CN105518121A - 肝脏感染 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于研究体外肝脏组织中的感染过程的方法，该方法包括：在生物反应器中在支架上接种肝实质细胞以形成肝脏组织模型；将感染剂递送到肝脏组织模型，或提供用感染剂预感染的肝脏组织模型；以及监测感染过程；以及涉及用于生产感染剂的方法。

Description

肝脏感染
技术领域
本发明涉及用于研究体外肝脏组织的感染的方法，用于潜在治疗性或预防性候选药物的筛选方法，肝脏感染模型，用于生产感染剂(infectiousagent)以及其后代的方法。
背景技术
感染性肝病是全球范围内的主要关注的问题。例如，估计肝炎B病毒(HBV)慢性感染3.5亿个体，其是主要的全球医疗保健挑战。病毒感染的研究对于理解发病机制以及确定和开发用来对抗感染的新疗法是必不可少的。然而，肝的病毒感染的研究是困难的，这是由于有限可用性的适宜的病毒感染和复制模型。例如，肝炎B病毒的体外研究往往限于肝细胞癌细胞系的感染，如HepaRG或Huh7，其中病毒颗粒摄取是较差的以及嗜肝病毒的感染和增殖需要特定的宿主因子，其主要表达在宿主物种或非常有限数目的其它物种的高度分化的细胞中。在细胞培养中，这些高度分化的细胞快速失去它们的分化的方面，从而导致从低病毒滴度到在细胞培养中未能感染细胞的问题。因此，嗜肝病毒的研究一直依赖于高度修饰的细胞或病毒系统：例如诱导的多能干细胞用于丙型肝炎的研究(Schwartzetal,PNAS,January2012http://www.pnas.org/content/early/2012/01/27/1121400109)。经常通过质粒DNA递送进入细胞来绕开病毒摄取效率低下。这样的方法并不允许病毒进入的研究。此外，癌细胞系不是理想的研究模型，因为它们具有异常分化、失调的基因表达、异常的细胞信号传导和内吞功能。然而，用肝炎B病毒的自然宿主，即原代人肝细胞，进行的研究是困难的，因为在细胞培养中的短时间以后，它们可能快速去分化和失去它们的肝炎B病毒感染和复制的能力。在丙型肝炎病毒(HCV)的情况下，仅可以对有限子集的病毒菌株进行体外研究，并限于重组2a基因组，JFH1。此外，在此基因组已进行的突变，在细胞培养,中其允许复制，已被证明会干扰感染性病毒的生产(Pietschmannetal:PLoSPathogens5(6)2009)。在细胞培养中主要HCV分离物并不很好地复制并且在HCV生物学中的主要挑战仍然是体外增殖另外的基因型或野生型病毒(SteinmannandPietschmann:CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyVolume369,2013,pp17-48)。Ploss等(2010,PNAS,Vol107(7)pp.3141-3145)讨论了用于丙型肝炎感染模型的策略，其包括细胞外基质操作，限定的培养基，利用生物反应器的流体流动，或细胞-细胞相互作用的变化，其中通过形成3D球形集合体或与非实质细胞类型一起的共培养。Ploss等进一步描述了，虽然一些这些模型提供必要的细胞外基质线索，但它们缺少关键的异型细胞-细胞相互作用或对组织架构的控制，已知其会影响肝特异性功能。重要地，由Ploss等研究的模型是较差的：细胞不能提供有效的摄取，产生低滴度，以及病毒感染到新细胞的扩散是有限的。假设，肝细胞的正确极化和分化的保持可能是重要的因素。在Ploss等中使用的模型还不代表人系统，其中利用人和鼠细胞的异源组合。细胞间相互作用和潜在传染已经参与嗜肝病毒再生和扩散(总结于Steinmann)，从而表明需要同源系统用于这些研究。此外，Wu等(2008.PLoSPathogensVol8(4),pp.1-14)讨论了分化的重要性，其中干细胞衍生的肝细胞的生产性丙型肝炎病毒感染揭示了在分化过程中到病毒许可的临界转变。
发明内容
本发明的目的是提供用于模仿体外肝脏感染过程的改善的方法。
根据本发明的第一方面，提供了用于研究体外肝脏组织中的感染过程的方法，上述方法包括：
-将肝实质细胞(hepatocytecell)接种到在生物反应器中的支架上以形成肝脏组织模型；
-将感染剂递送到肝脏组织模型，或提供用感染剂预感染的肝脏组织模型；以及
-监测感染过程。
将感染剂递送到肝脏组织可以包括在接种肝实质细胞以后将感染剂加入肝脏组织模型。将感染剂递送到肝脏组织可以包括在接种以前将感染剂加入肝实质细胞。将感染剂递送到肝脏组织可以包括将感染剂加入非实质细胞(non-parenchymalcell)并随后将非实质细胞接种到支架上。提供用感染剂预感染的肝脏组织模型可以包括在接种它们在支架上以前将感染剂加入肝实质细胞和/或非实质细胞。
上述方法可以用于研究体外肝脏组织中的病毒感染和/或病毒复制。可替换地，上述方法可以用于研究体外肝脏组织中的疟疾感染(malarialinfection)。
有利地，本发明的方法允许肝实质细胞在长期研究期间维持它们的分化，如超过14天并且甚至达到并超出28天。另外，本发明的方法允许细胞产生更为极化的表型，其已被证明涉及感染，如病毒感染。本发明的方法提供了理想的环境，其模拟自然宿主环境并导致用于研究感染过程的体外模型。
上述方法可以进一步包括将活性剂递送到肝脏组织模型。可以同时或顺序地使用活性剂的组合。活性剂可以包括候选药物、标记物、或细胞信号分子(cellsignalingmolecule)，如细胞因子。候选药物可以包括抗体、或其片段或变体；小分子；肽；或核酸，如siRNA。候选药物可以包括低聚物。候选药物可以包括核苷酸类似物。候选药物可以包括抗病毒药物。候选药物可以包括抗生素。
小分子可以包括化合物(化学化合物，chemicalcompound)。小分子可能不是生物分子。小分子可能不是聚合物核酸、蛋白质、或抗体的任何一种。小分子可以包括<900道尔顿的低分子量的有机化合物，其可以作为生物过程的酶底物或调节物，其尺寸约为10-9m。生物聚合物如核酸、蛋白质、和多糖(如淀粉或纤维素)不可能被视为小分子。生物聚合物的构成单体，如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、氨基酸、和单糖可被认为是小分子。小低聚物可被视为小分子，如二核苷酸，肽如抗氧化谷胱甘肽，以及二糖如蔗糖。
递送活性剂到肝脏组织模型有利地允许体外筛选和研究用于肝病毒感染的潜在疗法。
可以在递送病毒或编码病毒的核酸以前、同时(simultaneously)、并行(concurrently)或以后，将活性剂递送到肝脏组织模型。
肝实质细胞可以是人或非人肝实质细胞。肝实质细胞可以是人肝实质细胞。肝实质细胞可以包括原代肝实质细胞。肝实质细胞可以包括非原代肝实质细胞，如干细胞源性肝实质细胞或祖细胞源性肝实质细胞。肝实质细胞可以新鲜分离自供体，或来自冷冻保存源。肝实质细胞可以来自冷冻保存源。肝实质细胞可以来自相同供体或合并自多个供体。肝实质细胞可以包括雌性来源的肝实质细胞或由雌性来源的肝实质细胞组成。肝实质细胞可以包括雄性来源的肝实质细胞或由雄性来源的肝实质细胞组成。肝实质细胞可以包括胚胎来源的肝实质细胞或由胚胎来源的肝实质细胞组成。肝实质细胞可以包括成年体来源的肝实质细胞或由成年体来源的肝实质细胞组成。肝实质细胞可以包括未成年体来源的肝实质细胞或由未成年体来源的肝实质细胞组成。可替换地，肝实质细胞可以不包括胚胎来源的肝实质细胞或不由胚胎来源的肝实质细胞组成。
上述方法可以进一步包括与肝实质细胞一起接种另外的细胞。另外的细胞可以包括非实质肝细胞。
非实质肝细胞可以选自包括巨噬细胞(枯否细胞)、星形细胞(伊藤细胞)、胆管细胞、肝窦内皮细胞、肝前体细胞、和其它次要的非肝实质细胞的肝细胞(non-hepatocytelivercell)、或它们的组合的组的任何一种。非实质肝细胞可以是人或非人非实质肝细胞。非实质肝细胞可以是人非实质肝细胞。非实质肝细胞可以新鲜分离自供体，或来自冷冻保存源。非实质肝细胞可以来自相同供体或合并自多个供体。非实质肝细胞可以包括雌性来源的非实质肝细胞或由雌性来源的非实质肝细胞组成。非实质肝细胞可以包括雄性来源的非实质肝细胞或由雄性来源的非实质肝细胞组成。非实质肝细胞可以包括胚胎来源的非实质肝细胞或由胚胎来源的非实质肝细胞组成。非实质肝细胞可以包括成年体来源的非实质肝细胞或由成年体来源的非实质肝细胞组成。非实质肝细胞可以包括未成年体来源的非实质肝细胞或由未成年体来源的非实质肝细胞组成。可替换地，非实质肝细胞可以不包括胚胎来源的非实质肝细胞或由胚胎来源的非实质肝细胞组成。
可以在肝实质细胞以前、同时、并行或以后，将非实质细胞接种到支架上。在接种到支架上以前，可以混合非实质细胞与肝实质细胞。可以与肝实质细胞同时或并行，将非实质细胞接种到支架上。
根据需要，肝实质细胞和非实质细胞的比率可以是可调节的。可以调节肝实质细胞和非实质细胞的比率以模仿在肝脏组织中通常发现的比率。可以通过FACS分选来分选肝实质细胞和非实质细胞。肝实质细胞与非实质细胞的比率可以反映健康或患病肝脏。肝实质细胞与枯否细胞的比率可以是约10:1，例如在健康肝脏的模型中。肝实质细胞与枯否细胞的比率可以是约3:1，例如在发炎肝脏的模型中。肝实质细胞与非实质细胞的比率可以是约2:1至约20:1、或约3:1至约15:1。肝实质细胞与非实质细胞的比率可以是约3:1至约10:1。肝实质细胞与非实质细胞的比率可以是约3:2。
肝实质细胞和非实质细胞可以是相同物种的。肝实质细胞和非实质细胞可以是处于相同的发育或分化阶段。肝实质细胞和非实质细胞可能不是不同物种的异源组合。肝实质细胞和非实质细胞可以包括几乎所有的人类细胞、或基本上所有人类细胞。非实质细胞可以包括几乎所有的人类细胞、或基本上所有人类细胞。肝实质细胞可以包括几乎所有的人类细胞、或基本上所有人类细胞。
接种的细胞可以基本上是非聚集奇异细胞。可以以球状体的形式来提供这些细胞。在接种以前、或期间，细胞不可以提供一段时期的聚集。
可以以约0.2xl06至约2xl06个细胞/支架的密度，将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.3xl06至约2xl06个细胞/支架的密度，将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.4xl06至约2xl06个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.5xl06至约2xl06个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.6xl06至约1.5xl06个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.6xl06至约1.2xl06个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.4xl06至约0.8xl06个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.5xl06至约0.8xl06个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.5xl06至约0.7xl06个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约0.6xl06个细胞/支架的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约10,000至约5,000,000个细胞的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。可以以约50,000至约2,000,000个细胞的密度将肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。上述方法可以进一步包括将另外的肝实质细胞加入肝脏组织模型。可以在细胞培养期间，或在介质转换/置换期间，添加另外的肝实质细胞。
在接种到支架上以前，非实质细胞可以感染有感染剂。在接种到支架上以前，非实质细胞可以感染有病毒、或编码病毒的核酸。
可以在活性剂以前的约1秒至约27天递送感染剂。可以在活性剂以前的约1分钟至约20天，递送感染剂。可以在活性剂以前的至少1天，递送感染剂。可以在活性剂以前的至少1小时、或至少3小时、或至少8小时、或至少12小时，递送感染剂。
可以与活性剂同时或并行递送感染剂。可以在活性剂以后的约1秒至约27天，递送感染剂。可以在活性剂以后的约1分钟至约20天，递送感染剂。可以在活性剂以后的至少1天，递送感染剂。可以在活性剂以后的至少1小时、或至少3小时、或至少8小时、或至少12小时，递送感染剂。
在接种以前对细胞(如肝实质细胞和/或非实质细胞)进行预感染的情况下，可以在接种以前至多达6小时，将感染剂递送到细胞。可以在接种以前至多达3小时，将感染剂递送到细胞。可以在接种以前至多达1小时，将感染剂递送到细胞。
