CN105535598B - 一种高粱壳和荞麦壳混合水提抑菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物源农业副产品抑菌剂的制备，具体涉及高粱壳和荞麦壳混合水提金黄色葡萄球菌抑制剂的制备；所要解决的技术问题是提供一种植物源农业副产品抑菌剂；为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种高粱壳和荞麦壳混合水提抑菌剂，采用高粱壳和荞麦壳为原料，将洗净的原料等质量混合后，按照常规的中药煎煮方法获得药液，经灭菌后，即得到抑菌剂；根据试验检测，本发明得到的抑菌剂的MBC与MIC接近，均为0.25g/mL；高粱壳和荞麦壳混合后进行水提具有协同作用，能够显著提高水提液的抑菌或杀菌活性，对金黄色葡萄球菌的抑菌或杀菌效果远好于二者的单独水提液或者单独水提后的混合液。

Description

一种高粱壳和荞麦壳混合水提抑菌剂

技术领域

本发明涉及植物源农业副产品抑菌剂的制备，具体涉及高粱壳和荞麦壳混合水提金黄色葡萄球菌抑制剂的制备。

背景技术

抗生素从诞生至今已成为人类与畜禽抵御及杀死病原菌的有力武器。天然抗生素及合成、半合成种类已有上千种，目前广泛应用畜禽养殖的种类有几十种，尽管抗生素类药物因具有防病治病见效快，提高畜禽生产性能，降低养殖成本等优点而被广泛应用。但是近年来，越来越多的细菌对抗生素产生了耐药性，且耐药性不断增强，致使临床感染死亡率不断增高。

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，在自然界中，金黄色葡萄球菌可广泛在空气、水、土地、尘埃以及动物机体的排泄物中存活。对动物机体而言，金黄色葡萄球菌主要分布在皮肤、口咽、鼻腔和头发上，是一种重要的人畜共患致病菌。它通过分泌溶血素、肠毒素、杀白细胞素、血聚凝固酶、表皮剥落毒素等多种毒力因子，可以逃过宿主细胞的免疫识别，是奶牛、奶羊乳房炎的常见致病因素，更是污染人畜食物造成食物中毒的“罪魁祸首”。

甲氧西林是第一代合成青霉素，用于治疗金葡菌感染取得良好效果。由于抗生素在临床上的广泛使用甚至滥用，临床很快就分离到对甲氧西林耐药的金葡菌（MRSA）。一份2007年-2014年的统计数据表明，MRSA感染发病率逐年上升，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经成为耐药菌感染的主要病原菌之一。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌除了对B—内酰胺类抗生素(青霉素类和头抱菌素及含酶抑制剂的抗生素)产生耐药外，临床上分离到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同时还对氯霉素、氨基苷类、林可霉素、四环素类和大环内酯类抗生素以及喹诺酮类药物也具有不同程度的耐药性，呈现对多种抗生素耐药的特点。MRSA感染在世界范围内面临严峻局面，迫切需要开发新的抗金葡菌感染的药物。因此，寻求安全有效抗生素替代品的抑制剂尤为重要。

植物抑菌作用是指植物的提取物在体外能抑制防止微生物生长繁殖或者具有杀灭作用，其机理主要是干扰微生物的代谢过程，影响其结构与功能，如干扰细菌细胞壁的合成，影响细胞膜的通透性，阻碍菌体蛋白质的合成和抑制核酸合成等。对于大多数植物来源药物，它们价格低廉，资源丰富，而且毒副作用小或无，对动物来说不易产生抗药性，无论是在理论方面还是应用方面，从植物中筛选抑菌药物均具有非常重要的意义，已成为科学研究领域的热点，受到国外学者的广泛重视。

