CN105524921B - 一种快速鉴定产氨基甲酸乙酯酵母的方法 - Google Patents

一种快速鉴定产氨基甲酸乙酯酵母的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴定产氨基甲酸乙酯酵母的方法，属于生物技术及食品安全领域。本发明以酵母的精氨酸酶保守区域设计简并引物，快速鉴定产氨基甲酸乙酯(EC)的酵母。通过聚合酶链式反应(PCR)，快速检测酵母是否具有产EC的潜能。该方法是一种快速、准确、使用简并引物检测产EC的酵母，可应用于传统发酵食品中产EC酵母的鉴定。

Description

一种快速鉴定产氨基甲酸乙酯酵母的方法
技术领域
本发明涉及一种快速鉴定产氨基甲酸乙酯酵母的方法，属于生物技术及食品安全领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称EC)是一种潜在的多位点致癌物，广泛存在于多种发酵食品和酒精饮料中，如面包、白酒、酱油等。形成EC的前体物质主要有瓜氨酸、尿素、氰化物以及氨甲酰磷酸，他们能自发与乙醇发生化学反应形成EC。其中，尿素是形成EC的最重要的前体物质。在发酵过程中，尿素主要是是由酵母代谢精氨酸所产生。在酵母的精氨酸代谢途径中，car1编码精氨酸酶，是该途径中的第一个酶，参与精氨酸的分解代谢形成尿素。
在酵母中，编码精氨酸酶的car1呈现出多样性，而目前大量的报道集中于酿酒酵母。传统食品发酵过程中由多种酵母共同参与，如pichia，candida，Saccharomyces等。目前所报道的car1序列不多，由已知的公开的car1序列比对发现，在不同酵母种属中序列差异很大，以至于目前还没有一种引物能同时检测不同酵母的car1基因。
我国发酵食品种类繁多，而我国对发酵食品中EC的研究主要集中在检测方面。当前迫切需要跟踪我国各类发酵食品的发酵过程，对EC的形成机制作深入研究。为了深入了解发酵食品发中能产EC的酵母，有必要建立起一种快速鉴定产EC酵母的方法，为之后进一步用微生物手段控制发酵食品中氨基甲酸乙酯形成提供了思路。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种用于产氨基甲酸乙酯酵母快速检测的引物及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种可快速检测酵母是否具有产氨基甲酸乙酯潜力或者可快速对酵母种属进行分类的引物对，所述引物对：
(1)由核苷酸序列为NCCNCCNBBNACNSKNGTNCCNGTNG(如SEQ ID NO.1所示)和核苷酸序列为TGGWTNGAYGCNCAYGCNGAYATHAA(如SEQ ID NO.2所示)的核苷酸片段组成；或者是
(2)由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成。
本发明的第二个目的是提供所述引物对在检测样品中是否存在具有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述样品是来自任意含有酵母的发酵食品体系的样品，或者是从发酵食品体系中筛选得到的酵母的菌落、发酵液、菌体，或者是含有酵母基因组的样品。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品体系所指的发酵食品是白酒、黄酒、食醋、泡菜、酱油、酸奶、干酪、酒酿、豆豉、乳腐、黄酒、啤酒、葡萄酒中的任意一种。优选的发酵食品体系为白酒发酵体系、黄酒发酵体系或食醋发酵体系。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母是以下任意一种或者多种：Pichiafarinosa，Clavispora lusitaniae，Hanseniaspora osmophila，Issatchenkiaorientalis，Kazachstania exigua，Pichia anomala，Pichia membranifaciens，Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis fibuligera、Schizosaccharomycespombe、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Sterigmatomyces elviae、Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichiagaleiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichiameyerae、Cryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、Brettanomyces custersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母，来自白酒发酵体系，包括Saccharomycescerevi siae(来自清香型或芝麻香型白酒)、Pichia farinosa(清香型白酒)、Saccharomycopsis fib uligera(清香型白酒)、Clavispora lusitaniae(清香型白酒)、Issatchenkia orientalis(清香型或芝麻香型白酒)、Pichia membranifaciens(清香型或酱香型白酒)、Pichia anomala(芝麻香型白酒)、Hanseniaspora osmophila(清香型白酒)、Schizosaccharomyces pombe(浓香型白酒)。
在本发明的一种实施方式中，所述具有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母是指含有精氨酸酶编码基因的酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述检测是指利用引物对进行PCR，如果PCR产物检测，显示具有250-500bp之间(具体是在330bp左右)的片段，则代表该酵母具有car1基因，即该酵母具有产生氨基甲酸乙酯的潜能。PCR产物如果不在250-500bp之间(具体是330bp左右)或者没有条带，则代表该酵母不具有car1基因，也就不具备产氨基甲酸乙酯的潜能。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR是先提取样品的基因组再进行PCR或者直接对酵母菌液进行PCR；