上述方法可以进一步包括递送另外的感染剂。另外的感染剂可以是与第一感染剂不同的物种、生物体(organism)或菌株(strain)，或感染剂的突变体。
上述方法可以进一步包括诱导肝脏组织模型中的一种或多种细胞的细胞修饰。细胞修饰的诱导可以是在感染剂递送以前、并行、同时、或以后。细胞修饰的诱导可以是在活性剂递送以前、并行、同时、或以后。细胞修饰可以是生理变化、或遗传修饰、修饰基因表达或调控。
感染过程可以生产感染剂的后代。可以收获后代。可以再循环后代以递送回到肝脏组织模型的细胞。
可以减弱后代。后代可以无法复制，或可以能够仅复制一次。可以减弱后代以致它们是比未减弱的等效野生型感染剂较少致病的。感染剂可以包括病毒、或编码病毒的核酸。感染剂可以包括寄生生物。寄生生物可以包括疟原虫(malarialperasite)。感染剂可以是疟原虫属的。感染剂可以包括原生生物。感染剂可以包括子孢子、裂殖子、配子体或合子/动合子。感染剂可以是细菌、真菌或原虫。感染剂可以包括任何生物体、病毒、核酸、或朊病毒，朊病毒能够影响肝脏组织中的细胞，感染在肝脏组织中的细胞，在肝脏组织中的细胞中复制，和/或在肝脏组织中的细胞中进行至少部分的它的生命周期。感染剂可以包括病毒载体。病毒载体可以包括HBV载体，例如源自在HepG2细胞中的质粒转染。
感染剂可以能够感染肝脏的细胞，如肝实质细胞。感染剂可以包括任何肝营养感染剂。
病毒可以包括来自病毒家族的肝影响病毒，上述病毒家族选自包括肝DNA病毒家族、小核糖核酸病毒家族、黄病毒家族、δ病毒家族、和肝炎病毒家族组成的组的任何一种。
病毒可以包括肝DNA病毒家族的成员。病毒可以包括肝炎病毒。肝炎病毒可以是选自由肝炎A(微小RNA病毒)、B(嗜肝DNA病毒)、C(丙型肝炎病毒)、D(δ病毒)、E(肝炎病毒)、F(目前假设的)和GB病毒C组成的组的任何一种。病毒可以包括肝炎B、D或C病毒。病毒可以包括肝炎B病毒。病毒可以包括肝炎D病毒。可以将不同病毒的组合或混合物递送到肝脏组织模型。例如，可以将选自肝炎A、B、C、D、E、F或G的两种或更多种病毒递送到肝脏组织模型。病毒可以包括HBeAg阴性HBV和/或HBeAg阳性HBV。病毒可以包括HCV基因型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11。病毒可以包括HCV，其选自由la、lb、lc、2a、2b、2c、3a、3b、4a、4b、4c、4d、4e、5a、6a、7a、7b、8a、8b、9a、10a、和11a、或它们的组合组成的组的任何一种。病毒可以包括HCV基因型2a。病毒可以包括HCV基因型la或lb。病毒可以包括HCV2JFH1菌株。
病毒可以包括肝相关病毒。肝相关病毒可被认为是能够感染肝脏或在肝脏组织中有影响的病毒，但肝脏组织可能不是它的主要嗜性(向性，tropism)。肝相关病毒可以是选自包括巨细胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、风疹病毒、黄热病毒、沙粒病毒、马堡病毒、埃博拉病毒、裂谷热病毒、和克里米亚-刚果出血热相关病毒的组的任何一种。
感染剂可以包括耐药性感染剂。感染剂可以包括耐药性病毒。耐药性病毒可以包括耐抗病毒药物病毒，如耐DAA(直接作用的抗病毒药物)。感染剂可以包括耐拉米夫定、替拉瑞韦、或波西普韦的病毒。感染剂可以包括NS5A、NS5B、或NS3HCV菌株。
感染剂可以包括修饰物(modification)，其中，除了感染剂蛋白以外或通过替代感染剂蛋白，将报告蛋白/标记蛋白整合在感染剂中。感染剂可以包括修饰物，其中，除了感染剂遗传密码以外或通过替代感染剂遗传密码，将报告蛋白/标记蛋白编码在感染剂核酸内。病毒可以包括修饰，其中，除了病毒蛋白以外或通过替代病毒蛋白，将报告蛋白/标记蛋白整合在病毒颗粒中。病毒可以包括修饰，其中，除了病毒遗传密码以外或通过替代病毒遗传密码，将报告蛋白/标记蛋白编码在病毒核酸内。报告蛋白/标记蛋白可以包括荧光素酶。
感染剂可以来源自人血液产品。血液产品可以来自感染有感染剂的患者。血液产品可以来自感染有感染剂的转基因动物。病毒可以来源自产生人感染感染剂的转基因动物模型。
可以在递送以前浓缩感染剂。可以通过沉淀来浓缩感染剂。可以在递送以前完全、基本上或部分纯化感染剂。
可以将病毒核酸，如DNA，转染入细胞。转染可以是在接种细胞以前，或当细胞是在支架上时。在当细胞是在支架上时发生转染的情况下，可以关掉介质的流动适当的时间段以允许发生转染。病毒核酸可以是以包含病毒基因组的质粒的形式，或其一部分。在通过核酸的转染来递送或感染病毒的情况下，可以将核酸转录和翻译到病毒颗粒、或其部分。
在细胞培养期间可以改变/更新介质。可以在细胞退化到非分化状态以前改变介质。可以在细胞接种以后约1小时至约36小时，或在约最初24小时以后，改变介质。可以周期性地改变介质，如约每24小时、或约每48或约每72小时。可以培养肝脏组织模型大于约8天。可以培养肝脏组织模型大于约14天。可以培养肝脏组织模型大于约20天或约28天。可以培养肝脏组织模型大于约40天。可以培养肝脏组织模型大于约90天。培养期可以是约7至约14天。培养期可以是约7至约20天。培养期可以是约3至约14天。培养期可以是约1至约90天。培养期可以是任何时期，其中细胞培养保持稳定，如其中肝实质细胞仍然分化。
可以将另外添加的感染剂递送到肝脏组织模型。可以在介质改变期间提供另外添加的感染剂。可以在一次或多次介质改变时递送单次添加或多次添加感染剂。可以将另外添加的不同的感染剂递送到肝脏组织模型。例如肝炎D病毒加入感染有或暴露于肝炎B病毒的细胞。
可以以至少1pfu的量递送的病毒。可以以至少10pfu/ml的量递送病毒。可以以约10pfu/ml至约1000pfu/ml的量递送病毒。可以以以约10pfu/ml至约100pfu/ml的量递送病毒。可以以约1pfu/ml的量至通过正常生理机制会感染细胞的量来递送病毒。可以小于100,000pfu/ml的量递送病毒。可以以小于10,000pfu/ml的量递送病毒。可以以小于1000pfu/ml的量递送病毒。可以以小于100pfu/ml的量递送病毒。可以以小于10pfu/ml的量递送病毒。可以以至少1cfu的量递送细菌。可以以至少10cfu/ml的量递送细菌。可以以约10cfu/ml至约1000cfu/ml的量递送细菌。可以以约10cfu/ml至约100cfu/ml的量递送细菌。可以以约1cfu/ml的量至通过正常生理机制将感染细胞的量来递送细菌。可以以至少1个单个细胞、生物体、颗粒或分子的量来递送感染剂。可以以至少10个细胞、生物体、颗粒或分子的量来递送感染剂。可以以约10至1000个细胞、生物体、颗粒或分子的量来递送感染剂。可以以约10至约100个细胞、生物体、颗粒或分子的量来递送感染剂。可以以约1个细胞、生物体、颗粒或分子的量至通过正常生理机制将感染细胞的量来递送感染剂。
可以以至少约0.01m.o.i(感染复数)的量来递送感染剂。可以以至少约0.05m.o.i的量来递送感染剂。可以以至少约0.075m.o.i的量来递送感染剂。可以以至少约0.1m.o.i的量来递送感染剂。可以以至少约0.5m.o.i的量来递送感染剂。可以以至少约0.75m.o.i的量来递送感染剂。可以以至少约0.2m.o.i的量来递送感染剂。可以以至少约0.075m.o.i的量来递送感染剂。可以以约0.75m.o.i的量来递送感染剂。可以以约0.01m.o.i至约100m.o.i.的量来递送感染剂。可以以约0.01m.o.i.至约10m.o.i的量来递送感染剂。可以以约0.01m.o.i.至约5m.o.i的量来递送感染剂。可以以约0.01m.o.i.至约2m.o.i的量来递送感染剂。可以以约0.01m.o.i.至约1m.o.i的量来递送感染剂。可以以约0.05m.o.i.至约10m.o.i的量来递送感染剂。可以以约0.05m.o.i.至约2m.o.i.的量来递送感染剂。可以以小于1000m.o.i的量来递送感染剂。可以以小于100m.o.i.的量来递送感染剂。可以以小于10m.o.i的量来递送感染剂。可以以小于1m.o.i的量来递送感染剂。可以以小于0.5m.o.i的量来递送感染剂。可以以小于0.1m.o.i的量来递送感染剂。可以以小于0.05m.o.i的量来递送感染剂。可以以约lxl0-9/ml至约lxl07/ml的量来递送感染剂。可以以约lxl0-8/ml至约lxl05/ml的量来递送感染剂。
可以以至少约le3/ml的量来递送感染剂。可以以至少约le4/ml的量来递送感染剂。可以以至少约le5/ml的量来递送感染剂。可以以至少约le6/ml的量来递送感染剂。可以以至少约le7/ml的量来递送感染剂。可以以约le4.4/ml的量来递送感染剂。可以以约le3/ml至约le7/ml的量来递送感染剂。可以以小于约lel0/ml的量来递送感染剂。可以以小于约le9/ml的量来递送感染剂。可以以小于约le8/ml的量来递送感染剂。可以以小于约le7/ml的量来递送感染剂。可以以小于约le6/ml的量来递送感染剂。可以以小于约le5/ml的量来递送感染剂。可以以小于约le4/ml的量来递送感染剂。可以以小于约le3/ml的量来递送感染剂。可以以小于约le2/ml的量来递送感染剂。
感染过程的监测可以历时约1小时至约27天。感染过程的监测可以包括确定包括以下的组中的任何一种：附着/吸附；膜融合；胞吞；渗透(penetration)；解组装(unpackaging)；核局部化；复制，如病毒核酸复制和/或病毒蛋白表达；感染剂生长；孢囊形成；感染剂适应性(adaption)；感染剂形态构成；细胞防御的抑制；脱落；芽殖；凋亡；胞吐；病毒潜伏；细胞表面修饰/呈递；细胞应答；细胞信号传导；细胞调节；抗病毒应答；和细胞衰老或细胞死亡；或它们的组合。
可以通过量化在培养基中或在细胞中的感染剂核酸来确定感染剂复制。核酸可以是DNA或RNA。核酸可以是cccDNA。可以监测和/或定量cccDNA生成。可以测序cccDNA。可以在研究递送到肝脏组织模型的活性剂的效应期间，监测cccDNA。可以通过链特异性RT-PCR测定来监测病毒复制。可以通过定量实时PCR来量化在培养基中或在细胞中的感染剂核酸。
监测感染过程可以包括细胞和/或细胞培养基的分析。细胞和/或培养基的分析可以包括确定包括以下的组的任何一种的存在或量：代谢物；细胞标记物；病毒感染标记物；病毒颗粒；感染剂；感染剂核酸；和细胞信号分子；或它们的组合。可以采样上清液和/或细胞，用于监测感染过程。
细胞和/或细胞培养基的分析可以包括使用HPLC、ELISA、PCR、质谱测定法、酶测定、PAGE、蛋白质印迹、色谱法、分子探针如肽、寡核苷酸、或抗体探针。
细胞和/或细胞培养基的分析可以包括确定肝炎表面抗原的存在或量。确定肝炎表面抗原的存在或量可以通过使用酶联免疫吸附测定(ELISA)。
监测感染过程可以包括肝脏组织模型中一种或多种细胞的分析，如肝实质细胞和/或肝脏组织模型的另外的细胞，如非实质细胞。在肝脏组织模型中细胞的分析可以包括在生物反应器内的分析，和/或从生物反应器除去的细胞的分析。在肝脏组织模型中细胞的分析可以包括确定包括以下的组中的任一项：细胞表型变异；基因调节；遗传修饰；细胞表面修饰；区域化；生命周期阶段；细胞活力；附着/吸附；膜融合；感染剂的胞吞；渗透(penetration)；病毒颗粒解组装；核局部化；感染剂复制；病毒核酸复制；病毒蛋白表达；细胞防御的感染剂介导的抑制；脱落；芽殖；细胞凋亡；胞吐；病毒潜伏；细胞表面修饰/呈递；细胞应答；细胞信号传导；细胞调节；抗病毒应答；和细胞衰老或死亡；或它们的组合。
监测感染过程可以包括感染剂的复制中间体的检测和/或量化。复制中间体可以包括pgRNA和/或编码病毒转录因子的核酸。复制中间体可以包括病毒的非包装核酸。监测感染过程可以是选自包括分析用于HBV核酸的上清液、分析用于HBeAg的上清液、分析用于细胞因子生产的上清液、和分析用于白蛋白分泌的上清液、或它们的组合的组的任何一种。
监测感染过程可以包括针对包括HBV核酸，如HBVcccDNA，复制中间体如编码病毒转录因子的核酸，HBV中间体和/或pgRNA；或它们的组合的组的任何一种分析细胞。
监测感染过程可以包括在肝脏组织模型中细胞的遗传和/或表观遗传变化的分析。遗传和/或表观遗传变化可以是表达的上调或下调。
监测感染过程可以包括使用感兴趣的分子的荧光激发。损伤或感染的读数可以基于组织的荧光的变化，其是通过小型化光纤阵列(miniaturizedfiberopticarray)(其经由单或多光子装置激发荧光)所检测的。许多类型的荧光读数是可能的。可以通过检测NAD(P)H水平的变化，例如通过固有荧光来测量肝脏组织模型的基础代谢参数的变化。细胞可以预先加载有染料，在膜损伤的情况下其漏出，从而导致荧光强度的降低。可以在应激相关启动子(其在组织损伤过程中被激活以产生荧光产物)的控制下将报告基因转染入细胞。
