CN105536069B - 一种羟基磷灰石-石墨烯-壳聚糖三元交联还原复合材料及其制备方法 - Google Patents

一种羟基磷灰石-石墨烯-壳聚糖三元交联还原复合材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羟基磷灰石‑石墨烯‑壳聚糖三元交联还原复合材料及其制备方法，在三元交联还原复合材料的制备过程中，CS的交联反应与石墨烯前驱体氧化石墨烯GO的还原反应同时原位进行；GO原位还原的形成的石墨烯网络结构与原位交联的CS聚合物网络结构复合形成复合网络结构，HA纳米粒子则均匀分布于所形成的复合网络结构中。该复合物具有高的力学性能，高的孔隙率和优良的生物相容性，可改善传统骨组织材料中羟基磷灰石的流失问题以及吸水后机械强度大大下降的问题，有望应用于骨组织修复。

Description

一种羟基磷灰石-石墨烯-壳聚糖三元交联还原复合材料及其 制备方法
技术领域
本发明涉及高分子复合材料技术领域，尤其涉及的是一种羟基磷灰石-石墨烯-壳聚糖三元交联还原复合材料及其制备方法。
背景技术
羟基磷灰石是人骨中无机物的主要成分，具有很好的生物相容性，生物可降解性，同时也有很好的诱导骨生长的功效。目前，商用的人工骨材料几乎都含有羟基磷灰石这种成分，常用的有羟基磷灰石生物陶瓷，珊瑚羟基磷灰石，但它们都存在HA植入体内后会有大量流失，材料太硬，难塑形等缺点。
HA-CS复合材料用于骨组织材料已有较长的历史，文献中有大量报道。CS在体内能降解成为氨基葡萄糖，氨基葡萄糖呈中性或弱碱性，不会引起局部发炎，并可被人体完全吸收。CS还能促进骨细胞和成纤细胞的黏附，分化和增殖。CS和HA均都具有良好的生物相容性，适合用于制备骨修复材料。但CS存在强度低和湿态环境下强度损失过快的问题，而HA则存在脆性大，塑型难的问题。因此将CS和HA进行复合得到的材料既具有CS的柔性和韧性，又具有HA的强度和硬度，能把二者的生物活性结合起来。近年来，两者的复合方法也从简单的溶液混合转变为原位沉淀进一步增加了材料的强度，使其更适合作为骨组织工程支架材料或骨组织替代物。
发明内容
本发明旨在提供一种制备具有高空隙率的微观结构、并有良好的生物活性、高的抗水性以及机械强度，能够长期稳定保存HA以防止其受体液冲刷而流失的壳聚糖(CS)-石墨烯(G)-羟基磷灰石(HA)三元复合骨组织材料及其制备方法。用该方法制备的骨组织材料由于还原和交联过程的同时原位进行，使三种组分在溶液中发生自助装得到能够较好固定HA的微观结构。
本发明的技术方案为：
一种羟基磷灰石-石墨烯-壳聚糖三元交联还原复合材料的制备方法，在三元交联还原复合材料的制备过程中，CS的交联反应与石墨烯前驱体氧化石墨烯GO的还原反应同时原位进行；GO原位还原的形成的石墨烯网络结构与原位交联的CS聚合物网络结构复合形成复合网络结构，HA纳米粒子则均匀分布于所形成的复合网络结构中。
所述的制备方法，具体包括以下步骤：将GO溶于蒸馏水，并超声分散；取HA粉末加入GO水溶液中，用磁力搅拌使其均匀分散于溶液中形成GO-HA溶液，再将GO-HA溶液超声分散得到褐色均匀溶液；向所述褐色均匀溶液中加入冰乙酸，并加入CS粉末，磁力搅拌，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液；向所述粘稠的褐色溶液中加入NaVC还原GO，随即加入交联剂GLP溶液，磁力搅拌10min，使NaVC，GLP充分分散溶解于体系中；将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中放置24小时，即得到HA-G-CS水凝胶。
所述的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)配制氧化石墨烯(GO)水溶液：将GO溶于蒸馏水，并600W超声30min；
(2)配制京尼平(GLP)溶液：称取适量GLP于烧杯中，加入一定量的乙醇，500r/min磁力搅拌30min使GLP溶解，然后用乙醇溶液定容于10mL容量瓶中备用；
(3)配制GO-HA溶液：称取一定量的HA粉末加入GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌10min使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液；
(4)配制HA-GO-CS溶液：向步骤(3)所得的溶液中加入少量冰乙酸，并加入一定量CS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液；
(5)加入还原剂和交联剂：向步骤(4)中所得到的溶液中加入NaVC，随即加入GLP溶液，500r/min磁力搅拌10min，使NaVC，GLP充分分散溶解于体系中；
(6)HA-G-CS三元复合水凝胶的形成：将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中放置24小时，即得到HA-G-CS水凝胶。
所述的制备方法，所述GO水溶液中GO的质量分数为0.3％～1.5％。
所述的制备方法，所述GLP溶液中GLP的质量分数为5％。
所述的制备方法，所述HA粉末的量为GO水溶液质量的5～30％。
所述的制备方法，所加入的冰乙酸为GO水溶液体积的2％，加入的CS粉末为GO水溶液质量的1～3％.
