CN105510229A - 一种超分辨虚拟结构光照明成像装置及其成像方法 - Google Patents

Abstract

一种超分辨虚拟结构光照明成像装置及其成像方法，它涉及一种成像装置及其成像方法。本发明为了解决现有技术中的显微成像技术只能测量较薄的生物样品，成像系统的横向分辨力较差的问题。本发明包括LED光源，沿LED光源光线传播方向依次放置准直扩束器、扫描系统、分光棱镜、1/4波片、照明物镜、样品、收集透镜和CCD探测器。本发明通过照明光场对样品物函数进行调制，使其高频信息移向低频段，改变照明光场方向可以对物函数进行不同方向的调制，改变每个照明方向通过照明光场相位，区分探测频谱中的高低频。本发明不仅可以提高扫描显微系统的空间截止频率，拓宽空间频域带宽，可适用于工业形貌及厚生物样品成像的测量领域。

Description

一种超分辨虚拟结构光照明成像装置及其成像方法

技术领域

本发明涉及一种成像装置及其成像方法，具体涉一种超分辨虚拟结构光照明成像装置及其成像方法，属于光学紧密测量技术领域。

背景技术

光学显微术是一种历史悠久且十分重要的无破坏性技术，被广泛应用于生物和材料科学等领域。结构光照明技术(StructuredIlluminationMicroscopy,SIM)由美国科学家Gustafsson于2000年提出，其原理类似于莫尔条纹原理，通过调制宽场显微镜的照明函数，使得整个光学系统的光强传递函数(OTF)得到平移与叠加，从而使得系统频域带宽增加，截止频率提高。通常采用一个正弦光栅改变宽场显微镜的照明强度分布，照明光场在光栅方向上被调制，经过旋转光栅实现整个横向的调制。相比于光瞳滤波技术，结构光技术注重考虑光学系统频域的变化与影响，只要满足光栅周期等于宽场显微镜空间截止频率，结构光照明技术即可使系统OTF带宽变为原来的2倍，即分辨率提高为原来的2倍。

但是，通常宽场结构光照明显微镜只能测量比较薄的生物样品，当测量较厚的样品时，随入射距离的增加，平行光入射的衍射光受散射效应影响明显。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的显微成像技术只能测量较薄的生物样品，并且成像系统的横向分辨力较差的问题。

本发明的技术方案是：一种超分辨虚拟结构光照明成像装置，包括LED光源，沿LED光源光线传播方向依次放置准直扩束器、扫描系统、分光棱镜、1/4波片、照明物镜、样品、收集透镜和CCD探测器。

所述的LED光源为非相干光源，对样品的照明为非相干照明，整个成像过程均为非相干成像。

所述扫描系统包括扫描振镜，扫描振镜改变光束偏转角。

基于所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置的成像方法，通过探测面探测灵敏度系数进行调制，得到等效扫描点瞬时光强信号I(x_s,y_s；t)，最后对时间积分，得到在样品表面照明光场的强度分布I(x_s,y_s)。