监测感染过程可以是在每个介质变化下。监测感染过程可以是连续或间歇的。监测感染过程可以是至少每12小时。监测感染过程可以是至少每24小时。监测感染过程可以是至少每48小时。
生物反应器可以包括包含设置在其中的支架的生物反应器孔。生物反应器孔可以包含，或可以排列以接收细胞培养基。生物反应器可以包括流体连接于生物反应器孔的流体储存器。可以通过流体通道来连接生物反应器孔和流体储存器，从而允许细胞培养基的再循环。
可以连接(如流体连接)两个或更多生物反应器。可以通过一个通道、或两上或更多通道来连接两个或更多生物反应器。在两个或更多生物反应器之间的连接可以是可控的，以允许或防止在生物反应器之间的流动。可以通过闸门(gate)或阀来控制在两个或更多生物反应器之间的连接。可以连接(如流体连接)具有阵列形式的所有生物反应器。可以通过一个或多个通道来连接具有阵列形式的所有生物反应器。
两个或更多生物反应器可以含有同样的肝脏组织模型。可替换地，至少一个生物反应器可以包含肝脏组织模型以及至少一个其它生物反应器可以包含不同的组织、不同的细胞类型或不同的组织模型，例如，肠、肾或其它组织。
可以在可灌注膜上支撑支架。可灌注膜可以是可渗透感染剂颗粒的，或对于感染剂是不可渗透的。可灌注膜可以包括例如但不限于硝基纤维素或尼龙的滤膜(filter)。滤膜可以包括市售滤膜，例如，Whatman903(W-903)、Ahlstrom级226(A-226)或MunktellTFN(M-TFN)。可灌注膜可以包括市售滤膜，例如，Whatman纸号1、硝基纤维素膜号71002(Amersham)、或(iii)HYBOND-M尼龙膜(Amersham)。可灌注膜可以包括基本上类似于本文描述的市售可灌注膜的功能和/或物理性能。可以使细胞培养基流动或灌流通过支架。可以使细胞培养基流动或灌流通过可灌注膜。
生物反应器可以包括用于循环细胞培养基的机构。生物反应器可以包括用于循环细胞培养基的泵机构。泵机构可以包括气动泵或电磁驱动泵。气动泵可以包括柔性膜。循环细胞培养基可以是通过弯曲柔性膜的气动泵的作用，其作用于流体通道。
支架可以包括微通道，如多个微通道。支架可以提供具有微通道的毛细结构。微通道的直径可以是约0.30mm。微通道可以具有约0.075mm至约0.4mm的直径。微通道的直径可以是大于0.02mm。微通道可以具有约1mm或更小的深度。微通道可以具有约0.5mm或更小的深度。微通道可以具有约0.25mm的深度。可以，例如，通过蚀刻、冲孔、钻孔、平版印刷术或激光切割来形成支架结构。支架可以包含聚苯乙烯。可以涂布支架以增强细胞粘附，和/或增强细胞分化的保持。支架涂层可以包含细胞外基质。支架涂层可以包含I型胶原或RGD肽。
肝脏组织模型可以是3维肝脏组织模型，其中在空间中沿着3维排列细胞。可以由包含微通道的支架来提供3维结构。肝脏组织模型可能不是2维单层，其中在空间中沿着单平面来排列细胞。
可以以阵列形式来提供两个或更多生物反应器。阵列可以包括三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多、七个或更多、或八个或更多生物反应器。阵列可以包括至少十个生物反应器。阵列可以包括多个生物反应器。
阵列形式的两个或更多生物反应器可以共用用于循环细胞培养基的泵。阵列形式的两个或更多生物反应器可以共用泵控制机构。
肝脏组织模型可以包括大体上或基本上如描述于专利申请号WO2005123950中的装置和/或组织模型。肝脏组织模型可以包括大体上或基本上如描述于专利申请号W09947922中的装置。专利申请号WO2005123950和WO9947922的披露内容以引证方式结合于本文。
肝脏组织模型可以能够维持肝实质细胞的分化至少5天，至少10天，至少14天，至少20天，至少25天，或至少27天。
可以将肝实质细胞维持于相对于支架的微通道生理上正确的极性。肝实质细胞可以包括微管表面。肝实质细胞可以维持在细胞表面上的NTCP受体。NTCP受体可以是在肝实质细胞的微管表面上。肝实质细胞可以维持NTCP受体在表面上，如微管表面，至少8天，至少14天，至少20天，或至少28天。
可以借助于维持的介质的流动速率以致产生接近生理状态的氧梯度来维持肝实质细胞。可以通过将氧吸收进入介质来提供氧。可以将生物反应器排列在灌注培养板上，从而允许氧灌注进入细胞培养基。
可以借助于接种介质或细胞培养基来接种肝实质细胞。可以借助于接种介质来接种肝实质细胞。用于接种细胞和/或维持肝脏组织模型的介质可以包含适宜的细胞培养基。
接种介质可以包含WilliamsE介质(如来自LifeTechnologies-A1217601)。接种介质可以包含WilliamsE介质以及补充物、FBS和地塞米松的混合物(例如如以平板接种补充物包提供，其来自LifeTechnologies,Invitrogen-CM3000)。接种介质可以包括Dulbecco’sEagle培养基、肝实质细胞长期培养基或其它市售的或内部制作的培养基。细胞培养基可以包含血清白蛋白。可以在病毒递送以后或在病毒感染以后添加血清白蛋白。在病毒递送或感染以后添加血清白蛋白可以有利地降低病毒结合于血清白蛋白的潜力。
细胞培养基/维持培养基可以包括WilliamsE培养基。细胞培养基/维持培养基可以包括WilliamsE培养基以及补充物和地塞米松的混合物(例如如以平板接种补充物包提供，其来自LifeTechnologies,Invitrogen-CM4000)。细胞培养基可以包括Dulcco’sEagle培养基、肝实质细胞长期培养基或其它市售的或内部制作的培养基。细胞培养基可以包含血清白蛋白。可以在病毒递送以后或在病毒感染以后添加血清白蛋白。在病毒递送或感染以后添加血清白蛋白可以有利地降低病毒结合于血清白蛋白的潜力。
细胞培养基可以包括WilliamsE培养基。细胞培养基可以包括Dulbecco’sEagle培养基、肝实质细胞长期培养基或其它市售的或内部制作的培养基。
可以借助于感染介质将病毒递送到肝脏组织模型。感染介质可以包括与肝脏组织模型的病毒和细胞相容的介质。感染介质可以包括适当的细胞培养基。感染介质可以包括WilliamsE培养基或Dulbecco’sEagle培养基或其它市售培养基。
在引入肝脏组织模型以前，可以稀释患者血清(潜在地含有病毒)。在引入肝脏组织模型以前，患者血清(潜在地含有病毒)可以是纯净的。在引入肝脏组织模型以前，感染介质可以用来稀释患者血清(潜在地含有病毒)。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少2倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少5倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少10倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少20倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少100倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少200倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少500倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少1000倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是至少10,000倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是约5倍至约10,000倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是约2倍至约1000倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是约100倍至约500倍。在引入肝脏组织模型以前，患者血清的稀释可以是约250倍。在一种实施方式中，可以将200μ1患者血清稀释在50ml培养基中。
上述方法可以进一步包括诱导肝脏组织模型中的免疫应答。可以通过细胞(如枯否细胞)的LPS(脂多糖)刺激来诱导免疫应答。可以使用诱导免疫应答的其它方法。
介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.2μl/秒至约4.4μ1/s。介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约1μl/秒。介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.2μl/秒至约37μ1/秒。介质通过在支架中的每个微通道的流动速率可以是约0.04μ1/分钟至约0.88μ1/分钟。
在细胞接种期间，例如将细胞引入支架的阶段，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.2μl/秒至约4.4μ1/秒。在细胞接种期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.5μl/秒至约3μl/秒。在细胞接种期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.5μl/秒至约2μl/秒。在细胞接种期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.8μl/秒至约2.5μl/秒。在细胞接种期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约1μl/秒至约2μl/秒。在细胞接种期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约1μl/秒。接种可以包括在约0.2μl/秒至约4.4μ1/秒下，使接种介质流动通过生物反应器至少约6小时。接种可以包括在约0.2μl/秒至约4.4μ1/秒下使接种介质流动通过生物反应器约8小时至约16小时。接种可以包括在约0.2μl/秒至约4.4μ1/秒下使接种介质流动通过生物反应器约8小时。接种可以包括在1μl/秒下使接种介质流动通过生物反应器约8小时。
可以以约1μl/秒的流动速率，接种约0.6xl06个细胞/支架。可以在约1μl/秒的流动速率下接种约0.4xl06至约lxl06个细胞/支架。可以在约1μl/秒的流动速率下，接种约0.4xl06至约0.8xl06个细胞/支架。可以在约1μl/秒的流动速率下，接种约0.5xl06至约0.7xl06个细胞/支架。可以在约0.5μl/秒至约2μl/秒的流动速率下，接种约0.6xl06个细胞/支架。可以在约0.8μl/秒至约1.8μl/秒的流动速率下，接种约0.6xl06个细胞/支架。可以在约0.9μl/秒至约1.2μl/秒的流动速率下，接种约0.6xl06个细胞/支架。可以在约0.5μl/秒至约2μl/秒的流动速率下，接种约0.4xl06至约lxl06个细胞/支架。可以在约0.9μl/秒至约1.2μl/秒的流动速率下，接种约0.5xl06至约0.7xl06个细胞/支架。
在细胞培养期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.2μl/秒至约4.4μl/秒。在细胞培养期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.5μl/秒至约3μl/秒。在细胞培养期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.5μl/秒至约2μl/秒。在细胞培养期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约0.8μl/秒至约2.5μl/秒。在细胞培养期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约1μl/秒至约2μl/秒。在细胞培养期间，介质通过每个生物反应器孔的流动速率可以是约1μl/秒。
视情况而定，细胞密度和流动速率可以用来避免分化因子的显著下调，如表达NTCP的基因的下调。
肝脏组织模型的使用可以包括在0小时时的细胞接种阶段，接着一段时间的细胞培养和感染剂递送。可以通过介质变化，如从接种介质到培养基的变化，将接种阶段转换到培养阶段。可以通过介质流动如流动速率的变化将接种阶段转换到培养阶段。
细胞接种阶段可以包括自时间0小时使接种介质向下流动通过支架(例如，在生物反应器中向下流向支架结构的顶部)以促进细胞包埋和附着于支架。可以在一段时间之后反转流动方向以泵送介质向上通过在生物反应器中的支架结构。用来反转介质的流动的时间段可以是约4小时至约12小时。用来反转介质的流动的时间段可以是约6小时至约12小时。用来反转介质的流动的时间段可以是约8小时至约12小时。用来反转介质的流动的时间段可以是约8小时。