我国是自然资源大国，植物资源丰富、品种繁多、药源广泛，属纯天然有机物。早在建国初期，我国医药工作者就开始重视研究药用植物的抑菌效果，筛选出了一些具有抑菌效果的药材，但对非药用植物的抑菌研究还较少。我国也是资源浪费最严重的国家，这严重不符合可持续发展的基本与要求。为了改善这一现状，本发明充分利用农作物废弃资源，变废为宝，利用生长于我国北方，抗逆性强的荞麦和高粱的农业副产品荞麦壳和高粱壳，经过混合煎煮水提法获得抑菌效果显著的金黄色葡萄球菌抑制剂。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是提供一种植物源农业副产品抑菌剂。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种高粱壳和荞麦壳混合水提抑菌剂，采用高粱壳和荞麦壳为原料，将洗净的原料等质量混合后，按照常规的中药煎煮方法获得药液，经灭菌后，即得到抑菌剂。

根据试验检测，本发明得到的抑菌剂的MBC（最小杀菌浓度）与MIC（最小抑菌浓度）接近，均为0.25g/mL。

在煎煮过程中，为了提高提取效率，可能需要在煎煮时添加较多的水，或者多次煎煮，因此，得到的提取液一般浓度都会比较低，为了不影响抑菌或者杀菌效果，通常还需要进行浓缩，使得药液的浓度至少达到0.25g/mL。在不影响药物活性的情况下，理论上可以浓缩至成固体膏。为了便于储存以及实验对比研究，本领域技术人员可以根据实际需要选择浓缩至何种浓度，如本发明的优选方案为浓缩至MIC的八倍浓度，即2g/mL。

本发明抑菌剂优选的制备方法，包括以下步骤：将高粱壳和荞麦壳按质量比1：1混合，混合物与水按质量体积比120：1000（g:mL）浸泡10-24小时，然后强火加热至微沸后改用文火，保持20-50min；将煮制液过滤，收集滤液；滤渣加混合物用水的一半，再次煎煮、过滤；合并两次滤液为药液，将药液浓缩至浓度为0.25-2g/mL；浓缩液经灭菌两次后，得到水提抑菌剂；灭菌条件为：121℃，0.1MPa，高压蒸汽灭菌20min；两次灭菌间隔24h。

上述制备方法中，混合物与水的混合比例为优化的配比，水太少不能将有效成分充分提取，造成原材料浪费；水太多则浓缩工序费时。但是水的添加量只要能够保证正常的药物提取，就不会影响本发明所述的抑菌剂的效果。多次煎煮的目的也是为了充分提取出有效成分，因此是否进行二次煎煮滤渣或者多次煎煮滤渣都是本领域技术人员可以常规选择的。灭菌的方式和具体条件也同样不是影响本发明抑菌剂效果的主要因素。

影响本发明抑菌剂效果的主要因素是药液的浓度。药液的浓度高于MBC或者MIC就可以。本发明在优选方案中将药液浓度限定为0.25-2g/mL，是为了研究和使用方便。实际将药液浓缩至更高浓度或者直接做成活性干粉，也是可以的。

本发明的抑菌剂主要用途是用作金黄色葡萄球菌的抑菌剂或者杀菌剂。

试验组设置：

组别1是荞麦壳单独水提液；

组别2 是高粱壳单独水提液；

组别3是荞麦壳与高粱壳单独水提液的混合物（荞麦壳单独水提液与高粱壳单独水提液浓缩为各15mL，比例为1:1）；

组别4是荞麦壳与高粱壳混合水提液（本发明所述的抑菌剂）。

单独水提液的制备方法按照如下步骤：取荞麦壳或者高粱壳60g，装于1000ml烧杯中，加入蒸馏水1000mL，浸泡过夜；强火加热至微沸后改用文火，保持30min；使用六层纱布过滤，收集滤液；残渣加水500mL，按上法煎煮过滤，合并两次滤液；使用旋转蒸发器对滤液进行蒸发，浓缩至药液为30mL，即药液浓度为2g /mL，在121℃，0.1MPa,高压蒸汽灭菌20min，24h后再灭菌一次，于4℃冰箱中保存，备用。