所述的制备方法，所加入的NaVC的质量为GO水溶液质量的1％～7.5％，加入GLP溶液为GO水溶液体积的2.5％～15％。
所述的制备方法，形成水凝胶的烘箱温度控制在30-80℃。
任一所述的制备方法制备的羟基磷灰石-石墨烯-壳聚糖三元交联还原复合材料。
根据上述的制备方法制备的HA-G-CS三元水凝胶具有以下优点：
1、该方法制备的骨组织材料中和了HA无机材料的强度与硬度以及CS高分子材料的韧性，使其达到刚韧平衡的效果。
2、交联，还原使个组分发生自组装，结构更加紧凑，在吸水后强度损失也相对较小。
3、有良好的细胞活性，能很好的促进骨细胞的分化增殖，有较大比表面积有利于细胞的附着，还有很好的生物可降解性。
4、GO片层，CS分子链与HA纳米颗粒在原位还原和交联反应的过程中自组装得到一种具有高孔隙率的微观结构。该复合物同时具有HA提供的强度以及CS提供的韧性，石墨烯片层的高比表面积为骨组织细胞的诱导生长提供了有利条件，CS的引入同时还起到防止HA流失的作用。。
附图说明
图1.实施例一(a),实施例一对比例一(b)和实施例一对比例二(c)的数码照片；
图2.实施例一标尺为1mm(a)，实施例一标尺为100μm的电镜照片(b)；
图3.实施例一及其对比例一，二，实施例二及其对比例一，二的储能模量；
图4.蒸馏水(a)及对比例三(b)、对比例四(c)、对比例五(d)、实施例一(e)、实施例一的对比例一(f)和实施例一的对比例二(g)分散于等质量蒸馏水中的数码照片；
图5.实施例一，对比例三，四，五的体外细胞培养情况。
具体实施方式
以下实施例只是几种典型的实施方式，并不能起到限制本发明的作用，本领域的技术人员可以参照实施例对技术方案进行合理的设计，同样能够获得本发明的结果。
实施例一
原位还原和交联的HA-G-CS三元复合材料(HA1.2g)
(1)配制GO水溶液：用GO固体1g溶于100mL蒸馏水，并600W超声30min备用。
(2)配制GLP溶液：称取0.5gGLP粉末于烧杯中，加入少量乙醇，500r/min磁力搅拌30min使GLP溶解，最后将其定容于10mL容量瓶备用。
(3)配制GO-HA溶液：称取1.2gHA粉末加入20mL上述GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌10min使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液。
(4)配制HA-GO-CS溶液：向步骤(3)中所得溶液中加入0.4mL冰乙酸，并加0.6gCS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液。
(5)加入还原剂和交联剂：向步骤(4)中得到的溶液中加入1gNaVC，随即加入上述GLP溶液3mL，500r/min磁力搅拌10min，使NaVC，GLP充分分散溶解于体系中。
(6)HA-G-CS三元复合水凝胶的形成：将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中50℃放置24小时，即可得到HA-G-CS水凝胶。
为方便体外细胞培养和流变测试，样品需做成直径大约为25mm，厚度为2～3mm的薄片，所以在上述操作第6步之前，将烧杯中的粘稠液体转移到特定大小的模具中。
实施例一的对比例一：原位交联的HA-G-CS三元复合材料的制备
(1)配制GO水溶液：用GO固体1g溶于100mL蒸馏水，并600W超声30min备用。
(2)配制GLP溶液：称取0.5gGLP粉末于烧杯中，加入少量乙醇，500r/min磁力搅拌30min使GLP溶解，最后将其定容于10mL容量瓶备用。
(3)配制GO-HA溶液：称取1.2gHA粉末加入20mL上述GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌10min使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液。
(4)配制HA-GO-CS溶液：向步骤(3)中所得溶液中加入0.4mL冰乙酸，并加0.6gCS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液。
(5)加入交联剂：向步骤(4)中得到的溶液中加入上述GLP溶液3mL，500r/min磁力搅拌10min，使GLP充分分散溶解于体系中。
(6)HA-G-CS三元复合水凝胶的形成：将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中50℃放置24小时，即可得到HA-G-CS水凝胶。