可以在约12小时至约48小时，将接种介质改变为培养基。可以在约16小时至约48小时，将接种介质改变为培养基。可以在约20小时至约48小时，将接种介质改变为培养基。可以在约24小时至约48小时，将接种介质改变为培养基。可以在约16小时至约32小时，将接种介质改变为培养基。可以在约24小时时，将接种介质改变为培养基。
肝脏组织模型的使用可以包括在时间0时的细胞接种阶段，其中已将感染剂引入细胞。肝脏组织模型的使用可以包括在0时间时的细胞接种阶段，以及在0时间时感染剂的递送。感染剂递送可以是在接种以后的约48小时至约96小时。感染剂递送可以是在接种以后的约60小时至约85小时。感染剂递送可以是在接种以后的约65小时至约80小时。感染剂递送可以是在接种以后的约70小时至约75小时。感染剂递送可以是在接种以后的约72小时。
可以在感染剂的递送以后洗涤接种细胞。洗涤可以是在感染剂的递送以后的约1小时至约8小时。洗涤可以是在感染剂的递送以后的约2小时至约8小时。洗涤可以是在感染剂的递送以后的约3小时至约8小时。洗涤可以是在感染剂的递送以后的约3小时至约5小时。洗涤可以是在感染剂的递送以后的至少约3小时。洗涤可以是在感染剂的递送以后的约3小时。
监测，如病毒复制的检测，可以在任何时间点进行。
在接种以前可以引发肝脏组织模型供使用。引发(priming)可以包括在接种细胞以前在有关细胞培养温度(例如，37℃)下，使接种介质流动通过支架。可以在0小时在接种以前至少1天、2天、或3天，提供引发。
肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/48小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/12小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至10,000TCID50/mL感染剂/48小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至10,000TCID50/mL感染剂/24小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至10,000TCID50/mL感染剂/12小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少1000TCID50/mL感染剂/12小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少10,000TCID50/mL感染剂/12小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少1000TCID50/mL感染剂/24小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少10,000TCID50/mL感染剂/24小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少50,000TCID50/mL感染剂/24小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少1000TCID50/mL感染剂/48小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少10,000TCID50/mL感染剂/48小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少50,000TCID50/mL感染剂/48小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生至少100,000TCID50/mL感染剂/48小时。在后感染至少3天以后，肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时或48小时。在后感染至少5天以后，肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时或48小时。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时或48小时，至多达7天后感染。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时或48小时，至多达10天后感染。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时或48小时，至多达14天后感染。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时或48小时，至多达20天后感染。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时或48小时，在约3天至约7天后感染。肝脏组织模型可以产生或者能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/24小时或48小时，在约3天至约14天后感染。
细胞培养基、接种介质和感染介质可以不包含DMSO、或DMSO衍生物如MSM或替代物。DMSO替代物可以包括DTSSP(3,3'-二硫代二[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯])、DTBP(二甲基3,3'-二硫代丙酰胺)、PEG、或有机溶剂，如甲醇或乙醇。在本发明的肝脏组织模型中可以不提供DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在本发明的肝脏组织模型中可以不提供超过1％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在本发明的肝脏组织模型中可以不提供超过0.5％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在本发明的肝脏组织模型中可以不提供过量0.1％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在本发明的肝脏组织模型中可以不提供过量0.01％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基、接种介质、或感染介质中可以不提供过量1％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基、接种介质、或感染介质中可以不提供过量0.5％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基、接种介质、或感染介质中可以不提供过量0.1％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基、接种介质、或感染介质中可以不提供过量0.05％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基、接种介质、或感染介质中可以不提供过量0.01％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基中可以不提供过量1％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基中可以不提供过量0.5％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基中可以不提供过量0.1％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基中可以不提供过量0.05％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在培养基中可以不提供过量0.01％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在感染介质中可以不提供过量1％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在感染介质中可以不提供过量0.5％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在感染介质中可以不提供过量0.1％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在感染介质中可以不提供过量0.05％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。在感染介质中可以不提供过量0.01％的DMSO、或DMSO衍生物或替代物。
根据本发明的另一个方面，提供了筛选方法，用于确定用于治疗或预防肝脏感染的潜在治疗性或预防性候选药物，上述方法包括：
-提供肝脏组织模型，其中肝脏组织模型包含粘附于在生物反应器中的支架的肝实质细胞；
-将感染剂递送到肝脏组织模型；或提供用感染剂预感染的肝脏组织模型；
-将活性剂递送到肝脏组织模型；以及
-监测感染过程。
提供肝脏组织模型可以包括将细胞接种到在生物反应器中的支架上。
根据本发明的另一个方面，提供了肝的感染模型，用于研究能够感染肝脏的感染剂的感染过程，上述模型包含：
-肝脏组织模型，其中肝脏组织模型包含粘附于在生物反应器中的支架的肝实质细胞；以及
其中肝脏组织模型感染有感染剂。
根据本发明的另一个方面，提供了生产感染剂的方法，上述方法包括：
-用感染剂来感染肝脏组织模型；
-温育感染的肝脏组织模型以生产感染剂的后代；以及
-收获后代。
感染剂可以是病毒。病毒可以是肝炎病毒、或修饰的肝炎病毒。病毒可以是肝炎A、B、C、D、E、F或G。病毒可以是肝炎B、D或C。修饰的肝炎病毒可以被减弱。修饰的肝炎病毒可以能够在肝实质细胞中复制以形成病毒后代，但来自其的病毒后代可以被减弱。减弱可以是无能力复制，无能力进入细胞，或发病机制的缺乏或减少。感染剂可以是本文描述的感染剂的任何一种。
根据本发明的另一个方面，提供了通过根据本发明的方法产生的感染剂。
感染剂可以是病毒。
根据本发明的另一个方面，提供了用于识别用于肝脏感染的新型生物标记物的方法，包括应用根据本发明的方法，其中通过监测感染过程并识别响应于感染的分子的存在、不存在、增加或减少来确定生物标记物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于研究体外肝脏组织中的病毒感染和/或复制的方法，上述方法包括：
-将肝实质细胞接种到在生物反应器中的支架上以形成肝脏组织模型；
-将病毒或编码病毒的核酸递送到肝脏组织模型；或在接种到支架上以前，用病毒或编码病毒的核酸来感染肝实质细胞；或用病毒或编码病毒的核酸来感染非实质肝细胞，以及随后将非实质肝细胞接种到支架上；以及
-监测病毒感染过程和/或生命周期。
一种用于体外研究肝脏组织中的感染过程的方法，上述方法包括：
-在约37℃下通过使介质流动通过支架至少约12小时来引发在生物反应器中的支架；
-将肝实质细胞接种到生物反应器中的支架上以形成肝脏组织模型，其中将肝实质细胞悬浮在接种介质中，然后在约1μl/秒下并在约37℃下使接种介质流动通过支架约24小时；
-在约24小时时将介质变化为细胞培养基并在1μl/秒的流动速率下和在约37℃下使细胞培养基流动通过支架以维持肝脏组织模型的细胞培养；
-将感染剂递送到肝脏组织模型；
在递送感染剂以后4小时时，通过用细胞培养基进行介质变化来洗涤肝实质细胞；以及
-监测感染过程。
技术人员将理解，在适当情况下，本发明的一种实施方式或一个方面的可选特性可以适用于本发明的其它实施方式或方面。
现将仅通过实施例的方式，并参照附图，来更详细地描述本发明的实施方式。
附图说明
图1示出支架如何重建天然肝毛细血管床的环境以维持功能。图1A示出支架，其已被设计以重建在流动下的微组织，其类似沿着肝窦状隙对齐的肝实质细胞和非实质细胞的板状排列。借助于灌注板，其使得能够直接灌注支架和原位肝脏微组织，来整合支架。图1B示出天然肝毛细血管床的细节。
图2示出肝脏组织模型，它会被维持在生物反应器中。
图3表明肝表型的保持，其中天然窦状隙结构被复制。示出具有人细胞的支架的放大视图。
图4是天然肝脏组织的示意图，其示出功能区划和氧张力。区I(门静脉周肝实质细胞)参与糖原异生、脂肪酸的β-氧化、和胆固醇合成。区II是中间区。区III(静脉周肝实质细胞)参与糖酵解、脂肪生成、和细胞色素P-450。氧张力已经涉及某些嗜肝病毒的复制[Vassilakietal,JournalofVirology87(5)p2935-2948.March2013]。
