞杆菌的生物被膜形成能力。
一、培养基制备
所述培养基包括第一固体培养基和第二固体培养基。
一)第一固体培养基的制备：
(1)按如下配方称取各原料：三水磷酸三钾26.631g，三水柠檬酸三钠9.999g，7水硫酸镁0.2465g，硫酸铵19.82l g，牛肉膏3g，NaCl 5g，胰蛋白胨10g，葡萄糖l g，琼脂15g；
(2)先将磷酸三钾在烧杯中加入900mL蒸馏水，溶解后调pH7.0，然后分别加入上述试剂，搅拌均匀，补足蒸馏水到1000mL，调整培养基溶液的pH值至7.0；115℃灭菌20min。
得包含如下溶质及浓度的所述第一液体培养基，100mM磷酸三钾(pH7.0)，34mM柠檬酸钠，lmM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％胰蛋白胨，0.1％葡萄糖，1.5％琼脂。分装、灭菌、检定后保存。
(3)通过在第一液体培养基中加入1.5％的琼脂制成第一固体培养基。
二)第二固体培养基的制备：
(1)按如下配方称取各原料：磷酸三钾26.631g(pH＝7.0)，二水柠檬酸三钠9.999g，硫酸镁0.2465g，硫酸铵19.821g，牛肉膏3g，NaCl 5g，细菌学蛋白胨10g，葡萄糖1g，琼脂15g；
(2)先将磷酸三钾在烧杯中加入900mL蒸馏水，溶解后调pH7.0，然后分别加入上述试剂，搅拌均匀，补足蒸馏水到1000mL，调整培养基溶液的pH值至7.0；115℃灭菌20min。
得包含如下溶质及浓度的所述第二液体培养基，100mM磷酸三钾(pH7.0)，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％细菌学蛋白胨，0.1％葡萄糖，1.5％琼脂。所述第二液体培养基的pH为7.0。分装、灭菌、检定后保存。
(3)通过在第二液体培养基中加入1.5％的琼脂制成第二固体培养基；
三)液体LB培养基的制备
称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，置入器皿中，加蒸馏水至1000mL；溶化后，调整培养基溶液的pH值至7.0；过滤后，得包含如下溶质及浓度的所述液体LB培养基：胰蛋白胨10mg/mL，酵母提取物5mg/mL，NaCl 10mg/mL，所述液体LB培养基的pH为7.0。分装、灭菌、检定后保存。通过在液体LB培养基中加入15g琼脂粉，制备成固体LB培养基。
二、试验步骤
(1)菌种活化：从-20℃保藏菌种，在固体LB平板上划线活化过夜，培养温度37℃；
(2)种子液制备：从活化菌种的平板上挑菌落扩散效果明显的单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的试管中，在37℃下，以180rpm的速度振荡培养20h；
(3)菌落观察平板制备：
将灭菌后融化的第一固体培养基和第二固体培养基倒平板，用于菌落形成的观察。
R31、TR21、R21g9、L1、L2菌株每种培养基3只平板。共需要固体平板30只。
分别用新鲜无菌的第一液体培养基或第二液体培养基将LB培养基发酵的种子液稀释到OD600为0.02，要求试验菌种液中芽胞杆菌的浓度达到106CFU/mL。在固体平板中间滴5μL稀释的种子液，30℃静置培养3天(3d)拍照。
3、生物被膜形成能力的判定
如果能够在第一固体培养基中形成较大的菌落(72小时后，能菌落直径能达到1cm以上)，但不能在第二固体培养基中形成菌落或菌落小、薄，则判定为属于生物被膜形成能力中等菌株；
如果在第一固体培养基和第二固体培养基中仅能形成残缺不全的小菌落，则判定为无生物被膜形成能力或生物被膜形成能力弱的菌株；
如果能够同时在第一固体培养基和第二固体培养基中形成较大菌落的，则判定为生物被膜形成能力强的菌株；
在第一固体培养基中越早形成较大菌落的菌株，则被判定为生物被膜形成能力越强。
由于第一固体培养基和第二固体培养基中使用蛋白胨的不同，芽胞杆菌接入第一固体培养基和第二固体培养基后会经历的生长抑制时间不同，通过观察在第一固体培养基和第二固体培养基形成菌落的形态、时间长短就可以判断出芽胞杆菌生物被膜形成能力。
实施例3：利用该方法评估Mn及不同浓度的Mn对枯草芽胞杆菌R31生物被膜形成的影响
1、培养基的制备
第一液体培养基和第二液体培养基的制备，以及第一固体培养基和第二固体培养基的制备，同实施例1或实施例2。
2、试验步骤
(1)菌种活化：同实施例1或者实施例2。
(2)种子液制备：同实施例1或者实施例2。
(3)薄皮和菌落观察平板制备：
将灭菌后的第一液体培养基和第二液体培养基在超净工作台上分别倒入灭菌的平板中，每只平板倒入15mL左右的液体，用于薄皮形成的观察。
R31每种培养基3只平板。共需要固体平板6只，液体平板6只。
分别用新鲜无菌的第一液体培养基和第二液体培养基将LB培养基发酵的种子液稀释到OD600为0.02，要求试验菌种液中芽胞杆菌的浓度达到106CFU/mL以上。