为方便体外细胞培养和流变测试，样品需做成直径大约为25mm，厚度为2～3mm的薄片，所以在上述操作第6步之前，将烧杯中的粘稠液体转移到特定大小的模具中。
实施例一的对比例二：原位还原的HA-G-CS三元复合材料
(1)配制GO水溶液：用GO固体1g溶于100mL蒸馏水，并600W超声30min备用。
(2)配制GLP溶液：称取0.5gGLP粉末于烧杯中，加入少量乙醇，500r/min磁力搅拌30min使GLP溶解，最后将其定容于10mL容量瓶备用。
(3)配制GO-HA溶液：称取1.2gHA粉末加入20mL上述GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌10min使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液。
(4)配制HA-GO-CS溶液：向步骤(3)中所得溶液中加入0.4mL冰乙酸，并加0.6gCS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液。
(5)加入还原剂：向步骤(4)中得到的溶液中加入1gNaVC，500r/min磁力搅拌10min，使NaVC充分分散溶解于体系中。
(6)HA-G-CS三元复合水凝胶的形成：将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中50℃放置24小时，即可得到HA-G-CS水凝胶。
为方便体外细胞培养和流变测试，样品需做成直径大约为25mm，厚度为2～3mm的薄片，所以在上述操作第6步之前，将烧杯中的粘稠液体转移到特定大小的模具中。
实施例二
原位还原和交联的HA-G-CS三元复合材料的制备(HA4.8g)
(1)配制GO水溶液：用GO固体1g溶于100mL蒸馏水，并600W超声30min备用。
(2)配制GLP溶液：称取0.5gGLP粉末于烧杯中，加入少量乙醇，500r/min磁力搅拌30min使GLP溶解，最后将其定容于10mL容量瓶备用。
(3)配制GO-HA溶液：称取4.8gHA粉末加入20mL上述GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌10min使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液。
(4)配制HA-GO-CS溶液：向步骤(3)中所得溶液中加入0.4mL冰乙酸，并加0.6gCS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液。
(5)加入还原剂和交联剂：向步骤(4)中得到的溶液中加入1gNaVC，随即加入上述GLP溶液3mL，500r/min磁力搅拌10min，使NaVC，GLP充分分散溶解于体系中。
(6)HA-G-CS三元复合水凝胶的形成：将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中50℃放置24小时，即可得到HA-G-CS水凝胶。
为方便体外细胞培养和流变测试，样品需做成直径大约为25mm，厚度为2～3mm的薄片，所以在上述操作第6步之前，将烧杯中的粘稠液体转移到特定大小的模具中。
实施例二的对比例一：原位交联的HA-G-CS三元复合材料的制备
(1)配制GO水溶液：用GO固体1g溶于100mL蒸馏水，并600W超声30min备用。
(2)配制GLP溶液：称取0.5gGLP粉末于烧杯中，加入少量乙醇，500r/min磁力搅拌30min使GLP溶解，最后将其定容于10mL容量瓶备用。
(3)配制GO-HA溶液：称取4.8gHA粉末加入20mL上述GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌10min使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液。
(4)配制HA-GO-CS溶液：向步骤(3)中所得溶液中加入0.4mL冰乙酸，并加0.6gCS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液。
(5)加入交联剂：向步骤(4)中得到的溶液中加入上述GLP溶液3mL，500r/min磁力搅拌10min，使GLP充分分散溶解于体系中。
(6)HA-G-CS三元复合水凝胶的形成：将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中50℃放置24小时，即可得到HA-G-CS水凝胶。