混合水提液的制备方法按照如下步骤：取荞麦壳、高粱壳各60g，装于1000ml烧杯中，加入蒸馏水1000mL,浸泡过夜；强火加热至微沸后改用文火，保持30min；将煮制液使用六层纱布过滤，收集滤液；滤渣加水500mL，同上法再次煎煮过滤，合并两次滤液；使用旋转蒸发器对合并滤液进行蒸发，浓缩至30mL，即药液浓度为2g/mL，在121℃，0.1MPa,高压蒸汽灭菌20min，24h后再灭菌一次，于4℃冰箱中保存，备用。

1、高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌的MIC（最小抑菌浓度）的测定

本发明采用平皿打孔法测定和二倍稀释法，用无菌水依次稀释不同组别提取液1/2、1/4、1/8、1/16倍，即最终药液浓度分别为2、1、0.5、0.25、0.125g/mL。

在无菌条件下，用移液枪吸取供试金黄色葡萄球菌液80μL于营养琼脂培养基上，并用涂布器均匀涂布，待菌液吸收5分钟，加入50μL不同稀释浓度的提取物，静置2h后于37℃恒温箱中倒置培养24h，观察结果并测定抑菌圈直径，结果显示高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC是0.25g/mL，抑菌圈的直径为2.65cm。

2、高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌的MBC（最小杀菌浓度）的测定

分别取2、1、0.5、0.25、0.125g/mL浓度的高粱壳和荞麦壳混合水提液100μL，并加入100μL过夜培养至对数增长期的金黄色葡萄球菌菌液，菌液用酶标仪测OD600值=0.4 (相当于5×l0⁸CFU/mL)，吹打、混合均匀菌液和混合提取物后静置于37℃温箱培养24h后, 将每孔的细菌吹打均匀后导入营养琼脂平板，无菌株生长的最低浓度为菌株的MBC值，试验需要重复3次，取其平均值，以不加药物的菌悬液作为阳性对照, 本发明中高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度测定为0.25g/mL。

3、高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响

取0.125g/mL浓度的高粱壳和荞麦壳混合水提液100μL，并加入900μL营养琼脂液体培养基，以无菌水代替混合水提液加入900μL营养琼脂液体培养基作为空白对照。培养5h后，每隔0.5h测菌液吸光度OD600。以时间为横坐标，菌液吸光度为纵坐标，描绘细菌的生长曲线。与空白对照相比，在高粱壳和荞麦壳混合水提液作用下，金黄色葡萄球菌进入对数生长期的时间点和对数生长期延续时间未有明显改变，但生长受到明显抑制，无法达到生长高峰。

现有技术中对高粱醇提物的抑菌活性、假高粱挥发油的抑菌活性和荞麦壳水提物的抑菌活性进行了研究。但未有将二者共同研究的报道。根据本发明的技术，将高粱壳和荞麦壳混合后进行水提，得到的药液的抑菌活性明显优于二者的单独水提液或者单独水提后的混合液。高粱壳和荞麦壳混合后进行水提具有协同作用，能够显著提高水提液的抑菌或杀菌活性，对金黄色葡萄球菌的抑菌或杀菌效果远好于二者的单独水提液或者单独水提后的混合液。

对本发明所涉及的药液的浓度进行解释如下：由于中药煎剂的药物浓度不容易计量，在有效成份不能完全确认的情况下，中药煎剂的药液浓度一般以每毫升药液相当于含有原生药的重量计量。例如，本发明的抑菌剂制备，高粱壳60g、荞麦壳60g，加水1000mL煎煮、过滤后的药液浓缩至30mL，则每毫升药液相当于含有原生药量高粱壳2g、荞麦壳2g。若为单独水提液，同样的制备条件，每毫升药液相当于含有原生药量高粱壳2g或者荞麦壳2g。该浓度计量方式是本领域的常规方式，简记为g/mL的浓度单位形式，由于本发明所述的两种原料质量比为1：1，为了表述方便，将药液的浓度记为**g/mL的形式，其实际指的是每毫升的药液中含有相当于两种原料的生药量为各**g。

附图说明

下面结合附图对本实用新型作进一步说明。

图1为高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌的MIC的测定（中央对照为水）。

图2为高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌的MIC的测定（中央对照为浓度0.125g/mL的提取液）。