图5示出，肝脏组织模型重建生理氧梯度的近似法。图5A是肝脏组织模型的示意图，其示出O2张力。图5B表明在0.25mL/分钟的流动速率下的O2张力。氧是细胞存活和功能的关键调节物。例如，通过O2张力来调节主要药物代谢酶(P450)的表达。
图6是多孔板格式的三个灌流生物反应器的阵列的等距视图(顶部)。
图7是多孔板格式的三个灌流生物反应器的阵列的等距视图(底部)。
图8是多孔板格式的三个灌流生物反应器的阵列的分解图(顶部)。为简单起见，仅示出3单元生物反应器阵列。
图9是多孔板格式的三个灌流生物反应器的阵列的分解图(底部)。
图10是灌流生物反应器的支架的等距详细视图。
图11示出在肝脏组织模型培养物的上清液中的纵向HBVDNA拷贝，其中借助于调节来补偿上清液去除。这种表示更准确地表示，数据点是48小时积聚间隔，而不仅仅是仅整个动力学期间的积累。在来自HBeAg+和HBeAg-患者分离物的肝脏组织模型培养物中测量cccDNA。
图12表明，在两个时间点，在后感染的48和240小时时，在肝脏组织模型中HBV复制中间体和pgRNA的表达。在肝脏组织模型中人肝实质细胞的HBV感染导致在细胞内HBV复制中间体的积累。除复制中间体之外，前基因组(pg)RNA是易于检测的并在感染的过程中增加。
图13示出在肝脏组织模型中的病毒复制，如由HBsAg的分泌所证明的。在用HBeAg+HBV感染以后，示出不同的肝实质细胞供体表现出类似的HBsAg分泌水平。
图14示出，来自肝脏组织模型的上清液是体外感染的。在再感染实验(HBsAgElisa)中提取自前期实验的上清(图11，第10天样品)具有传染性。对于HBsAG水平，比较了感染有患者血清(初始的)的肝实质细胞与感染有提取自使用同样的患者血清(再感染)的肝脏组织模型感染实验(图11)的上清液的肝实质细胞。
图15示出，利用肝脏组织模型，多种人肝实质细胞供体可以用来评估HBV感染。感染导致在多种肝实质细胞供体(供体1和供体2)中可比的HBVDNA水平。
图16示出，利用肝脏组织模型，多种人肝实质细胞供体可以用来评估HBV感染。感染导致在多种肝实质细胞供体中可比的HBsAg水平。可以感染来自雄性、雌性、成年体和未成年体的供体。
图17示出，肝脏组织模型可以用来评估针对HBV的候选药物。每48小时以不同浓度给予拉米夫定(3TC)，其显示出可抑制HBV复制。IC50显示，其相当于用拉米夫定进行的体内治疗。
图18示出本发明的肝脏组织模型和可用的HBV模型系统的比较。
图19示出，源自在HepG2细胞中的质粒转染的HBV载体在肝脏组织模型培养物中具有传染性。
图20示出，从在若干接种密度和相应的流动速率(见表1)下在肝脏组织模型中培养的细胞的LDH释放。LDH的增加提示坏死细胞死亡。
图21示出，从在若干接种密度和相应的流动速率(见表1)下在肝脏组织模型中培养的细胞分泌的白蛋白。
图22示出，相对于最佳条件(0.6x106个细胞/支架，在1μl/秒的流动速率下)，感兴趣的几种基因的表达的倍数变化。注意：分离自0.045百万个细胞的RNA并不产生用于qPCR的足够高质量。NTCP涉及HBV病毒的进入机制。
图23示出来自在第7天接种为单细胞或球状体的人肝实质细胞的白蛋白分泌。对2种不同批次的肝实质细胞形成和接种球状体。来自肝实质细胞的白蛋白分泌表明，细胞处于分化状态。
图24示出，在没有相对于最佳条件(在流动下接种的0.6百万个细胞)的流动下接种的0.6百万个细胞的感兴趣的几种基因的倍数变化。注意：分离自所有形成的球状体的RNA并不产生用于qPCR的足够高质量的RNA。低质量RNA是肝实质细胞的不佳培养的结果。NTCP涉及HBV病毒的进入机制。相比于最佳条件，在所有条件下NTCP的基因表达被下调。肝表型标记物(如测得的基因)的下调表明肝实质细胞处于去分化状态。
具体实施方式
图2A示出支架的相衬图像，其中具有在流动下接种的0.6百万个细胞。图2B示出支架的相衬图像，其中具有在流动下在球状体中接种的0.6百万个细胞。图2C示出支架的相衬图像，其中具有在没有流动下在球状体中接种的0.6百万个细胞。
在标准培养中正常组织结构快速失去，以及在许多疾病过程中在多种细胞类型之间的相互作用是中心的。然而，在本文描述的肝脏组织模型中的3D灌注培养会随着时间的推移维持功能性组织结构，包括窦状隙、细胞相互作用和极性。
肝脏组织模型建立、细胞接种、介质变化以及用肝炎A、B、C、D或E病毒和其它肝细胞(livercell)感染病毒感染。
以下实验应在III级实验室中进行并且可以适用于肝炎病毒、巨细胞病毒、腺病毒和对人肝实质细胞具有感染性的其它病毒。
材料
介质
用于接种的WilliamsE介质以及适合于人肝实质细胞的长期培养的维持培养基。
用于用病毒来感染细胞的WilliamsE介质。可替换的介质可以是Dulbecco’sEagle培养基、或其它适当介质。
肝脏组织模型部件：流体板、气动板、ECM涂覆的支架(13；无菌)、保持环(13)、滤膜(13)、无菌推动器、无菌镊子、多孔板盖(无菌)、膜(无菌)、螺丝钉(43)和洗涤器(43)。
病毒感染源是来自源自感染有病毒的患者的人血液产品。可以使用可替代的病毒源。可以例如通过沉淀来纯化和浓缩病毒以确保足够浓度的病毒颗粒用于加入肝脏组织模型。其它来源可以包括来自产生人病毒的转基因动物模型的病毒颗粒。还可以通过含有病毒基因组的质粒的转染来引入病毒DNA，其被转录和翻译到病毒颗粒。
本发明的肝脏组织模型和方法可利用以下市售介质。
"接种介质"CM3000—解冻/平板接种补充物包(platingsupplementpack)(Invitrogen)
使用：WilliamsE介质(WEM,A1217601)
应用：解冻和平板接种冷冻保存肝实质细胞，平板接种新鲜肝实质细胞
内含物：(浓度在括号中)
胎牛血清
在DMSO中的地塞米松(10mM)
解冻/平板接种混合物—A，含有(18mL总体积)：
·5.0mL青霉素/链霉素(10,000U/mL/(10,000μg/mL)
·500微升重组人胰岛素(4mg/mL)
·5.0mLGlutaMAXTM(200mM/100X)
·7.5mLHEPES,pH7.4(1M)
用于补充介质的指导*：
向500ml介质，添加：
·胎牛血清管的整个内含物(25mL)
·50.0μL在DMSO中的地塞米松
·解冻/平板接种混合物的整个内含物—A(18mL)
"细胞培养基"CM4000—细胞维持补充物包(Invitrogen)
使用：WilliamsE介质(WEM,A1217601)
应用：用于在悬浮液中的细胞的温育介质，培养的肝实质细胞的维持
内含物：(浓度在括号中)
在DMSO中的地塞米松(10mM)
细胞维持混合物—B，含有(20mL总体积)：
·2.5mL青霉素/链霉素(10,000U/mL/(10,000μg/mL)
·5.0mLITS+
-重组人胰岛素(0.625mg/mL)
-人转铁蛋白(0.625mg/mL)
-亚硒酸(0.625μg/mL)
-牛血清白蛋白(BSA)-(0.125g/mL)
-亚油酸(0.535mg/mL)
·50mLGlutaMAXTM(200mM/100X)
·75mLHEPES,pH7.4(1M)
用于补充介质的指导*：
向500ml介质，添加：
·5.0μL在DMSO中的地塞米松
·细胞维持混合物的整个内含物—B(20mL)
肝脏组织模型和装置
已开发了一种系统，其基于具有微通道的灌流支架并利用使细胞培养基循环通过肝脏组织的微通道的平行装置，从而使得这种技术非常适合于肝脏感染研究。
上述系统具有用于细胞或组织培养的灌注生物反应器和储存器对的阵列，以及通过共用控制通道和通过生物反应器和储存器对的阵列的再循环介质平行致动的阀和泵。阵列的每个生物反应器包括生物反应器孔和它自己的储存器孔。通过流体通道来连接生物反应器孔和储存器孔，从而允许细胞培养基的再循环。
每个生物反应器/储存器对流体分离自阵列中的所有其它生物反应器/储存器对。通过共同的液压或气动控制通道来平行致动在阵列中的所有生物反应器的阀和泵。
在流体歧管中制造或微制造生物反应器/储存器对。在控制歧管中制造或微制造控制通道。通过将单片聚合物膜夹在流体和控制歧管之间来产生隔膜阀。
可以通过通过控制通道施加的液压或气动驱动来偏转在控制和流体通道之间的膜。通过串联连接的阀的顺序驱动来泵送在多个生物反应器中的细胞培养基。
每个生物反应器包括孔，其包括三维细胞/组织支撑结构/支架。细胞支架或载体制作自合成或天然多孔材料。细胞支架形成自在由微孔滤膜或膜支持的固体薄膜或片材中的微通道的阵列。可以从生物反应器孔除去支架。用共同的可移动盖来覆盖在阵列中的所有生物反应器/储存器对，然后可以通过移液器或机械手来进行细胞/组织接种剂添加、或样品收集。
供用于本文的代表性的肝脏组织模型装置，为简单起见，阵列仅包括多孔板格式的三个生物反应器/储存器对，如图6-10所示。然而，可以容易地按比例缩小组件的尺寸并可以在单个板上放置相当高数目的生物反应器/储存器对。可容易从顶部达到支架。每个生物反应器的主要功能部件是孔4，其具有3D细胞/组织保持支架或载体8。上述设计包括在孔中的轮缘以减小流体表面的弯月面并从而在显微镜下的细胞/组织观察期间最大限度地减小光畸变；以及使处于烟囱排列的反应器/储存器对最大限度地减少在相邻反应器之间的交叉污染。上述烟囱可以匹配与在盖中的相应形状的环以最大限度地减少液体自反应器孔、储存器孔、和连接表面通道的蒸发。制作抓斗形状的阀可弥补拉伸或皱膜并改善阀性能。制作椭圆形的阀和泵会减小可能俘获气泡的面积。
可以利用常规硅加工技术，如光刻、湿蚀刻、或深度反应离子蚀刻；微机械加工；放电机械加工；反应注射模塑；热塑性注射模塑；微模塑；冲孔；任何固体自由形式技术，如三维打印；或其它类型的制造，其可以在片状材料中产生微通孔，尤其是塑料制造技术，如微模塑、压纹、激光钻孔、或电子束机加工，来制作支架或载体。可以利用方法如平版印刷术和微机械加工、放电机械加工、和电镀，来制作用于一些这些过程的模具。
许多材料通常用来形成基质。除非另有规定，术语"聚合物"将用来包括用来形成基质的任何材料，包括聚合物和单体，其可以被聚合或粘附以形成整体单元，以及无机和有机材料(如下文所讨论的)。在一种实施方式中，颗粒形成自聚合物，其可以被溶解于有机溶剂并通过除去溶剂加以固化，如合成的热塑性聚合物，可生物降解的或不可生物降解的，如聚酯、聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚原酸酯、乳酸和乙醇酸以及其它羟基酸的聚合物、以及聚磷腈、蛋白质聚合物，例如，白蛋白或胶原蛋白、或多糖。可以用来形成基质的非聚合物材料的实例包括有机和无机材料如羟基磷灰石、碳酸钙、缓冲剂、和乳糖、以及在药物中使用的其它常用赋形剂，其是通过施加粘合剂或粘结剂而不是溶剂来加以固化。在用于制作用于细胞附着和生长的器件的聚合物的情况下，基于聚合物诱导来自细胞的适当的生物反应，例如，附着、迁移、增殖和基因表达，的能力来选择聚合物。
可以通过参考ThePolymerHandbook,第三版本(Wiley,N.Y.,1989)来获得其它适宜的聚合物。
参照图6-10，可以，例如，通过多孔膜或通过在由微孔滤膜9支撑的固体薄膜或片材中的微通道的阵列，来形成细胞/组织支撑结构8。可以，例如，通过纤维粘结(Vacanti,etal.MRSProceedings,vol.252(1992)；Mikos,etal.,J.Biomed.Mater.Res.27:183-189(1993)、溶剂浇铸/颗粒沥滤(Mikos,etal.,Biomaterials14:323-330(1993)、气体发泡(Mooney,etal.,Biomaterials17:1417-1422(1996)、和气体分离(Lo,etal.,TissueEngineering1:15-28(1995)，来制造多孔支架。可以利用适当的技术如通过深度反应离子蚀刻技术(Powers,etal,BiotechnologyandBioengineering,78:257(2002)来微制造具有微通道阵列的硅支架。可以通过激光-微机械加工(Brenan,etal.,Proc.SPIE,3912,76-87,Prog.Biomed.Optics,Micro-andNanotechnologyforBiomedicalandEnvironmentalApplications,SanJose,January26-27,2000)、注射模塑(Weibezahn,etal.,MicroSystemTechnologies'94,H.ReichlandA.Heuberger,eds.,vde-verlaggmbh,Berlin,pp.873-878)或光聚合来产生具有微通道的聚合物支架。
具有微通道的固态支架8可以具有顶层，其含有保持细胞的微通道的阵列。在阵列中的每个微通道是生物反应器的功能单元。在此层下，存在微孔膜或滤膜9。膜可以是细胞保持支架的整体部分或它可以是例如热或超声接合于它。细胞和/或组织保持支架可以提供有密封垫片7、11、支持支架10、和插入件12。微通道34可以具有方形、狭缝、圆形、椭圆形或卵形横截面。通道的典型尺寸是几百微米。狭缝可以是几百微米至几毫米长。支架厚度通常是几百微米。