具体包括以下步骤：

步骤一、对探测面探测灵敏度系数进行调制，得到等效扫描照明光场；

步骤二、对照明光透过样品并经过物镜再次成像得到探测面上的光强分布，对所述探测面上的光强分布在扫描时间上进行积分，得到样品表面照明光的强度分布；

步骤三、对样品表面照明光光强分布进行超分辨图像重构处理，得到清晰图像。

所述步骤一具体包括：

通过对探测面灵敏度系数进行调试，得到照明光场的不同扫描位置的光强最大值，进而得到扫描后的照明光场光强分布；

对扫描后的照明光场光强分布进行时间积分得到等效照明光场。

所述步骤二包括：

得到照明光透过样品后光强分布，进而得到经过物镜再次成像到探测面上的光强分布；

对探测面上的光强分布在扫描时间上进行积分，得到积分图像的光强分布；

对积分图像的光强分布进行傅里叶变换得到积分图像的图像频谱。

步骤三所述超分辨图像重构处理包括对样品表面照明光的光强分布引入不同的调制相位并进行解调。

所述对样品表面照明光的光强分布引入不同的调制相位并进行解调的过程包括：

根据引入不同的调制相位得到照明光场的不同扫描位置的光强最大值，进而得到引入相位后的积分图像的光强分布；

对引入相位后的积分图像的光强分布进行傅里变换，得到带有相位的积分图像频谱；

通过构造相位矩阵、像频谱矩阵和物频谱矩阵，得到物频谱的三部分的频率信息。本发明与现有技术相比具有以下效果：在探测端改变CCD探测灵敏度系数，通过时域累计得到光强按正弦分布的虚拟照明光场。照明光场对样品物函数进行调制，使其高频信息移向低频段，进而能被探测光路探测并参与成像。改变照明光场方向可以对物函数进行不同方向的调制。每个照明方向通过改变照明光场相位，对探测频谱中的高低频成分加以区分，最后进行图像重构得到超分辨图像。

本发明探测面灵敏度系数与样品被扫描点位置成正弦关系的，等效于在样品表面进行光强按正弦分布的结构照明，可以把样品结构中的高频分量向低频方向平移并且与低频成分叠加，系统探测到普通显微成像系统中无法探测到的高频信息，从而显著改善系统横向分辨力。

本发明创造性的将虚拟结构光照明技术引入到扫描显微系统中，利用扫描显微镜采用聚焦照明的特性，能量集中，受厚样品散射影响小，因此扫描结构光照明技术不仅可以提高扫描显微系统的空间截止频率，拓宽空间频域带宽，从而显著改善系统横向分辨力，增加了光学成像的穿透深度，而且满足测量厚的生物样品的要求，可适用于工业形貌及厚生物样品成像的测量领域。

附图说明

图1是本发明超分辨虚拟结构光照明成像装置结构示意图；

图2是NA＝0.1，λ＝660nm时普通扫描显微成像系统的OTF归一化仿真图；

图3是NA＝0.1，λ＝660nm时虚拟结构光照明显微成像系统的OTF归一化仿真图；

图4是x方向上间隔为3.3um的条纹样品仿真图；

图5是样品的频谱分布仿真图；

图6是条纹样品在NA＝0.1，λ＝660nm的普通扫描显微系统中所探测到的频谱仿真图；

图7是条纹样品在NA＝0.1，λ＝660nm的普通扫描显微系统中所成像光强归一化仿真图；

图8是条纹样品在NA＝0.1，λ＝660nm，照明光场光强分布为的虚拟结构光照明系统中所探测到的频谱仿真图；

图9是图7中数据经过图像重构后的到的超分辨图像的频谱；

图10是条纹样品在NA＝0.1，λ＝660nm，照明光场光强分布为的虚拟结构光照明系统中经过图像重构后所得超分辨图像的光强归一化仿真图；

图11是条纹样品与其在普通扫描显微系统和虚拟结构光照明系统中所成像在x方向光强归一化仿真图。

图中：1、LED光源，2、准直扩束器，3、扫描系统，4、CCD探测器，5、收集透镜，6、分光棱镜，7、1/4波片，8、照明物镜，9样品。

具体实施方式

结合附图说明本发明的具体实施方式，本发明的一种超分辨虚拟结构光照明成像装置，包括LED光源1，其特征在于：沿LED光源1光线传播方向依次放置准直扩束器2、扫描系统3、分光棱镜4、1/4波片5、照明物镜6、样品7、收集透镜8和CCD探测器9。

所述的LED光源为非相干光源，对样品的照明为非相干照明，整个成像过程均为非相干成像。

所述扫描系统3包括扫描振镜，扫描振镜改变光束偏转角。

基于所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置的成像方法，通过探测面探测灵敏度系数进行调制，得到等效扫描点瞬时光强信号I(x_s,y_s；t)，最后对时间积分，得到在样品表面照明光场的强度分布I(x_s,y_s)。