在本发明的一种实施方式中，所述PCR扩增使用25微升反应体系：所述反应体系为2×Taq PCR MasterMix(with loading dye)12.5微升，两种简并引物各0.5微升，酵母DNA模板1微升，加水至总体积25微升；PCR扩增的条件为：94℃4分钟，94℃1分钟，50℃30秒，72℃1分钟，72℃10分钟(40个循环)；
本发明的第三个目的是提供一种快速检测酵母种属的方法，所述方法是使用所述的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对对含有酵母基因组的样品进行PCR，将得到的PCR产物的序列在NCBI上进行比对，从而得知酵母的属种。
所述酵母是以下任意一种或者多种：Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae，Hanseniaspora osmophila，Issatchenkia orientalis，Kazachstania exigua，Pichiaanomala，Pichia membranifaciens，Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsisfibuligera或者Schizosaccharomyces pombe、Schizosaccharomyces pombe、Pichiafermentans、Trichosporon asahii、Sterigmatomyces elviae、Zygosaccharomycesbailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae、Cryptococcusneoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、Brettanomycescustersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。
本发明的第四个目的是提供所述的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2的引物对或SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2同时反向互补得到的引物对在宏基因组方面的应用。所述应用，是用所述引物对进行含有宏基因组的样品的PCR，通过PCR结果判定样品中是否含有具有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母(如果PCR产物检测，显示具有330bp左右的片段，则代表该宏基因组中有car1的存在，即该环境样品中存在产氨基甲酸乙酯酵母的存在；PCR产物如果不在250-500bp(具体是在330bp左右)范围或者没有条带，该宏基因组中没有car1的存在，即该环境样品中不存在产氨基甲酸乙酯酵母)，和/或根据PCR产物的测序结果判定酵母的属种。
本发明的第五个目的是提供所述的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2的引物对或SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2同时反向互补得到的引物对在DGGE分析微生物方面的应用。所述应用，是用所述引物对进行含有微生物基因组的样品的PCR，通过PCR结果判定样品中是否含有具有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母，和/或根据PCR产物的测序序列在在NCBI上的比对结果判定酵母的属种。
本发明的第六个目的是提供一种获得不同种属的酵母的精氨酸酶基因序列的方法，是使用所述的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2的引物对或SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2同时反向互补得到的引物对对酵母基因组进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序(或者进一步根据PCR测序结果设计引物对扩增产物的上下游序列进行扩增，进而得到全长的精氨酸酶基因序列)，即得到精氨酸酶基因序列。
在本发明中，使用SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2的引物对样品进行PCR时，引物对的各引物的浓度为10ng/μl-1000ng/μl。
在本发明中，使用SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2的引物对(或SEQ ID NO.1/SEQ IDNO.2同时反向互补得到的引物对)样品进行PCR时，PCR扩增使用25微升反应体系：所述反应体系为2×Taq PCRMasterMix(with loading dye)12.5微升，两种简并引物各0.5微升，酵母DNA模板1微升，加水至总体积25微升；PCR扩增的条件为：94℃4分钟，94℃1分钟，50℃30秒，72℃1分钟，72℃10分钟(40个循环)；
本发明的有益效果：
(1)本发明解决了利用传统的可培养手段直接检测酵母发酵液中是否有代谢产物周期较长，基因不表达从而造成假阳性的结果；
(2)本发明的引物对，可以通过PCR技术实现对传统发酵食品发酵体系中产氨基甲酸乙酯的酵母的快速检测；
(3)本发明可以获得不同种属的酵母的精氨酸酶基因序列、可快速检测酵母是否具有产氨基甲酸乙酯潜力、可快速对酵母种属进行分类；
(4)本发明的引物，用于检测时准确性高、有效性好、灵敏性高。