可以例如通过微机械研磨自聚合物如聚碳酸酯来制造流体24和控制22歧管。在小批量制造中这可以是成本有效的。在大容量制造中，可以使用大规模复制技术如注射模塑和材料例如聚苯乙烯或聚碳酸酯。可替换地，可以使用3D打印技术。膜材料可以是例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。可以例如通过等离子体氧化配合表面并立即将部件压在一起(Duffyetal,Anal.Chem.,70,4973-4984(1998)来将膜23结合到流体和控制歧管。可替换地，可以将膜23夹在流体24和控制22歧管之间，例如借助于紧固或闭锁机构，其对膜提供恒定力并将歧管保持在一起。
可以将支架8例如压入配合进入在流体歧管24中的生物反应器孔4的下部锥形部分。通过两个流体通道将生物反应器孔4与储存器孔6连接。上部例如U形通道5用来将来自生物反应器孔4的细胞培养基返回进入储存器孔6。储存器的底部可以包括侧角(倒角，face-off)，用于插入微孔滤膜26，其具有通过压入配合插入件27固定在储存器孔中的滤膜支撑25。在板上的阵列中的生物反应器/储存器对是相同的。滤膜26可以用来从细胞培养基除去细胞碎片。利用在储存器孔中的滤膜可以改善阀和泵的可靠性。此外，它可以消除堵塞在细胞/组织保持支架8的背面上的膜或微孔滤膜9。通过端口29，将过滤的培养基抽吸进入底部流体通道30、31、和32，其连接储存器6和生物反应器孔4。通道配备有形成泵的三个隔膜阀。通过将整体弹性体膜23夹在流体24和控制22歧管之间来产生阀。产生阀，其中控制通道穿越流体通道。阀可以是例如常闭合的。在这种情况下，通过对在控制歧管中的通道20、35、和36施加真空通过用0环密封的配件16、15、和14，弹性体膜23被向下偏转，阀被打开，以及细胞培养基填充阀置换室19、18、13以及在膜23上方的所有其它连接的置换室。施加正压力会强制膜对抗阀座以及细胞培养基离开阀的置换室。以六步循环来操作每个泵的阀。最初，所有阀是关闭的。
在第一步骤中，打开通过控制通道20串联连接的生物反应器/储存器对中的进口阀19和所有其它阀。
在第二步骤中，打开通过控制通道35串联连接的生物反应器/储存器对中的主要隔膜阀18和所有其它阀。在第三步骤中，关闭通过控制通道20串联连接的生物反应器/储存器对中的进口阀19和所有其它阀。在第四步骤中，打开通过控制通道36串联连接的生物反应器/储存器对中的出口阀13和所有其它阀。在第五步骤中，关闭通过控制通道35串联连接的生物反应器/储存器对中的主要隔膜阀18和所有其它阀。在第六步骤中，关闭通过控制通道36串联连接的生物反应器/储存器对中的出口阀13和所有其它阀。可以例如通过连接于真空和压缩空气源的电磁阀来控制泵送细胞培养基的阀。
常闭合的单片膜阀是自吸的并且简单地通过反转致动循环来向前或向后泵送细胞培养基。通过调节隔膜阀置换室的体积，在设计阶段可以确定每次驱动所泵送的体积。因此，隔膜泵可以用来精确计量细胞培养基的体积。如果泵的置换室是相同的，则将在相同的流动速率下灌流在所有生物反应器中的细胞/组织。相比之下，如果泵具有不同体积的置换室，则可以在不同的流动速率下灌流在每个生物反应器中的细胞/组织。
例如通过将细胞培养基人工或机械手移液进入生物反应器或储存器孔并以正向或反向方向激活泵送循环，来引发生物反应器和储存器对。如果必须从流体通道除去气泡，则可以使用配合螺丝钉和密封O形环的放气口(未示出)。可以经由通道将放气口连接于生物反应器孔4。
参照图6-10，通过将细胞悬液液分配(例如，通过人工或机械手移液)进入生物反应器孔4，将细胞接种进入支架8。将来自储存器孔6的细胞培养基循环进入生物反应器孔4。在生物反应器孔4的支架8中灌注3D细胞培养基以后，将细胞培养基返回到储存器孔6。阵列的每个生物反应器具有它自己的储存器6以及它的微流体通道5、30、31、和32与在阵列中的所有其它生物反应器完全分离。利用隔膜泵来再循环细胞培养基。串联连接的三个隔膜阀形成隔膜泵。串联连接的三个隔膜阀形成隔膜泵。通过将整体弹性体膜23夹在流体24和控制22歧管之间来产生阀19、18、和13，因而产生泵。产生阀，其中控制通道穿越流体通道。可以借助于通过控制通道施加的液压或气动驱动来偏转在控制和流体通道之间的薄膜23。通过串联连接的阀的顺序驱动来泵送细胞培养基。通过常见的液压或气动控制管线来平行致动在阵列中的所有生物反应器/储存器对的阀。因此，在这种情况下，通过三个常见的气动或液压管路可以处理5个完全分离的灌注生物反应器。因此，在这种情况下，通过三个常见的气动或液压管路可以处理5个完全分离的灌注生物反应器。然而，通过三个气动或液压管路来操作的在阵列中的生物反应器/储存器对的数目可以显着地扩大。
阀和泵是可扩展的并且可以以密集阵列来微制造。Unger,etal,Science286,113(2000)、T.Thorsen,etal,Science298,580(2002)、和W.H.Grover,etal.,SensorsandActuatorsB89,314(2003)描述了生产单片阀和泵的过程。
由于以下事实：生物反应器/储存器对的阵列具有开放式设计并且被共同的可移动盖28所覆盖，所以可以利用自动化机械手工作站来进行细胞接种以及活性剂添加和样品收集。
通过细胞代谢的需要和通过机械应力问题来确定通过上述系统的流动速率。在近连续的基础上，需要0.1-1微升/分钟介质/1000个细胞的流动速率(至多达15分钟的没有流动的短周期是可行的)。
每个生物反应器通常含有500至50,000个细胞，或可替换地多达2,000,000或5,000,000个细胞，其取决于待进行的测定的类型。支架的设计允许以约2000的单位(即，一个通道)来很容易缩放上述系统。在培养或测定期间，通过系统的流动速率可能是不同的以进行测定(例如，可以放慢流动速率以允许化合物的完成转化，或可以增加流动速率以保持恒定浓度的化合物)。
传感器可以用来检测pH、氧水平、特定代谢物如葡萄糖的变化，指示分子如病毒蛋白的存在或不存在，或对在生物反应器内的组织或暴露于组织的材料的影响的任何其它标记。
伤害或感染的读数可以基于组织的荧光的变化，如通过小型化光纤阵列(经由单或多光子装置，其激发荧光)所检测的。激发的特性是关键参数。就分辨率和组织损伤的预防而言，相对于单光子，多光子激发具有若干优点。
许多类型的荧光读数是可能的。可以通过测量NAD(P)H水平的变化(通过这些分子的固有荧光)，来评估组织的基础代谢参数的变化。细胞还可以预先加载有染料，其在膜损伤的情况下漏出，从而导致荧光强度的降低。可替换地或者此外，在应激相关启动子的控制下可以将报告基因转染入细胞，在组织损伤过程中上述应激相关启动子被激活以产生荧光产物。这后一种方法对于在快速时间尺度上检测病毒感染是特别令人感兴趣的。
已经确定荧光强度和/或光谱将变化的一组潜在指示剂。因为反应可能需要监测在正常组织结构内的细胞生化状态，所以仅分析组织中细胞的表面层可能不是足够的，而要选择性地监测深入通道内部的细胞层几种细胞。这些要求可以概括为用于光学检测系统的四个设计准则：(1)在厚度为(300μm)的组织中的深度选择检测，(2)用来成像各种指示剂的柔性激发和检测方案，(3)对在装置中的活组织培养的微创，(4)具有高灵敏度的快速信号检测，(5)坚固耐用的和现场适应的。
利用单光子激发，共焦检测用来分离来源于通道内部与它的表面的荧光。共聚焦显微镜是发展良好的仪器，其被设计成来光学切片厚试样。在共轭面中排列两个孔或针孔，一个在光源的前面以及一个在检测器的前面。通过使用单模光纤，可以简化这种设计并使得更加强大地用于在线检测。通过二色分束器，将激发光引入单模光纤(未示出分束器)。可以通过透镜来对准发射自光纤的光。第二透镜可以聚焦准直光进入组织芯片的通道。在本申请中高分辨率不是关键的(不需要成像)，因而为在流动室中的液压设计提供空间的低光学元件和芯片也不是关键的。通过两个中继透镜来收集来自样品的荧光并反射回到单模光纤。小直径光纤同时作为在此系统中的激发和发射针孔。通过中继透镜，不能将源自焦点区域外的荧光再聚焦到光纤并且被衰减。此方法哦我们提供了深度辨别。可以考虑激发波长为光谱的近UV至蓝绿区的许多发色团。特别令人感兴趣的荧光指示剂是内源性发色团，吡啶核苷酸。吡啶核苷酸，NAD(P)H在区365nm中被激发并在区400-500nm中发萤光。另一种感兴趣的指示剂是绿色荧光蛋白(GFP)，其可以在光谱的近UV或蓝光区中被激发并通常在约510nm处发射。为了激发这种广泛的发色团，可以使用可调谐的UV氩离子激光器。
可以通过同时吸收两个光子，其各种具有为激发跃迁所需要的一半能量，来激发发色团。因为双光子激发仅发生在高数值孔径物镜的焦点处，光子的高时空浓度的区。利用双光子激发，80％以上的总荧光强度来自围绕1.25数值孔径物镜的焦点的1μm厚区。双光子激发的这种深度辨别效应产生于双光子荧光强度对激发光子通量，其远离焦面而迅速减小，的二次依赖性。深度辨别是激发方法的物理现象的结果，并且不需要共焦检测针孔。在简单的漂白实验中可以最好地可视化双光子激发的这种定域化。
为了表明双光子激发的效应，在15μm荧光乳胶球的中心聚焦双光子激发体积。沿着x轴重复扫描激发体积直到发生光致漂白。获得乳胶球的3D图像堆，其中一系列的图像是球体的在离中心增加的距离处的x-y平面。超过1微米，没有观察到光致漂白。
双光子激发允许在组织芯片通道的内部中在任何点处的组织生理状态的选择性评估。
相比与共焦方式，其中样品的吸收和散射系数较高，多光子方式有许多优点，如在组织中的那些优点：(1)在红外光谱范围内的典型的散射和吸收是数量级以上小于近UV或蓝绿区。在双光子显微镜中使用红外激发会最大限度地减小激发信号的衰减。
(2)共聚焦显微术使用发射针孔来截止出聚焦光。在深层组织内部，信号光子的散射是不可避免的。
随后的路径偏离导致在共焦针孔处这些光子的显著丧失。在双光子情况下，其中可以使用大面积检测器而没有针孔，用于荧光光子的收集几何形状是不太关键的。可以保留大多数的前向散射光子。(3)双光子激发会最大限度地减小组织光损伤。
通过限制观察体积，常规共焦技术获得3D分辨率，但在整个沙漏形光路中发生荧光激发。相比之下，双光子激发将光相互作用的区限于在焦点处的亚飞升体积。(4)双光子激发波长通常红移至约两倍的单光子激发波长。在激发和发射光谱之间的这种宽分离会确保，可以衰减激发光和拉曼散射，同时滤出最少的荧光光子。(5)已发现，荧光团具有非常广泛的双光子吸收光谱。单一适当选择的激发波长可以激发发射带为近UV至近红外的广泛的荧光团。
还可以使用不同于荧光传感器的传感器。例如，可以通过利用红外分光光度计、紫外分光光度计、气相层析图、高效液相色谱图、质谱法、以及本领域技术人员已知的其它检测方法，来分析样品。它们可以用来测量营养物、气体、代谢物、pH、以及细胞活性、感染、和代谢的其它指示剂。可以对细胞本身或对培养基、或对两者进行测量。可以在培养过程中和在培养结束时，作为时间进程测定或终点测定或两者，来进行测量。
实验协议
将被高压灭菌的部件：流体板、滤膜、保持环、镊子、推进器、螺丝钉和洗涤器。
无菌(γ-照射的)部件包括膜和支架。支架可以涂布有细胞外基质以帮助细胞粘附。
肝脏组织模型建立
通过将膜放置在气动板上以及将流体板放置在顶部上来组装反应器。螺丝钉以及43螺丝钉和洗涤器，开始在中心并向外工作(在中间行的中心仅需要一个螺丝钉)，利用校准的扭矩改锥，其被设定以得到对于每个螺丝钉的30Ncm的转矩。
借助于温暖接种介质，并通过添加450μL到储存器侧来引发系统。
在2.0μl/秒下流动介质至多达2.5分钟直到流体穿过滤膜支撑物并消除气泡。
用另外的1.4ml接种介质来填充反应器以覆盖表面通道。此介质可以含有用于在接种期间感染细胞的感染源。
添加滤膜、支架和保持环并推到位。
留在培养箱中直到接种(有/无流动)。
细胞接种
a)以大约600,000个细胞/孔的密度，将新鲜分离或冷冻保存的人肝实质细胞(根据供应商的说明加以解冻)接种进入支架。此数目可以变化，其取决于细胞的每个单独的批次、和微通道的数目，以及根据经验确定。
b)计数细胞并调节体积至6x106个细胞/ml，用于100μL/孔的接种体积。
c)从培养箱除去引发板，停止流动，并除去介质下至保持环，在接种细胞以前将400μL接种介质加入每个孔。
d)将细胞加入每个孔并开始以1μl/秒泵送向下的流动。
e)添加900μL接种介质以实现1.4ml的总体积(在板之间的通道中具有另外200μl)
f)将板移动到培养箱，其中在1.0μl/秒下泵送向下流动通过支架8小时。在8小时以后，流动将自动反转以向上泵送通过支架。
g)在24小时以后，将接种介质变化到培养基。此介质可以含有病毒感染源(如适合于实验)。
感染/转染
可以在以上阶段(e)时或在随后的介质变化时，其时组织已形成在支架上(如适合于实验)，添加感染的患者血清或其它全病毒源。可以将这样的源加入介质以构成多达理想地不超过10％的介质体积(虽然不排除较高浓度)或可以在加入孔中以前稀释在介质中高达10,000倍。