为方便体外细胞培养和流变测试，样品需做成直径大约为25mm，厚度为2～3mm的薄片，所以在上述操作第6步之前，将烧杯中的粘稠液体转移到特定大小的模具中。
实施例二的对比例二：原位还原的HA-G-CS三元复合材料的制备
(1)配制GO水溶液：用GO固体1g溶于100mL蒸馏水，并600W超声30min备用。
(2)配制GLP溶液：称取0.5gGLP粉末于烧杯中，加入少量乙醇，500r/min磁力搅拌30min使GLP溶解，最后将其定容于10mL容量瓶备用。
(3)配制GO-HA溶液：称取4.8gHA粉末加入20mL上述GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌10min使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液。
(4)配制HA-GO-CS溶液：向步骤(3)中所得溶液中加入0.4mL冰乙酸，并加0.6gCS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液。
(5)加入还原剂：向步骤(4)中得到的溶液中加入1gNaVC，500r/min磁力搅拌10min，使NaVC充分分散溶解于体系中。
(6)HA-G-CS三元复合水凝胶的形成：将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中50℃放置24小时，即可得到HA-G-CS水凝胶。
为方便体外细胞培养和流变测试，样品需做成直径大约为25mm，厚度为2～3mm的薄片，所以在上述操作第6步之前，将烧杯中的粘稠液体转移到特定大小的模具中。
对比例三
HA体系
向碾钵中加入12g纳米HA，在加入8g硬脂酸，充分碾磨。
称取其中的2g，用粉末压片模具压制成直径为25mm，厚度为2～3mm的薄片，压片条件为10MPa，保压时间2min。
将薄片放于马弗炉中500℃烧结2h，并在马弗炉退火到室温后取出样品。
对比例四
GO-HA体系
(1)配制GO水溶液：将用改进的hummer法合成的GO固体1g溶于100mL蒸馏水，并600W超声30min备用。
(2)配制GO-HA溶液：称取1.2gHA粉末于20mL上述GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液。
(3)水热还原GO形成水凝胶：往上述溶液中加入0.3mL质量分数为30％的氨水，500r/min磁力搅拌10min，将溶液转移到100mL的水热釜中在180℃的条件下反应8h，最后得到GO-HA水凝胶。
为方便体外细胞培养和流变测试，样品需做成直径大约为25mm，厚度为2～3mm的薄片，所以在上述操作结束后，用不锈钢刀片将形成的柱状水凝胶切成厚度为2～3mm的薄片。
对比例五
HA-CS体系
(1)配制HA溶液：称取1.2gHA粉末于20mL蒸馏水中，用500r/min磁力搅拌使其均匀分散于溶液中，再将HA溶液600W超声30min，得到乳白色均匀溶液。
(2)配制HA-CS溶液：往上述溶液中加入0.4mL冰乙酸，并加0.6gCS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的乳白色溶液。
(3)冻干得到气凝胶：将形成的水凝胶放置于冰箱急冻室中12h，再将其用冻干机-50℃，20Pa的条件下冻干得到气凝胶。
(4)气凝胶的后处理：将冻干后的水凝胶浸没于质量分数5％的HaOH溶液中12h，再将其浸没于蒸馏水中并每2h换一次水，直到溶液呈中性为止，最后-50℃，20Pa的条件下冻干得到最终产品。
为方便体外细胞培养和流变测试，样品需做成直径大约为25mm，厚度为2～3mm的薄片，所以在上述操作第3步之前，将烧杯中的粘稠液体转移到特定大小的模具中。
实施例一及实施例一对比例一，二材料的数码照片如图1所示。可见，实施例一相对于制备其的烧杯直径有明显的收缩，并且材料收缩均匀，没有出现如实施例一对比例一的分层行为。实施例二及实施例二对比例一，二材料的数码照片类似于实施例一及实施例一对比例一，二。
实施例一的SEM照片如图2所示，GLP使CS分子链互相交织形成尺寸较大的片层，GO片层随即贴在CS片层上，并同时将HA夹杂在片层之间，NaVC还原GO，使大片层上的G片层之间相互的Π-Π作用增加，从而使较大的片层能够交叠在一起，使宏观体积产生收缩，强度得到增加。
实施例一及其对比例一，二，实施例二及其对比例一，二的流变曲线如图3所示。可见，原位交联和还原的复合材料的产品力学强度最高，这是因为材料在制备的过程中发生收缩，内部结构更紧凑。同时材料的韧性也较好，韧性对骨组织材料是极其重要的。相对于实施例一，实施例二加入的HA含量较高，所以强度得到进一步的提高。对比例三则太软。对比例四，五由于并未引入CS，材料都比较硬，易脆。综上所述，原位交联还原的三元复合材料的力学性能较好的综合了HA的刚性CS的韧性，达到刚韧平衡。