将R31菌种液9μL滴加在2种培养液的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h，48h、72h观察薄皮的形成；
在固体平板中间滴5μL稀释的种子液，30℃静置培养，分别在12h、24h，48h、72h观察菌落的形成；
观察如果在第一液体培养基上能够在12h～24h内形成薄皮，但不能在第二液体培养基上在12h～24h内形成薄皮的或超过72h仅在第二液体培养基上形成破碎的不完整漂浮物，则选择该菌株用作检测或评估某种物质是否具备生物被膜形成促进功能。
(4)不同浓度Mn促进R31生物被膜形成的测定
在新鲜的第二液体培养基加入硫酸锰，使硫酸锰的终浓度为(40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、对照组不加硫酸锰)，形成含有不同浓度Mn离子的第三液体培养基，将前述第三液体培养基分别装入灭菌平板，在液体平板上滴加9μL稀释的种子液，30℃静置培养3d拍照；同时，在前述含有不同浓度Mn离子的第三液体培养基中加入1.5％的琼脂制成含有不同浓度Mn离子的第三固体培养基，倒板后，在固体平板中间分别滴加5μL稀释的种子液，30℃静置培养3d拍照。
3、Mn促进枯草芽胞杆菌生物被膜形成
如图6所示，为对照组及不同浓度Mn(40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、140μg/mL)对枯草芽胞杆菌R31在第二液体培养基中形成薄皮的影响；
如图7所示，不同浓度Mn对枯草芽胞杆菌R31在第二固体培养基固体平板上形成菌落的影响；
4、促进生物被膜形成能力的判定
如图6和7所示。在第二液体培养基和第二固体培养基中虽然有细菌学蛋白胨的存在，但是不同浓度的Mn离子的加入，就能够不同程度的促进菌株在第二液体培养基上快速形成稳定的薄皮或者就能够不同程度的促进菌株在第二固体培养基上快速形成完整的菌落；从而得出Mn离子能够有效促进生物被膜能力的形成。
本实施例原理在于，由于第一液体培养基和第二液体培养基的不同在于第二液体培养基中使用细菌学蛋白胨，并同样含有合适的碳源和氮源，但由于细菌学蛋白胨的存在，芽胞杆菌接入第二液体培养基后会经历一个较长时间的生长抑制，如果待测物质能够快速打破菌株的生长抑制，就能够促进菌株在第二液体培养基上快速形成稳定的薄皮；从而可以达到利用第一液体培养基和第二液体培养基的差异性来筛选生物被膜促进物质。同时，上述过程也可以评估不同浓度的待测物质促进生物被膜形成能力的效果。同样对于在第一液体培养基和第二液体培养基的基础上加入琼脂制成第一固体培养基和第二固体培养基而言，同样可以通过第一固体培养基和第二固体培养基的差异性来筛选生物被膜促进物质及利用这种方法评估不同浓度的待测物质促进生物被膜形成能力的效果。

Claims (12)

1.一种评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基，其特征在于，所述培养基包括：
第一液体培养基，所述第一液体培养基包含的溶质及浓度为，100mM磷酸三钾，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％胰蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制备过程中，先将所述磷酸三钾溶入水并调整pH为7.0；所述第一液体培养基的最终pH为7.0；
第二液体培养基，所述第二液体培养基包含的溶质及浓度为，100mM磷酸三钾，34mM柠檬酸钠，1mM硫酸镁，0.1mM硫酸铵，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％细菌学蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制备过程中，先将所述磷酸三钾溶入水并调整pH为7.0；所述第二液体培养基的最终pH为7.0。
2.根据权利要求1所述一种评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的培养基，其特征在于，在第一液体培养基和第二液体培养基中分别加入1.5％的琼脂制成第一固体培养基和第二固体培养基。
3.一种应用权利要求1所述的培养基评估芽胞杆菌生物被膜形成能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将待测菌株用固体LB平板划线，挑取单菌落于液体LB培养基中，在37℃下以180rpm的速度振荡培养20小时，使菌液的OD600值达到0.8以上；
然后用新鲜的LB培养基稀释菌液，使菌液的OD600达到0.02，用作待测菌种液，要求待测菌种液中芽胞杆菌的浓度达到106CFU/mL以上；
将灭菌后的第一液体培养基和第二液体培养基分别加入无菌平板中，将待测菌种液按照0.08％～0.1％的接种量滴加在2种培养液的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h、 48h、72h观察薄皮的形成；