可以可替换地在上述阶段(b)中在接种进入支架以前，利用感染的患者血液产品来进行病毒感染，其中上述感染的患者血液产品可以被浓缩以增加病毒颗粒的浓度或被稀释以实现最高效率感染。可以通过全生理机制来进行感染或通过添加据报道会促进病毒进入的因子加以增强，例如PEG的添加。此时还可以借助于质粒DNA并利用在本领域中公知的用于转染的许多标准协议的任何一种来转染细胞。
病毒感染源可以在任何介质变化时引入并且可以是在不同的介质变化时的单独添加或多次添加。
介质变化
在最初24小时以及周期培养(其可以是大于14天)的其后的每个48小时以后交换介质。
在每个介质变化时，可以将肝炎感染的人血清或病毒的其它来源加入介质以构成多达10％的介质体积。在加入孔中以前，病毒源可以是未稀释的或可被稀释在介质中高达10,000倍。停止流动以及从上述支架、通道和储存器抽吸介质。除去介质至保持环的水平。必须小心不要从支架的上方除去总介质以避免气泡形成。
将400μl介质放置在每个孔中并在1.0μl/秒下运行向下流动大约3.5分钟，同时从储存器和通道连续抽吸介质。
用1.4ml介质来更换并返回到培养箱。
检验
可以通过量化在培养基中的病毒DNA或RNA(当适合于肝炎的菌株时)来证实肝炎复制。
可以通过链特异性RT-PCR测定来监测病毒复制。
还可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA试剂盒)在介质中检测肝炎表面抗原。
对于细胞连接性和极性肝表型的维持
Powers等(2002.TissueEngineering,Vol8(3),pp.499-513)，其以引用方式结合于本文，表明，紧密连接和桥粒的电子显微照片表明，细胞间相互作用是存在的并且允许细胞间通讯(见Powers等的图6)。此外，电子显微照片示出胆微管结构，其表明，细胞极性是存在的。因此，在研究感染中重要的细胞内相互作用在肝脏组织模型中是存在的。Powers等(2002.BiotechnologyandBioengineering,Vol.78(3),pp.257-269)，其以引用方式结合于本文，在图9中还示出，在支架中的通道是窦状隙的近似以及细胞形成毛细血管床状结构。
实施例1-利用肝脏组织模型，原代肝实质细胞的肝炎B病毒感染。
为了证明利用肝脏组织模型原代肝实质细胞的成功的肝炎B病毒感染，选择HBeAg阳性和阴性分离菌作为HBeAg+。HBV更类似野生型HBV，如在感染期间早期看到的，而HBeAg阴性HBV获得突变，其使得e抗原非功能的。相比与HBeAg阳性HBV，HBV的此变体是在感染的稍后阶段看到并且通常导致在血清中低得多的复制水平。即使可能有一些稀少的报告，其描述利用HBeAg阳性样品的胎儿肝实质细胞来用于HBV的培养系统，但未曾描述用于HBeAg阴性HBV的模型。
温育和采样提供如下：
接种物
·HBeAg阳性：2.2e7HBVDNA拷贝数/mL(m.o.i.＝0.75)。
·HBeAg阴性：4.4e4HBVDNA拷贝数/mL(m.o.i＝0.075)。
样品
·在每个指定时间点对上清液取样(n＝6)。
·在平板接种后的第5天和第13天对细胞取样(在感染后的第2天和第10天，n＝3)。
分析物
·上清液，用于：HBVDNAqPCR，用于HBeAg的Elisa，细胞因子生产，白蛋白分泌。
·细胞，用于：HBVDNAqPCR，HBVcccDNAqPCR，通过qRT-PCR的复制中间体。
结果
参照图11，其示出在肝脏组织模型培养物的上清中的纵向HBVDNA拷贝。此数据表示清楚地表明在HBeAg阳性和阴性HBV之间的HBV复制的差异。因为在每个收获时间点时除去培养物的所有上清，这种表示准确表明，数据点更多是48小时积聚间隔而不仅仅是仅整个动力学期间的积累。
参照图12，其表明在肝脏组织模型中HBVRNA种类的表达。在感染后48小时和240小时时，裂解细胞以分离总细胞RNA。因为HBV复制依赖总共四种mRNA自病毒基因组的转录来产生病毒蛋白，所以这些RNA中间体的测量用来证明复制的明确的方式。另外，这些mRNA中间体并没有被包装入病毒，因而并不存在于用于接种的血清中。
在HBV中间体和pgRNA之间的差异在于，中间体仅由用来翻译病毒蛋白的4个mRNA种类组成，而前基因组(pg)RNA是编码在RNA中的完全HBV基因组，其随后被HBV逆转录酶反转录。两种种类的这里所看到的量的增加仅可以归因于病毒复制。因此，表明在肝脏组织模型中的HBV复制。
实施例2-用于肝脏组织模型的接种密度和流动速率
方法
冷冻保存的人肝实质细胞
按照供应商的协议来制备冷冻保存的人肝实质细胞(LotB；TriangleResearchLabsUSAandLotA；CelsisIVT，USA)。细胞活力，如通过台盼蓝排除试验所评估的，是＞90％。
在肝脏组织模型中培养的冷冻保存的人肝实质细胞
在若干密度下并以相应的流动速率(见表1)，将肝实质细胞接种进入肝脏组织模型灌注培养板。为培养的第一个24小时提供接种介质(1.6mL)，其包含含有平板接种补充物(包括5％FCS)(LifeTechnologies，UK)的Williams的E培养基。
在接种24小时以后，除去接种介质并用含有维持补充物(1.6ml)(LifeTechnologies，UK)的Williams′E(细胞培养基)加以更换。在指定的流动速率(见表1)下，在通过支架/组织的向下方向泵送细胞培养基8小时。在8小时以后，反转流动方向并在整个培养期间将细胞维持在恒定流动下。每2天更新介质。
在第7天结束培养。在每个介质变化时(第3、5和7天)，将介质存储于在-80℃下的聚丙烯Eppendorfs中，供进一步分析。在最后的时间点，获取相衬图像以评估在支架内的组织形态并随后裂解细胞，用于基因表达分析。
细胞/通道 细胞/脚手架 流动速率(μl/s)
4000 1.2x106 2
2000(最佳条件) 0.6x106 1
500 0.15x106 0.2
150 0.045x106 0.2*
表1.接种的细胞数目和相应的流动速率。*0.2μl/秒是在所使用的设备中可用的最低流动速率。
在肝芯片中的球状体形成和接种
以在Williams的E培养基，其具有平板接种补充物(包括5％PCS)(LifeTechnologies,UK)，中的2000个细胞/孔的密度，将肝实质细胞接种到非组织培养处理过的塑料24孔板上。将板放置在在150rpm的定轨振荡器上，其是在在37℃下并具有5％CO2的加湿培养箱中。形成球状体超过72小时。在证实球状体形成以后，以0.6x106个细胞/孔的密度将球状体接种进入肝脏组织模型。对于第一个24小时培养，接种介质(1.6mL)包含Williams的E培养基，其具有平板接种补充物(包括5％FCS)(LifeTechnologies,UK)。
在接种24小时以后，除去接种介质并用含有维持补充物(1.6ml)(LifeTechnologies,UK)的Williams'E(细胞培养基)加以更换。在1μl/秒下并在通过支架/组织的向下方向泵送细胞培养基8小时。在8小时以后，反转流动方向并在整个培养期间将细胞维持在恒定流动下。每2天更新介质。
在第7天结束培养。在每个介质变化时(在第3、5和7天)，将介质存储于在-80℃的聚丙烯Eppendorfs中，供进一步分析。在最后的时间点，获取相衬图像以评估在支架内的组织形态并随后裂解细胞，用于基因表达分析。在流动的情况下将球状体和单细胞接种进入肝芯片(如上文所描述的)并比较与在没有流动5小时的情况下接种的球状体和单细胞。在没有流动的5小时以后，在1μl/秒下并在向上方向上开始流动。
在第7天时的终点测定
在7天培养以后，评估NTCP、CYP3A4、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、HNF4和HNFI的基因表达并测量分泌进入介质的白蛋白。
利用ELISA试剂盒(AssayPro,USA)并按照制造商的协议(具有一些修改)来测量在培养基中的白蛋白水平。
利用RNA小量制备试剂盒(Qiagen,Manchester,UK)并按照制造商的协议，RNA提取自3次汇集的肝脏组织模型支架/条件。利用GenovaPlus纳米分光光度计(Jenway,Staffordshire,UK)来量化RNA并利用大容量的RNA至cDNA试剂盒(LifeTechnologies,Paisley,UK)来反转录1μg。利用证实的KiCqStart引物(Sigma,Poole,UK)，并利用SYBR绿(LifeTechnologies,Paisley,UK)，来进行PCR。用QuantStudio6实时PCR系统(AppliedBiosystems,Warrington,UK)来进行PCR。利用△△Ct方法并选择β2微球蛋白作为用于所有样品的持家基因，来计算在基因表达中的倍数变化。
结果
借助于调节的流动速率的接种密度
以下实验表明在肝脏组织模型中用于HBV的培养的最佳接种密度和流动速率的适用性。
图20示出自细胞的LDH释放，其中上述细胞是在若干接种密度下在肝脏组织模型中加以培养。LDH的增加提示坏死细胞死亡。调节接种密度至低于在1μl/秒下的最佳的0.6百万个细胞/支架导致在第5和7天时LDH释放的较大峰，在0.2μl/秒下分别为0.15百万个细胞和0.045百万个细胞。
图21示出在若干接种密度和相应的流动速率下自在肝脏组织模型中培养的细胞的白蛋白分泌。将白蛋白分泌归一化到接种的细胞的数目并导致在所有3个时间点时可比较的水平。
细胞/脚手架 RNA量化 比率
x106 ug/ml 260∶280
1.2 284.86 1.97 通过
0.6 81.85 1.87 通过
0.15 38.53 1.77 通过
0.045 8.15 1.21 失败
表2.自在第7天时汇集的支架的RNA量化，以及自在不同的接种密度下在肝脏组织模型中培养的人肝实质细胞的260∶280比率。通过＝高于1.7的比率，并具有足够数量的RNA。这产生自高质量的组织形成。失败＝低于1.7的比率。肝实质细胞的较差的接种导致RNA的量太低以致不能用于qPCR。
参照图22，相对于最佳条件(0.6x106个细胞/支架，在1μl/秒的流动速率下)的qPC数据表明在第7天时在培养物中所有感兴趣的基因的下调。注意：分离自0.045百万个细胞的RNA并不产生用于qPCR的足够高质量RNA。NTCP对于HBV进入肝实质细胞是必不可少的。所有测试的条件表明，相对于在最佳条件下的表达，NTCP的下调，这表明最佳条件对于人肝实质细胞的HBV感染性是重要的。此外，肝表型标记物如测得的基因的减量调节表明肝实质细胞处于去分化状态。
有/无流动下，球状体和单细胞接种
提出了一种实验以表明，在肝脏组织模型中单细胞接种的坚固性，以及在接种过程中需要流动。使用的最佳流动速率是在1μl/秒下0.6x106个细胞/支架。
细胞批次 球状体/单细胞 流动速率 RNA量化 比率 26 -->
μl/sec μg/ml 260∶280
Lot A 球状体 1 6.71 1.10 失败
Lot B 球状体 1 1.55 0.32 失败
Lot B 单细胞 1 81.85 1.87 通过
Lot A 球状体 0 6.22 1.17 失败
Lot B 球状体 0 3.07 0.82 失败
Lot B 单细胞 0 25.36 1.49 失败
表3.自在第7天时汇集的支架的RNA量化，以及来自人肝实质细胞的260∶280比率，其中上述人肝实质细胞在接种时在有/无流动下接种为球状体或单细胞。通过/失败(如上述，见表2)。
参照图23和表3，在有或没有流动下，球状体并不接种进入肝脏组织模型，以及参照图25，相衬图像显示缺乏在支架的通道中形成的组织。
图24示出相对于最佳条件(在流动下接种的0.6百万个细胞)在没有流动下接种的0.6百万个细胞的感兴趣的几种基因的倍数变化。注意：分离自所有形成的球状体的RNA并不产生用于qPCR的足够高质量RNA。低质量RNA是肝实质细胞的不佳培养的结果。NTCP参与HBV病毒的进入机制。和最佳条件相比，在所有每件下，NTCP的基因表达被下调。肝表型标记物如测得的基因的下调表明肝实质细胞处于去分化状态。
结论
总而言之，对于在肝脏组织模型中的功能性组织的形成以及原代人肝实质细胞的HBV感染，在1μl/秒下的0.6百万个细胞是最佳的。对于2000个细胞/通道，在0.2μL/分钟/通道的流动速率下，这是可扩展的，因此可以扩展到具有不同数目的通道的支架。对于在有/无流动下的球状体和单细胞接种，在流动下接种的0.6百万单细胞优于在没有流动下接种的细胞。这表明，对于细胞接种来说，流动是必要的，其中单细胞是优选的，其表明在最佳条件下接种的肝脏组织模型对于用HBV来感染肝实质细胞是理想的。

Claims (53)

1.一种用于研究体外肝脏组织中感染过程的方法，所述方法包括：
-将肝实质细胞接种至生物反应器中的支架上以形成肝脏组织模型；