图3为高粱壳和荞麦壳单独水提液的混合物对金黄色葡萄球菌的MIC的测定（中央对照为水）。

图4为高粱壳单独水提液对金黄色葡萄球菌的MIC的测定（中央对照为水）。

图5为荞麦壳单独水提液对金黄色葡萄球菌的MIC的测定（中央对照为水）。

图6为高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。

具体实施方式

以下结合具体实验过程对本发明作进一步说明。

1、材料

本发明所用荞麦壳及高粱壳均采购自山西省忻州市五台县。金黄色葡萄球菌菌种（ATCC 26003）购自中国药品生物制品鉴定所。

2、试剂

营养琼脂培养基（天津市英博生化试剂有限公司）；牛肉膏、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；氯化钠（天津市福晨化学试剂厂)；氢氧化钠（天津市光复科技发展有限公司）。

3、主要仪器

MP4002型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；C21-SDHCB15型超薄电磁炉（浙江绍兴苏泊尔股份有限公司）；RE-2000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-B型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；BCD-217B/V型冷藏冷冻箱（青岛海尔股份有限公司）；HRHPY-100型恒温培养摇床、HRHH-150SC型恒温恒湿箱：青岛海尔特种电冰柜有限公司；SUNRISE型酶标仪 （T-CAN上海贸易有限公司）；YXQ-LS-30SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器；YE4A316580型移液枪（容量：10-100μL）。

4、实施步骤

4.1、高粱壳和荞麦壳单独或混合水提液的制备与试验组别设置：

单种植物水提法：取荞麦壳、高粱壳各60g，分别装于1000mL烧杯中，加入蒸馏水1000mL，浸泡过夜；强火加热至微沸后改用文火，保持30min；使用六层纱布过滤，收集滤液；残渣加水500mL，按上法煎煮过滤，合并两次滤液；使用旋转蒸发器对滤液进行蒸发，浓缩至30mL，即药液浓度为2g/mL生药，在121℃，0.1MPa,高压蒸汽灭菌20min，24h后再灭菌一次，于4℃冰箱中保存，备用。

混合植物水提法：取荞麦壳、高粱壳各60g，装于1000mL烧杯中，加入蒸馏水1000mL,浸泡过夜；强火加热至微沸后改用文火，保持30min；将煮制液使用六层纱布过滤，收集滤液；滤渣加水500mL，同上法再次煎煮过滤，合并两次滤液；使用旋转蒸发器对合并滤液进行蒸发，浓缩至30mL，即药液浓度为2g/mL，在121℃，0.1MPa,高压蒸汽灭菌20min，24h后再灭菌一次，于4℃冰箱中保存，备用。

试验组的设置：

组别1是荞麦壳单独水提液，每毫升水提液相当于含有荞麦壳2g；

组别2 是高粱壳单独水提液，每毫升水提液相当于含有高粱壳2g；

组别3是荞麦壳与高粱壳单独水提液混合物，荞麦壳单独水提液与高粱壳单独水提液浓缩为各15mL，比例为1:1混合，每毫升混合物相当于含有荞麦壳2g和高粱壳2g；

组别4是荞麦壳与高粱壳混合水提液，每毫升水提液相当于含有荞麦壳2g和高粱壳2g。

4.2、培养基的制备：

营养琼脂培养基按常规方法制备，在121℃，0.1MPa,高压蒸汽灭菌20min，并适量灌制于灭菌后的培养皿中。

4.3、菌种的复苏与活化培养

将金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂的固体培养基上，37℃过夜培养，取1个d＞lmm的菌落于5mL无菌营养琼脂液体培养基中，37℃摇床50rmp过夜培养至对数生长期。

4.4、不同组别水提液对金黄色葡萄球菌的MIC（最小抑菌浓度）和MBC（最小杀菌浓度）的测定

本发明采用二倍稀释法稀释药液，分别用移液枪吸取2g/mL不同组别的提取液或者提取液混合物，用无菌水依次稀释1/2、1/4、1/8、1/16倍，即最终药液浓度分别为2、1、0.5、0.25、0.125g/mL。

