CN105504054A - 禽结核高免血清及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种禽结核高免血清及其制备方法，制备步骤包括：直接采用灭活的禽结核杆菌作为免疫抗原，采用耳缘静脉注射法进行免疫，每3天免疫一次，共免疫七次，最后一次免疫完毕后7天采血并收集血清。本发明只用灭活的菌体通过静脉注射免疫动物即可制备出高效价血清，无需乳化操作，整个制备高免血清过程仅需26天，试管凝集试验测抗体效价达1/128，与常规高免血清制备方法相比，本发明所述方法免疫抗原制备的条件要求低，免疫程序操作更简单，所需时间更短，且能获得高效价抗体水平。

Description

禽结核高免血清及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽结核高免血清及其制备方法。
背景技术
禽结核病(Aviantuberculosis)是由禽结核分支杆菌引起的一种慢性接触性传染病，主要经呼吸道和消化道感染，感染家禽主要表现为被毛粗乱，产蛋量下降，身体消瘦，胸骨突出薄如刀片，甚至最终导致死亡，组织器官形成肉芽肿和大小不一的钙化结节。
禽结核分支杆菌细胞壁中含有大量脂类，对外界因素的抵抗力强。分离培养禽结核分支杆菌需要特殊的培养基，在含有全蛋液或蛋黄液的培养基上，37.5℃-40℃培养10天至21天，能形成小的、轻微凸起、独立分散的灰白色菌落。随着培养时间的增加菌落从灰白色变成淡黄褐色至深黄褐色。在液体培养中，细菌常沉着在试管底部和漂浮在培养液表面。
常规的高免血清制备方法一般是将灭活后的菌液与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂按一定比例混合、乳化后制备成免疫抗原对动物进行免疫。这种方法成本较高，乳化操作较复杂，所需免疫时间较长。因此，有必要对现有方法进行改进。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种禽结核高免血清及其制备方法，该方法无需使用佐剂，无需乳化操作，且获得的高免血清抗体效价达到1/128，优于常规高免血清制备方法获得的高免血清。
本发明采取的技术方案如下：
1、禽结核高免血清，通过以下步骤制备：直接采用灭活的禽结核杆菌作为免疫抗原，采用耳缘静脉注射法进行免疫，每3天免疫一次，共免疫七次，最后一次免疫完毕后7天采血并收集血清。
优选的，所述高免血清的抗体效价为1/128。
优选的，所述免疫抗原的制备过程为：将禽结核杆菌收集后用灭菌的PBS缓冲液清洗两次，加入质量分数0.3％的甲醛溶液37℃放置24h后再室温放置24h灭活，然后用灭菌的PBS缓冲液将甲醛洗净，最后用灭菌的PBS缓冲液配制成OD600为0.5的悬浮液即可。
优选的，所述免疫抗原的制备过程具体如下：
(1)将禽结核杆菌装入50ml离心管中，8000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
(2)加入灭菌后的PBS缓冲液，9000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
(3)加入灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
(4)加入质量分数0.3％的甲醛溶液，37℃培养箱放置24h，再室温下放置24h；10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
(5)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液，重复操作至甲醛被洗净；
(6)加入灭菌后的PBS缓冲液制成OD600为0.5的悬浮液即可。
优选的，免疫所用动物为2-3月龄健康雄性新西兰兔。
优选的，所述免疫的程序具体为：
2、禽结核高免血清的制备方法，包括如下步骤：
A、免疫抗原的制备
a)将禽结核杆菌装入50ml离心管中，8000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
b)加入灭菌后的PBS缓冲液，9000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
c)加入灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
d)加入质量分数0.3％的甲醛溶液，37℃培养箱放置24h，再室温下放置24h；10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
e)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液，重复操作至甲醛被洗净；
f)加入灭菌后的PBS缓冲液制成OD600为0.5的悬浮液即可；
B、动物免疫
选取2-3月龄健康雄性新西兰兔，采用耳缘静脉注射法进行免疫，免疫程序具体为：
C、采血及血清收集：
最后一次免疫结束7天后采取颈动脉放血，血液37℃培养箱放置1h后，再4℃冰箱放置12h，离心收集血清，血清分装后置于-80℃保存。
本发明的有益效果在于：本发明直接采用灭活的禽结核杆菌作为免疫抗原，无需加入佐剂，也无需乳化操作；采用耳缘静脉注射法进行免疫，每3天免疫一次，共免疫七次，最后一次免疫完毕后7天采血并收集血清，整个制备高免血清过程仅需26天；试管凝集试验测抗体效价达1/128；与常规高免血清制备方法相比，本发明所述方法免疫抗原制备的条件要求低，免疫程序操作更简单，所需时间更短(缩短时长31天)，且能获得高效价抗体水平。
目前，我国诊断禽结核病的主要方法有临床病理诊断，结核菌素试验和快速全血平板凝集试验等，这些诊断方法均需要使用高效价的抗血清。本发明采用的高免血清制备方法，即只用灭活的菌体通过静脉注射免疫动物，无需乳化操作即可制备出高效价血清，具有成本低，操作简单，效果好的优点。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
本发明所述禽结核高免血清的制备方法如下：
A、免疫抗原的制备
a)将30ml液体培养基增菌培养的禽结核杆菌分装入50ml离心管中，8000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
b)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，9000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
c)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
d)加入15ml质量分数0.3％的甲醛溶液，37℃培养箱中放置24h，再室温放置24h；10000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
e)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之，该步骤重复至少三次，直至甲醛被洗净；