如果能够在第一液体培养基中形成完整的薄皮，但不能在第二液体培养基中形成完整薄皮的菌株，判定为属于生物被膜形成能力中等菌株；
如果在第一液体培养基和第二液体培养基中仅能形成漂浮的残缺不全的薄皮，则判定为无生物被膜形成能力或生物被膜形成能力弱的菌株；
如果能够同时在第一液体培养基和第二液体培养基中形成薄皮的，则判定为生物被膜形成能力强的菌株；
在第一液体培养基中越早形成结构稳定薄皮的菌株，则被判定为生物被膜形成能力越强。
4.一种应用权利要求1所述的培养基评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将选取的芽胞杆菌菌株用固体LB平板划线，挑取单菌落于液体LB培养基中，在37℃下以180rpm的速度振荡培养，20小时，使菌液的OD600值达到0.8以上；
然后用新鲜的LB培养基稀释菌液，使菌液的OD600达到0.02，用作试验菌种液，要求试验菌种液中芽胞杆菌的浓度达到106CFU/mL以上；
将灭菌后的第一液体培养基和第二液体培养基分别加入无菌平板中，将试验菌种液按照0.08％-0.1％的接种量滴加在2种培养基的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h、 48h、72h观察薄皮的形成；
观察如果在第一液体培养基上能够在12h～24h内形成薄皮，但不能在第二液体培养基上在12h～24h内形成薄皮的或超过72h仅在第二液体培养基上形成破碎的不完整漂浮物；
则再次取灭菌后的第二液体培养基，并将待测物质加入第二液体培养基中，形成第三液体培养基；将第三液体培养基加入无菌平板中，并将试验菌种液按照0.08％-0.1％的接种量滴加在该培养基的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h、48h、72h观察薄皮的形成；如果在第三液体培养基上能够在12h～24h内形成薄皮或超过72h能在第三液体培养基上形成完整的漂浮物，则得出待测物质具有生物被膜促进能力；反之亦然。
5.根据权利要求4所述的一种应用权利要求1所述培养基评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法，其特征在于，
再次取灭菌后的第二液体培养基，并将不同浓度的待测物质加入第二液体培养基中，形成含有不同浓度待测物质的第三液体培养基；将含有不同浓度待测物质的第三液体培养基分别加入无菌平板中，之后，将试验菌种液按照0.08％-0.1％的接种量分别滴加在该培养基的表面，盖上皿盖后30℃静置培养，分别在12h、24h、48h、72h观察薄皮的形成；在12h～24h内，如果越早能够在第三液体培养基上形成薄皮的，则得出该浓度的待测物质具有较强的生物被膜促进能力。
6.根据权利要求4或5所述的一种应用权利要求1所述培养基评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法，其特征在于，在第一液体培养基、第二液体培养基及第三液体培养基中，分别加入1.5％的琼脂制成第一固体培养基、第二固体培养基及第三固体培养基，倒板后，将试验菌种液5μL滴加在平板中央，30℃静置培养，别在12h、24h、48h、72h观察菌落的形成；如果在第一固体培养基上能够在12h～24h内形成完整菌落，不能在第二固体培养基上在12h～24h内形成完整菌落的或超过72h仅在第二固体培养基上形成不完整菌落，但在第三固体培养基上在12h～24h内形成完整菌落的或超过72h后在第三固体培养基上形成向周围扩散的菌落，则说明待测物质具有生物被膜促进能力。
7.根据权利要求4或5所述的一种应用权利要求1所述培养基评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法，其特征在于，选取的所述芽胞杆菌菌株为生物被膜形成能力中等的菌株。
8.根据权利要求4或5所述的一种应用权利要求1所述培养基评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法，其特征在于，所述待测物质为Mn离子。
9.根据权利要求7所述的一种应用权利要求1所述培养基评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质的方法，其特征在于，所述Mn离子以硫酸锰的形态加入。
10.权利要求1所述的培养基在评估芽胞杆菌生物被膜形成能力中的应用。
11.权利要求1所述的培养基在评估促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质中的应用。
12.权利要求1所述的培养基在评估具有促进芽胞杆菌生物被膜形成能力的物质不同浓度条件下促进芽胞杆菌生物被膜形成效果中的应用。
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