具体包括以下步骤：

步骤一、非相干照明扫描显微系统中，省略放大倍数以及常数系数，照明光强点扩展函数h_il(r)与探测光强点扩展函数h_de(r)相同，表示如式(1)：

$h_{il}\left(r\right)=h_{de}\left(r\right)={\left(\frac{J_1(2\mathrm{\π}NAr/\mathrm{\λ})}{2\mathrm{\π}NAr/\mathrm{\λ}}\right)}^2---\left(1\right);$

式中，J₁(x)表示第一类一阶贝塞尔函数；NA为数值孔径；r为径向坐标；λ为光源波长。

假设t既表示扫描时间又表示扫描位置,那么在普通扫描显微系统中照明光场的不同扫描位置的光强最大值，如式(2)所示：

$I_{il}^{\max }\left(t\right)=1---\left(2\right);$

进而得到扫描后的照明光场光强分布，如式(3)所示：

$I_{il}(r,t)=I_{il}^{\max }\left(t\right)h_{il}(r-t)---\left(3\right);$

对扫描后的照明光场光强分布进行时间积分得到等效扫描照明光场，如式(4)：

$I_{eff}\left(r\right)=\∫I_{il}^{\max }\left(t\right)h_{il}(r-t)dt=I_{il}^{\max }\left(r\right)\⊗h_{il}\left(r\right)---\left(4\right).$

步骤二、计算照明光透过样品后光强分布，如式(5)：

$I_{il-o}(r,t)=I_{il}^{\max }\left(t\right)h_{il}(r-t)o\left(r\right)---\left(5\right);$

进而得到经过物镜再次成像到探测面上的光强分布，如式(6)：

$I(x,t)=\∫I_{il}^{\max }\left(t\right)h_{il}(r-t)o\left(r\right)h_{de}(x-r)dr---\left(6\right);$

对探测面上的光强分布在扫描时间上进行积分，得到积分图像的光强分布，如式(7)；

$p\left(x\right)=\{\[I_{il}^{\max }\left(x\right)\⊗h_{il}\left(x\right)\]o\left(x\right)\}\⊗h_{de}\left(x\right)---\left(7\right);$

对积分图像的光强分布进行傅里叶变换得到积分图像的图像频谱，如式(8)：

$\tilde{p}\left(k\right)=\mathrm{\π}{\tilde{h}}_{il}\left(0\right)\tilde{o}\left(k\right){\tilde{h}}_{de}\left(k\right)---\left(8\right);$

步骤三、对样品表面照明光光强分布进行超分辨图像重构处理，得到清晰图像。

在本实施例中，改变探测面灵敏度系数，等效于改变照明光场的不同扫描位置的光强最大值，如式(9)：

$I_{il}^{\max }\left(t\right)=\frac{1}{2}(1+cos({\mathrm{\ω}}_{t}t\left)\right)---\left(9\right);$

最终得到积分图像，其光强分布如式(10)：

$p\left(x\right)=\{\[I_{il}^{\max }\left(x\right)\⊗h_{il}\left(x\right)\]o\left(x\right)\}\⊗h_{de}\left(x\right)---\left(10\right);$

对其进行傅里叶变换，得到积分图像频谱，如式(11)：

$\tilde{p}\left(k\right)=\{\mathrm{\π}\[{\tilde{h}}_{il}\left(0\right)\tilde{o}\left(k\right)+\frac{1}{2}{\tilde{h}}_{il}\left({\mathrm{\ω}}_t\right)\tilde{o}(k-{\mathrm{\ω}}_t)+\frac{1}{2}{\tilde{h}}_{il}(-{\mathrm{\ω}}_t)\tilde{o}(k+{\mathrm{\ω}}_t)\]\}{\tilde{h}}_{de}\left(k\right)---\left(11\right);$