附图说明
图1是本发明实施例的6个酵母精氨酸酶氨基酸序列比对的结果图；
图2是本发明实施例的PCR检测灵敏度实验结果；
图3是本发明实施例的白酒发酵体系酵母PCR扩增产物电泳分析；
图4是本发明实施例的利用简并引物检测乳酸菌的PCR扩增产物电泳分析；
图5是本发明实施例的食醋、黄酒发酵体系中酿酒酵母PCR扩增产物电泳分析；
图6是本发明实施例的利用其他三对引物扩增car1的PCR扩增产物电泳分析。
具体实施方式
实施例1简并引物对的设计
由于氨基酸密码子存在简并性的现象，即不同的DNA序列其最终表达的蛋白质氨基酸序列可能是相同的，所以比对已公布的由car1编码的精氨酸酶蛋白序列，根据保守区域设计简并引物，来检测不同种属酵母中car1基因。
从NCBI上搜集已知不同种属的6株酵母的精氨酸酶的蛋白序列，Candidaparapsilosis strain CDC317(GenBank data library accession number HE605203.1,CCE40044.1)，Cyberli ndnera fabianii strain YJS4271(LK052905.1,CDR45844.1)，Saccharomyces cerevisiae S288c(NC_001148.4,NP_015214.1)，Schizosaccharomycespombe 92h(NC_003423.3,NP_595133.1)，Torulaspora delbrueckii CBS 1146e(HE616742.1,XP_003679089.1)，Pichia kudriavzevii strain SD108(KGK40499.1)，进行多序列比对之后(结果如图1所示)，从保守区域144～150处设计上游引物，256～262设计下游引物。所得引物的序列为：
上游引物(5’→3’)：car deg-F1 NCCNCCNBBNACNSKNGTNCCNGTNG(26bp)
下游引物(5’→3’)：car deg-R1 TGGWTNGAYGCNCAYGCNGAYATHAA(26bp)
实施例2引物对灵敏度实验
提取Pichiaanomala酵母的基因组，稀释至1000ng/μl,作为起始的模板浓度，然后10倍比梯度稀释，稀释至100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl。
本实施例所用主要试剂：引物(上海生工)，2000bp DNA maker，2×Taq PCRMaster Mix(with loading dye)
本实施例所用主要仪器：基因扩增仪，电泳仪，凝胶图像分析系统
用于检测酵母car1的简并引物灵敏度实验，具体包括以下步骤：
(1)设计与合成引物；
(2)样品DNA模板制备；包括：
a)将酵母接种YPD液体管培养24h后，离心菌体(12000rpm，2min)，加1ml ddH2O洗涤后再离心(12000rpm，2min)；
b)细胞破碎，螺旋帽，细胞沉淀加0.2ml ddH2O加0.3g玻璃珠加0.3ml PC(苯酚：氯仿＝1:1)，细胞破碎30s之后，加0.6ml超纯水，颠倒混匀之后，12000rpm，10min；
c)取上清300～400微升，加入2倍体积冰乙醇，放置于4℃冰箱静置沉淀大于2h之后，12000rpm离心15min；
d)弃上清，真空干燥，加入30μl的ddH2O。
(3)PCR扩增反应
a)使用步骤1)中简并引物，聚合酶链式反应扩增精氨酸酶基因片段，扩增使用25微升反应体系：所述反应体系为2×Taq PCR MasterMix(with loading dye)12.5微升，两种简并引物各0.5微升，酵母DNA模板1微升，加水至总体积25微升。PCR扩增条件为：94℃4分钟，94℃1分钟，50℃30秒，72℃1分钟，72℃10分钟；40个循环；
b)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；将5微升所述扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，根据条带的有无和大小判定结果；
如图2所示，P1、P2为起始核酸浓度1000ng/μl，P3、P4为100ng/μl，P5、P6为10ng/μl，P7、P8为1ng/μl，P9、P10为0.1ng/μl。此结果说明利用该简并引物，检测灵敏度约为1ng/μl，呈现较好的灵敏度检测。以Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae，Hanseniasporaosmophila，Issatchenkia orientalis，Kazachstania exigua，Pichia membranifaciens，Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis fibuligera或者Schizosaccharomycespombe等发明内容提及的其他种属的酵母基因组为模板，灵敏度也约在1ng/μl。
实施例3引物对的检测有效性、准确性实验
(1)取15株已经通过HPLC方法检测到产氨基甲酸乙酯的酵母菌株：Issatchenkiaorientalis(来自清香型白酒)；Saccharomycopsis fibuligera(清香型白酒)；Saccharomyces cerevisiae(清香型白酒)；Saccharomyces cerevisiae(芝麻香型白酒)；Pichia membranifaciens(酱香型白酒)；Issatchenkia orientalis(芝麻香型白酒)；Pichia anomala(浓香型白酒)；Pichia anomala(芝麻香型白酒)；Issatchenkiaorientalis(浓香型白酒)；Saccharomycopsis fibuligera(清香型白酒)；Schizosaccharomyces pombe(清香型白酒)；Kazachstania exigua(清香型白酒)；Hanseniaspora osmophila(清香型白酒)；Pichia membranifaciens(清香型白酒)；Clavispora lusitaniae(清香型白酒)。