-将感染剂递送到所述肝脏组织模型，或提供用感染剂预感染的肝脏组织模型；以及
-监测所述感染过程。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以约0.5μl/s至约2μl/s的通过所述生物反应器的流动速率接种约0.4xl06至约lxl06个细胞/支架。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，以约0.9μl/s至约1.2μl/s的通过所述生物反应器的流动速率接种约0.5xl06至约0.7xl06个细胞/支架。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，以约1μl/s的通过所述生物反应器的流动速率并以约0.6xl06个细胞/支架的密度接种所述细胞。
5.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述肝脏组织模型产生或能够产生1000至100,000TCID50/mL感染剂/48小时。
6.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，将所述感染剂递送到肝脏组织包括：
-在接种所述肝实质细胞以后，将所述感染剂加入所述肝脏组织模型；或
-在接种以前将所述感染剂加入肝实质细胞；或
-将所述感染剂加入非实质细胞并随后将所述非实质细胞接种到所述支架上。
7.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，提供用感染剂预感染的所述肝脏组织模型包括在将肝实质细胞接种至所述支架上以前将所述感染剂加入所述肝实质细胞；和/或将所述感染剂加入非实质细胞并随后将所述非实质细胞接种至所述支架上以形成所述肝脏组织模型。
8.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述方法是用于研究体外肝脏组织中的病毒感染和/或病毒复制；以及可选地，其中所述感染剂是病毒或编码病毒的核酸。
9.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，以至少约0.01m.o.i(感染复数)的量递送所述感染剂；或
其中，以至少约le4/ml的量递送所述感染剂。
10.根据前述任一权利要求所述的方法，进一步包括将活性剂递送到所述肝脏组织模型；以及可选地，其中所述活性剂是候选药物、标记物或细胞信号分子；以及进一步可选地，其中所述候选药物是抗体、或它的片段或变体；小分子；肽；或核酸如siRNA。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，在递送所述感染剂以前、并行、同时或以后，将所述活性剂递送到所述肝脏组织模型。
12.根据前述任一权利要求所述的方法，进一步包括与所述肝实质细胞一起接种另外的细胞，其中所述另外的细胞是非实质肝细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述肝实质细胞和非实质细胞是相同物种。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中，所述非实质肝细胞选自包括巨噬细胞(枯否细胞)、星形细胞(伊藤细胞)、胆管细胞、肝窦内皮细胞、肝前体细胞、和其它次要的非肝实质细胞的肝细胞或它们的组合的组中的任何一种。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，以约10,000至约5,000,000个细胞的密度将所述肝实质细胞和/或另外的细胞接种至肝脏组织模型中。
16.根据前述任一权利要求所述的方法，进一步包括将另外的细胞加入所述肝脏组织模型。
17.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，监测所述感染过程约2小时至约27天的时间段。
18.根据权利要求9至18中任一项所述的方法，其中，在所述活性剂以前的约1秒至约27天递送所述感染剂；或
其中，在所述活性剂以后的1秒至约27天递送所述感染剂。
19.根据前述任一权利要求所述的方法，进一步包括递送另外的感染剂，其中所述另外的感染剂是与第一感染剂不同的物种、菌株或生物体，或所述感染剂的突变体。
20.根据前述任一权利要求所述的方法，进一步包括在所述肝脏组织模型中诱导一种或多种细胞的细胞修饰，其中所述细胞修饰的诱导是在所述感染剂递送以前、并行、同时或以后。
21.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述感染过程产生所述感染剂的后代；以及可选地，其中所述后代被收获和/或再循环以被递送回所述肝脏组织模型。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，减弱所述后代。
23.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述感染剂能够感染所述肝脏的细胞，如肝实质细胞。
24.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述感染剂是肝炎病毒；以及可选地肝炎B病毒。
25.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述感染剂是病毒并且其中所述病毒包含：
其中除了病毒蛋白或通过替代病毒蛋白，在所述病毒颗粒中整合报告蛋白/标记蛋白的修饰；和/或
其中除了病毒遗传密码或通过替代病毒遗传密码，在病毒核酸内编码报告蛋白/标记蛋白的修饰。
26.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述感染剂来源自来自感染有所述感染剂的患者的人血液产品；或来源自感染有所述感染剂的转基因动物血液产品。
27.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，监测所述感染过程包括确定包括以下的组中的任一项：附着/吸附；膜融合；胞吞；渗透；解组装；核局部化；复制如病毒核酸复制和/或病毒蛋白表达；感染剂生长；孢囊形成；感染剂适应；感染剂形态构成；细胞防御的抑制；脱落；芽殖；凋亡；胞吐；病毒潜伏；细胞表面修饰/呈递；细胞应答；细胞信号传导；细胞调节；抗病毒应答；和细胞衰老或细胞死亡；或它们的组合；和/或其中监测所述感染过程包括所述细胞和/或细胞培养基的分析。
28.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述生物反应器包括生物反应器孔，所述生物反应器孔包括设置在其中的所述支架。
29.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述生物反应器包括流体连接于所述生物反应器孔的流体储存器。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，通过流体通道连接所述生物反应器孔和流体储存器，从而允许细胞培养基的再循环。
31.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，在可灌注膜上支撑所述支架。
32.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，使细胞培养基流动通过/灌注通过所述支架。
33.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述肝脏组织模型是3维肝脏组织模型，其中在空间中沿着3个维度排列细胞。
34.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述支架提供具有微通道的毛细结构。
35.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，以阵列提供两个或更多生物反应器。
36.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述肝脏组织模型能够将所述肝实质细胞的分化维持至少4天。
37.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，所述肝实质细胞维持NTCP和/或另一病毒受体在细胞表面上；以及可选地，其中NTCP受体和/或另一病毒受体是在所述肝实质细胞的微管表面上。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述肝实质细胞将NTCP受体维持在适合于病毒感染的极性至少4天。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的方法，其中，将所述肝实质细胞维持在相对于所述支架的所述微通道生理上正确的极性。
40.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，在所述支架中维持所述肝实质细胞处于生理有关的氧梯度。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中，通过维持约0.2μl/s至约37μ1/s/生物反应器孔的介质的流动速率，在所述支架中维持所述肝实质细胞处于生理有关的氧梯度；和/或
根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中，通过维持约0.04μ1/分钟至约0.88μ1/分钟/微通道的介质的流动速率，在所述支架中维持所述肝实质细胞处于生理有关的氧梯度。
42.根据前述任一权利要求所述的方法，进一步包括在所述肝脏组织模型中诱导免疫应答。
43.根据前述任一权利要求所述的方法，包括
-在约37℃下通过使介质流动通过所述支架至少约12小时，引发所述生物反应器中的所述支架；
-将所述肝实质细胞接种至所述生物反应器中的所述支架上以形成肝脏组织模型，其中将所述肝实质细胞悬浮在接种介质中，并在约37℃下以约1μl/s使所述接种介质流动通过所述支架约24小时；
-在约24小时时，将所述介质改变为细胞培养基，并在约37℃下以1μl/秒的流动速率使所述细胞培养基流动通过所述支架以维持所述肝脏组织模型的细胞培养；
-将所述感染剂递送到所述肝脏组织模型；
在递送所述感染剂以后的4小时时，通过用细胞培养基进行介质改变洗涤所述肝实质细胞；以及
-监测所述感染过程。
44.一种用于识别用于治疗或预防肝脏感染的潜在治疗性或预防性候选药物的筛选方法，所述方法包括：
-提供肝脏组织模型，其中所述肝脏组织模型包括粘附于生物反应器中的支架的肝实质细胞；
-将感染剂递送到所述肝脏组织模型；或提供预感染有感染剂的所述肝脏组织模型；
-将活性剂递送到所述肝脏组织模型；以及
-监测病毒感染过程。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，提供肝脏组织模型包括将细胞接种到生物反应器中的支架上。
46.一种生产感染剂的方法，所述方法包括：
-用感染剂感染肝脏组织模型；
-温育感染的肝脏组织模型以产生所述感染剂的后代；以及
-收获所述后代。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述感染剂是病毒、或编码病毒的核酸；以及可选地，其中所述病毒是肝炎病毒或修饰的肝炎病毒。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述修饰的肝炎病毒被减弱以致它能够在肝实质细胞中复制以形成病毒后代，其中所述病毒后代被减弱。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中，修饰所述感染剂以致它可以在肝实质细胞中复制以形成后代，其中所述后代被减弱。
50.一种通过根据前述任一权利要求所述的方法生产的感染剂。
51.一种肝脏的感染剂感染模型，用于研究能够感染所述肝脏的感染剂的感染过程，所述模型包括：
-肝脏组织模型，其中所述肝脏组织模型包括粘附于生物反应器中的支架的肝实质细胞；并且
其中所述肝脏组织模型感染有所述感染剂。
52.一种用于识别用于感染剂感染的新型生物标记物的方法，包括使用根据权利要求1至62中任一项所述的方法，或使用根据权利要求64所述的感染剂感染模型，其中通过监测所述感染过程和识别响应于所述感染的分子的存在、不存在、增加或减少确定所述生物标记物。
53.一种用于研究体外肝脏组织的感染的方法；或一种用于识别用于肝脏感染的治疗或预防的潜在治疗性或预防性候选药物的筛选方法；或一种生产感染剂的方法；或用于研究能够感染肝脏的病毒的感染过程的肝脏的感染剂感染模型，基本上如在本文中描述的；以及可选地参照附图。
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