f)加入适量灭菌后的PBS缓冲液制成悬浮液，悬浮液OD600约为0.5；取10ml悬浮液分装入瓶中作为免疫抗原，放置4℃备用；
B、动物免疫
选取2-3月龄健康雄性新西兰兔，采用耳缘静脉注射法进行免疫，免疫程序具体按表1进行免疫；
表1制备兔抗禽结核高免血清的免疫程序
C、采血及血清收集
最后一次免疫结束7天后采取颈动脉放血，采血前应禁食12h，保证饮水充足，血液37℃培养箱放置1h后，再放置4℃冰箱过夜，第二天离心收集血清，血清分装后置于-80℃保存。
对比实施例
禽结核高免血清的常规制备方法如下：
一、免疫抗原的制备
(1)将30ml液体培养基增菌培养的禽结核杆菌分装入50ml离心管中，8000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
(2)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，9000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
(3)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
(4)加入15ml质量分数0.3％的甲醛溶液，37℃培养箱中放置24h，再室温下放置24h；
(5)10000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
(6)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之，该步骤重复至少三次，直至甲醛被洗净；
(7)加入适量灭菌后的PBS缓冲液制成悬浮液，悬浮液OD600约为0.5；
(8)取7.5ml悬浮液加入7.5ml弗氏不完全佐剂，用匀浆机进行乳化；乳化完成后，取一滴乳化过的液滴滴在冰水里，看此液滴在一分钟内是否分散，如果不分散则表明乳化完全，否则继续乳化；乳化完全后作为免疫抗原，置于4℃备用；
二、动物免疫
选取2-3月龄健康雄性新西兰兔，采用多点皮下注射进行免疫，具体免疫程序按表2进行免疫；
表2制备兔抗禽结核高免血清的免疫程序
C、采血及血清收集
最后一次免疫后14天采血，采血前应禁食12h，保证饮水充足，血液37℃培养箱放置1h后，再放置4℃冰箱过夜，第二天离心收集血清，血清分装后置于-80℃保存。
采用试管凝集试验测定实施例和对比实施例获得的高免血清抗体效价，测定方法见表3，其中阴性对照1为不加血清，仅有抗原；阴性对照2为不加抗原，仅有血清，结果判定时对照1和对照2均无凝集现象产生。
表3试管凝集试验测定抗体效价
试管放置于37℃培养箱中孵育过夜，抗体效价测定结果为：实施例获得的高免血清抗体检测效价达到1/128，对比实施例获得的高免血清抗体检测效价达到1/16。
由两个实施例对比可知，实施例1所述方法制备免疫抗原时不需要佐剂，也不需要乳化操作，整个制备高免血清的过程只需26天(常规方法需要57天)，获得的高免血清抗体效价达1/128。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.禽结核高免血清，其特征在于，通过以下步骤制备：直接采用灭活的禽结核杆菌作为免疫抗原，采用耳缘静脉注射法进行免疫，每3天免疫一次，共免疫七次，最后一次免疫完毕后7天采血并收集血清。
2.根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，所述高免血清的抗体效价为1/128。
3.根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，所述免疫抗原的制备过程为：将禽结核杆菌收集后用灭菌的PBS缓冲液清洗两次，加入质量分数0.3％的甲醛溶液37℃放置24h后再室温放置24h灭活，然后用灭菌的PBS缓冲液将甲醛洗净，最后用灭菌的PBS缓冲液配制成OD600为0.5的悬浮液即可。
4.根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，所述免疫抗原的制备过程具体如下：
(1)将禽结核杆菌装入50ml离心管中，8000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
(2)加入灭菌后的PBS缓冲液，9000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
(3)加入灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
(4)加入质量分数0.3％的甲醛溶液，37℃培养箱放置24h，再室温下放置24h；10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
(5)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液，重复操作至甲醛被洗净；
(6)加入灭菌后的PBS缓冲液制成OD600为0.5的悬浮液即可。
5.根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，免疫所用动物为2-3月龄健康雄性新西兰兔。
6.根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，所述免疫的程序具体为：
7.权利要求1～6任一项所述禽结核高免血清的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、免疫抗原的制备
a)将禽结核杆菌装入50ml离心管中，8000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
b)加入灭菌后的PBS缓冲液，9000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
c)加入灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
d)加入质量分数0.3％的甲醛溶液，37℃培养箱放置24h，再室温下放置24h；10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液；
e)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，10000g离心15min，巴氏吸管吸弃上清液，重复操作至甲醛被洗净；
f)加入灭菌后的PBS缓冲液制成OD600为0.5的悬浮液即可；
B、动物免疫
选取2-3月龄健康雄性新西兰兔，采用耳缘静脉注射法进行免疫，免疫程序具体为：
C、采血及血清收集
最后一次免疫结束7天后采取颈动脉放血，血液37℃培养箱放置1h后，再4℃冰箱放置12h，离心收集血清，血清分装后置于-80℃保存。
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