分开提取上述15株菌的各自基因组。
使用如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示的序列组成的引物对，对各基因组进行PCR，然后电泳检测。
结果发现：PCR产物在330bp左右的范围内具有条带(如图3所示)，说明使用该引物确实能够扩增得到不同种属酵母的精氨酸酶基因。
然后PCR产物进行测序并将测序结果在NCBI上进行比对，结果发现NCBI上比对到的酵母种属名称与实际用到的酵母种属相一致，说明该引物确实能够实现产氨基甲酸乙酯的酵母种属的鉴定。
(2)取5株已经确认没有精氨酸酶基因的菌株(Lactobacillus buchneri,Lactobacillus diolivorans,Lactobacillus casei,Pediococcus parvulus,Lactobacillus plantarum.，均来自白酒发酵体系)，各自提取基因组，然后使用本发明的引物对(SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2)进行PCR。结果发现没有条带或者是没有相应大小的条带(如图4所示)。说明本发明的引物对特异性好、检测准确性好，不会导致对未含有精氨酸酶基因的菌株出现假阳性判定。
实施例4白酒发酵体系酵母car1检测
从白酒发酵体系中筛选得到了15株酵母，包括Issatchenkia orientalis(清香型白酒)；Saccharomycopsis fibuligera(清香型白酒)；Saccharomyces cerevisiae(清香型白酒)；Saccharomyces cerevisiae(芝麻香型白酒)；Pichia membranifaciens(酱香型白酒)；Issatchenkia orientalis(芝麻香型白酒)；Pichia anomala(浓香型白酒)；Pichiaanomala(芝麻香型白酒)；Issatchenkia orientalis(浓香型白酒)；Saccharomycopsisfibuligera(浓香型白酒)；Schizosaccharomyces pombe(浓香型白酒)；Kazachstaniaexigua(清香型白酒)；Hansenia spora osmophila(清香型白酒)；Pichiamembranifaciens(清香型白酒)；Clavispora lusit aniae(清香型白酒)。
本实施例所用主要试剂：引物(上海生工)，2000bp DNA maker，2×Taq PCRMaster Mix(with loading dye)
本实施例所用主要仪器：基因扩增仪，电泳仪，凝胶图像分析系统
利用PCR快速检测上述酵母是否产氨基甲酸乙酯，具体包括以下步骤：
(1)设计与合成引物：序列如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示；
(2)样品DNA模板制备；包括：
a)将酵母接种YPD液体管培养24h后，离心菌体(12000rpm，2min)，加1ml ddH2O洗涤后再离心(12000rpm，2min)；
b)细胞破碎，螺旋帽，细胞沉淀加0.2ml ddH2O加0.3g玻璃珠加0.3ml PC(苯酚：氯仿＝1:1)，细胞破碎30s之后，加0.6ml超纯水，颠倒混匀之后，12000rpm，10min
c)取上清300～400微升，加入2倍体积冰乙醇，放置于4℃冰箱静置沉淀大于2h之后，12000rpm离心15min；
d)弃上清，真空干燥，加入30μl的ddH2O；
(3)PCR扩增反应
a)使用步骤1)中简并引物，聚合酶链式反应扩增过精氨酸酶基因片段，扩增使用25微升反应体系：所述反应体系为2×Taq PCR MasterMix(with loading dye)12.5微升，两种简并引物各0.5微升，酵母DNA模板1微升，加水至总体积25微升。PCR扩增条件为：94℃4分钟，94℃1分钟，50℃30秒，72℃1分钟，72℃10分钟。40个循环；
b)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；将5微升所述扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，根据条带的有无和大小判定结果；
c)对PCR扩增产物进行DNA测序，获得不同种属酵母的精氨酸酶基因的序列；
将5μl产物用琼脂糖电泳分离，电泳结果如图3所示，M为maker，1-15分别为
1为Issatchenkia orientalis(清香型白酒)；2为Saccharomycopsis fibuligera(清香型白酒)；3为Saccharomyces cerevisiae(清香型白酒)；4为Saccharomycescerevisiae(芝麻香型白酒)；5为Pichia membranifaciens(酱香型白酒)；6为Issatchenkia orientalis(芝麻香型白酒)；7为Pichia anomala(浓香型白酒)；8为Pichiaanomala(芝麻香型白酒)；9为Issatchenkia orientalis(浓香型白酒)；10为Saccharomycopsis fibuligera(浓香型白酒)；11为Schizosaccharomyces pombe(浓香型白酒)；12为Kazachstania exigua(清香型白酒)；13为Hanseniaspora osmophila(清香型白酒)；14为Pichia membranifaciens(清香型白酒)；15为Clavispora lusitaniae(清香型白酒)。
这说明从白酒发酵体系当中筛选的这15株酵母均具有car1基因，都具有产氨基甲酸乙酯的潜能。经液体培养，HPLC检测发酵液中，均有尿素的存在，并且尿素的产量差异很大。白酒发酵过程中会不可避免地产生氨基甲酸乙酯，为降低白酒中EC的含量提供了生物学的方法。
实施例5黄酒、食醋发酵体系酿酒酵母car1检测
采用与实施例4类似的方法，对从黄酒或食醋发酵体系中筛选得到的酵母进行PCR。