图4是取冻干后含有相同HA质量的对比例三，四，五，实施例一，实施例一的对比例一，二这六种样品分散于相同量的蒸馏水中的溶液状态。该图在一定程度上能够说明材料对HA纳米粒子的固定能力。图4中从左到右依次是蒸馏水，对比例三，对比例四，对比例五，实施例一，实施例一的对比例一，二，从图中，我们可以看出加入的有CS的后4种样品对HA纳米粒子的固定能力都比较好，这是由于CS分子链对HA的粘连作用的原因。由于HA是人骨中本身含有的物质，具有很高的生物活性，所以对HA的固定能力越强，它在体内能持续释放成骨细胞生长所需要的钙磷离子的时间越长，材料诱导成骨细胞增殖分化的能力也就越强。
取相同质量清洗后并冻干的样品，对其进行高温高压杀菌消毒处理后，用模拟体液作为培养液，并对相同量的间充质干细胞进行培养。图5为荧光显微镜对染色后的细胞的观察情况，对四种样品中细胞所占观测区域的面积做了统计平均得到以下数据。从图5可见，原位还原和交联的HA-G-CS三元复合材料上培养的细胞增值率最高，说明该发明所制备的材料有很好的生物活性，在骨材料上有很好的应用前景。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种羟基磷灰石-石墨烯-壳聚糖三元交联还原复合材料的制备方法，其特征在于：在三元交联还原复合材料的制备过程中，CS的交联反应与石墨烯前驱体氧化石墨烯GO的还原反应同时原位进行；GO原位还原形成的石墨烯网络结构与原位交联的CS聚合物网络结构复合形成复合网络结构，HA纳米粒子则均匀分布于所形成的复合网络结构中；具体包括以下步骤：将GO溶于蒸馏水，并超声分散；取HA粉末加入GO水溶液中，用磁力搅拌使其均匀分散于溶液中形成GO-HA溶液，再将GO-HA溶液超声分散得到褐色均匀溶液；向所述褐色均匀溶液中加入冰乙酸，并加入CS粉末，磁力搅拌，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液；向所述粘稠的褐色溶液中加入NaVC还原GO，随即加入交联剂GLP溶液，磁力搅拌10min，使NaVC，GLP充分分散溶解于体系中；将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中放置24小时，即得到HA-G-CS水凝胶。
2.根据权利 要求1所述的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)配制氧化石墨烯(GO)水溶液：将GO溶于蒸馏水，并600W超声30min；
(2)配制京尼平(GLP)溶液：称取适量GLP于烧杯中，加入一定量的乙醇，500r/min磁力搅拌30min使GLP溶解，然后用乙醇溶液定容于10mL容量瓶中备用；
(3)配制GO-HA溶液：称取一定量的HA粉末加入GO水溶液中，用500r/min磁力搅拌10min使其均匀分散于溶液中，再将GO-HA溶液600W超声30min，得到褐色均匀溶液；
(4)配制HA-GO-CS溶液：向步骤(3)所得的溶液中加入少量冰乙酸，并加入一定量CS粉末，500r/min磁力搅拌2h，使CS充分溶解，得到粘稠的褐色溶液；
(5)加入还原剂和交联剂：向步骤(4)中所得到的溶液中加入NaVC，随即加入GLP溶液，500r/min磁力搅拌10min，使NaVC，GLP充分分散溶解于体系中；
(6)HA-G-CS三元复合水凝胶的形成：将得到的粘稠褐色溶液至于烘箱中放置24小时，即得到HA-G-CS水凝胶。
3.根据权利 要求2所述的制备方法，其特征在于：所述GO水溶液中GO的质量分数为0.3％～1.5％。
4.根据权利 要求2所述的制备方法，其特征在于：所述GLP溶液中GLP的质量分数为5％。
5.根据权利 要求2所述的制备方法，其特征在于：所述HA粉末的量为GO水溶液质量的5～30％。
6.根据权利 要求2所述的制备方法，其特征在于：所加入的冰乙酸为GO水溶液体积的2％，加入的CS粉末为GO水溶液质量的1～3％。
7.根据权利 要求2所述的制备方法，其特征在于：所加入的NaVC的质量为GO水溶液质量的1％～7.5％，加入GLP溶液为GO水溶液体积的2.5％～15％。
8.根据权利 要求3所述的制备方法，其特征在于：形成水凝胶的烘箱温度控制在30-80℃。
9.根据权利要求1-8任一所述的制备方法制备的羟基磷灰石-石墨烯-壳聚糖三元交联还原复合材料。
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