本发明最小抑菌浓度采用平皿打孔法测定。在无菌条件下，用移液枪吸取供试金黄色葡萄球菌液80μl于营养琼脂培养基上，并用涂布器均匀涂布，待菌液吸收5分钟，用直径为4.4mm的打孔器在每个平皿培养基上等距离打孔，中心1孔，外围4孔，去除孔内琼脂。每个组别分别在外围4孔中加入50μL浓度分别为2、1、0.5、0.25 g/mL的提取物，中心一孔加入等量无菌水作为对照，每个浓度药液对试验菌均做3个平行试验，静置2h后于37℃恒温箱中倒置培养24h，观察结果并测定抑菌圈直径，抑菌圈直径取其平均值。

结果显示不同组别抑菌圈直径大小为：组别1＜组别2 ≈组别3＜组别4。荞麦壳的抑菌效果（图5）次于高粱壳（图4），MIC是2g/mL，抑菌圈的直径为0.9cm；荞麦壳和高粱壳单独提取物的简单混合液抑菌效果（图3）与高粱壳的基本一致，MIC是1g/mL，抑菌圈的直径为1.28cm；组别4高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果（图1）最好，MIC是0.25g/mL，抑菌圈的直径为2.65cm。

MBC（最小杀菌浓度）的测定，分别取1、0.5、0.25、0.125g/mL浓度不同组别的水提液100μL，并加入100μL过夜培养至对数增长期的金黄色葡萄球菌菌液，菌液用酶标仪测OD600值=0.4 (相当于5×l08CFU/mL)，吹打、混合均匀菌液和混合提取物后静置于37℃温箱培养24h后, 将每孔的细菌吹打均匀后导入营养琼脂平板，无菌株生长的最低浓度为菌株的MBC值，试验需要重复3次，取其平均值，以不加药物的菌悬液作为阳性对照。

结果显示：荞麦壳单独水提液只有抑菌效果，没有杀菌效果；高粱壳单独水提液或与荞麦壳单独水提液的简单混合物在浓度为2g/mL时有杀菌效果，而组别4高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度测定为0.25g/mL。

根据上述实验结果可知，采用荞麦壳和高粱壳混合进行水提，得到的水提液的抑菌效果和杀菌效果均具有显著的优势。

4.5高粱壳和荞麦壳混合水提液对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响

取0.125g/mL浓度的高粱壳和荞麦壳混合水提液100μL，并加入900μL营养琼脂液体培养基，以无菌水代替混合水提液加入900μL营养琼脂液体培养基作为空白对照。培养5h后，每隔0.5h测菌液吸光度OD600。以时间为横坐标，菌液吸光度为纵坐标，描绘细菌的生长曲线。如图6所示，与空白对照相比，在高粱壳和荞麦壳混合水提液作用下，金黄色葡萄球菌进入对数生长期的时间点和对数生长期延续时间未有明显改变，但生长受到明显抑制，无法达到生长高峰。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (1)

1.一种高粱壳和荞麦壳混合水提抑菌剂，其特征在于，按照以下步骤制备而成：将高粱壳和荞麦壳按质量比1：1混合，混合后的原料与水按质量体积比g：mL即120：1000加水浸泡，浸泡时间为10-24小时；然后强火加热至微沸后改用文火，保持20-50min；将煮制液过滤，收集滤液；将滤液进行浓缩，浓缩后的药液每1mL含有相当于原生药量：高粱壳0.25-2g以及荞麦壳0.25-2g；浓缩的药液进行灭菌至少一次，灭菌条件为：121℃，0.1MPa，高压蒸汽灭菌20min；两次灭菌间隔24h，灭菌后，得到水提抑菌剂；

所述抑菌剂用作金黄色葡萄球菌的抑菌剂；

所述抑菌剂用作金黄色葡萄球菌抑菌剂的浓度为不低于0.25g/mL。