可以看出，虚拟结构光照明超分辨方法成功地把样品在普通显微系统中无法探测到的高频信息移到了显微系统的OTF通带内，使其能被探测。

由于结构照明方法所得的探测结果均含有基频与高频信息的相位混叠，本实施例中通过引入不同的调制相位进行解调，即超分辨图像重构。

在照明光强调制函数中引入相位，照明光场的不同扫描位置的光强最大值变如式(12)：

那么，积分图像光强分布变如式(13)：

对其进行傅里叶变换，得到带有相位的积分图像频谱如式(14)：

构造一个相位矩阵Ψ，像频谱矩阵P，假设物频谱矩阵为O；

令

那么可以得到

由此可以得到物频谱的三部分频率信息。

图2是在物镜数值孔径NA＝0.1照明光波长λ＝660nm时扫描显微系统OTF即的归一化仿真图。

图4和图5分别是x方向上间隔为3.3um的被测样品及其频谱分布仿真图。

图6是在普通扫描显微系统中，系统探测到样品的频谱信息对应所成像p(x)如图7所示。

图3是在物镜数值孔径NA＝0.1照明光波长λ＝660nm时虚拟结构光照明显微系统等效OTF即的归一化仿真图。

对比图2和图3可以看出，虚拟结构光照明显微成像系统的OTF空间频域带宽明显大于普通扫描显微系统OTF。

图8是虚拟结构光照明系统探测结果的频谱信息，图9是解调后积分图像的频谱信息，图10是经过图像恢复后的积分图像。

图11是样品以及其在普通扫描显微系统中所成像和虚拟结构光照明系统中经过图像重构得到的积分图像，在x方向光强分布的归一化仿真图。

通过对比图6和图9可看出本实施例能探测到的最高样品频率明显高于普通扫描显微系统。

通过对比图7和图10，并结合图11，可看出虚拟结构光照明超分辨方法得到的积分图像分辨力明显高于普通扫描显微系统，本实施例实现了扫描显微系统的二维超分辨，扫描显微系统的等效OTF带宽得到拓展。

Claims (8)

1.一种超分辨虚拟结构光照明成像装置，包括LED光源(1)，其特征在于：沿LED光源(1)光线传播方向依次放置准直扩束器(2)、扫描系统(3)、分光棱镜(4)、1/4波片(5)、照明物镜(6)、样品(7)、收集透镜(8)和CCD探测器(9)。

2.根据权利要求1所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置，其特征在于：所述的LED光源(1)为非相干光源，对样品的照明为非相干照明，整个成像过程均为非相干成像。

3.根据权利要求1所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置，其特征在于：所述扫描系统(3)包括扫描振镜，扫描振镜改变光束偏转角。

4.基于权利要求1所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置的成像方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、对探测面探测灵敏度系数进行调制，得到等效扫描照明光场；

步骤二、对照明光透过样品并经过物镜再次成像得到探测面上的光强分布，对所述探测面上的光强分布在扫描时间上进行积分，得到样品表面照明光的强度分布；

步骤三、对样品表面照明光光强分布进行超分辨图像重构处理，得到清晰图像。

5.根据权利要求4所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置的成像方法，其特征在于：所述步骤一具体包括：

通过对探测面灵敏度系数进行调试，得到照明光场的不同扫描位置的光强最大值，进而得到扫描后的照明光场光强分布；

对扫描后的照明光场光强分布进行时间积分得到等效照明光场。

6.根据权利要求4所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置的成像方法，其特征在于：所述步骤二包括：

得到照明光透过样品后光强分布，进而得到经过物镜再次成像到探测面上的光强分布；

对探测面上的光强分布在扫描时间上进行积分，得到积分图像的光强分布；

对积分图像的光强分布进行傅里叶变换得到积分图像的图像频谱。

7.根据权利要求4所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置的成像方法，其特征在于：步骤三所述超分辨图像重构处理包括对样品表面照明光的光强分布引入不同的调制相位并进行解调。

8.根据权利要求7所述一种超分辨虚拟结构光照明成像装置的成像方法，其特征在于：所述对样品表面照明光的光强分布引入不同的调制相位并进行解调的过程包括：

根据引入不同的调制相位得到照明光场的不同扫描位置的光强最大值，进而得到引入相位后的积分图像的光强分布；

对引入相位后的积分图像的光强分布进行傅里变换，得到带有相位的积分图像频谱；

通过构造相位矩阵、像频谱矩阵和物频谱矩阵，得到物频谱的三部分的频率信息。