将5μl产物用琼脂糖电泳分离，电泳结果如图5所示，M为maker，1-3分别为Saccharomyces cerevisiae(黄酒发酵体系)，Saccharomyces cerevisiae(食醋发酵体系)，Saccharomyces cerevisiae(白酒发酵体系)。结果说明本发明的引物可以实现对不同发酵体系来源的酵母进行检测；此处均检测到car1基因，还说明精氨酸酶在相同物种当中差异不大。
实施例6引物序列对检测有效性、准确性的影响
本发明还采用类似的设计，设计了其他3对引物。然后采用与实施例3一致的方法，对与实施例3相同的15株菌进行PCR扩增。结果如图6所示。结果表明，其他的引物扩增效果显著不如实施例3的序列为SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2的引物对。
引物信息如下：
(1)引物对1：(结果如图6A)
F1：RTNGAYGCNCAYGCNGAYAT 144～150(序列如SEQ ID NO.3)
R1：TCNANRTCNCKNARNCCDAT 199～205(序列如SEQ ID NO.4)
(2)引物对2：(结果如图6B)
F2：RRNAAYYTNCAYGGNTGYCC 160～166(序列如SEQ ID NO.5)
R2：NGGRTCNMHNSCRTCNACRT 256～262(序列如SEQ ID NO.6)
(3)引物对3：(结果如图6C)
F3：RTNGAYGCNCAYGCNGAYAT 144～150(序列如SEQ ID NO.7)
R3：NGGRTCNMHNSCRTCNACRT 256～262(序列如SEQ ID NO.8)
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种引物对，其特征在于，所述引物对由核苷酸序列为SEQ ID NO.1和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核苷酸片段组成，或者是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成。
2.权利要求1所述引物对在检测样品中是否存在具有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样品是来自任意含有酵母的发酵食品体系的样品，或者是从发酵食品体系中筛选得到的酵母的菌落、发酵液、菌体样品，或者是含有酵母基因组的样品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵食品体系所指的发酵食品是白酒、黄酒、食醋、泡菜、酱油、酸奶、干酪、酒酿、豆豉、乳腐、黄酒、啤酒、葡萄酒中的任意一种。
5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于，所述酵母是以下任意一种或者多种：Pichia farinosa、Clavispora lusitaniae、Hanseniaspora osmophila、Issatchenkiaorientalis、Kazachstania exigua、Pichia anomala、Pichia membranifaciens、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomycopsis fibuligera、Schizosaccharomycespombe、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Sterigmatomyces elviae、Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichiagaleiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichiameyerae、Cryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、Brettanomyces custersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。
6.一种快速检测是否存在具有产氨基甲酸乙酯潜力的酵母的方法，所述方法是使用权利要求1所述的引物对含有酵母基因组的样品进行PCR，将得到的PCR产物的序列在NCBI上进行比对，从而得知酵母是否存在具有产氨基甲酸乙酯潜力。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酵母是以下任意一种或者多种：Pichia farinosa、Clavispora lusitaniae、Hanseniaspora osmophila、Issatchenkiaorientalis、Kazachstania exigua、Pichia anomala、Pichia membranifaciens、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomycopsis fibuligera、Schizosaccharomycespombe、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Sterigmatomyces elviae、Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichiagaleiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichiameyerae、Cryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、Brettanomyces custersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。
8.权利要求1所述的引物对在宏基因组方面的应用。
9.权利要求1所述的引物对在DGGE分析微生物方面的应用。
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