CN105497914B - 肿瘤治疗的靶目标 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肿瘤治疗的靶目标，靶目标的生物分子选自多聚核苷酸分子和肽分子，这些目标包括根据pUC19DNA序列中可映射到人类基因组的DNA序列的短小片断相应的多核苷酸序列、蛋白、多肽分子或基因组。这些相应的编码分子可能成为提高癌症的治疗效果的靶目标，潜在的药物包括但不限于siRNA，小分子抑制剂，多肽抑制剂，反义RNA，反义寡核苷酸，抗体，抗体片段，蛋白质，DNA的载体显性负和干扰素。本发明所述的一种肿瘤治疗的靶目标能用于开发新的癌症治疗药物，本发明提高了化疗药物的作用，能协同加强抗癌药物的疗效。并大大减少了化疗药物毒副作用，为更有效率和低或无细胞毒性治疗癌症提出了一个新的发展途径。

Description

肿瘤治疗的靶目标

本发明是分案申请。本申请是申请日为2008-07-02，申请号为200880023062.7，发明创造名称为肿瘤治疗的配方，方法和靶目标的分案申请。

政府利益:

本研究部分始于NIH。美国政府可能在本申请的发明中有某些权利。

技术领域:

本发明涉及的肿瘤和化疗等领域。具体来说，该发明提供了新的医学应用，药物成分和药物研发的靶目标，已达到更有效，无毒的癌症治疗。

背景技术

到目前为止，化疗和放射治疗仍然是治疗癌症的主要方法。这些治疗是着眼于杀灭增殖的细胞，而不是癌细胞。所以这些治疗方法对增殖的骨髓细胞和粘膜细胞又严重的可以致命的副作用，，其副作用通常是致命的。尽管有关寻找协同作用以增加药物的疗效，降低药物剂量和替代疗法以减少副作用的研究在积极进行，目前仍然需要改进肿瘤的治疗方法以提高癌症的治疗效果，同时限制对正常细胞毒副作用。本发明提出联合应用非细胞毒性药物以得到协同和选择性导致肿瘤细胞死亡的治疗方法。

癌症的靶向治疗是新的一代的肿瘤治疗方法，其特点是针对特定癌症的分子信号通路的变化设计和选用药物，促使癌细胞死亡，但不影响正常细胞的存活。已经和正在花费大量的努力以寻找可作为癌攻击目标的的靶目标，和可攻击细胞内这些目标的治疗方法。然而，到目前为止，这个新一代的成功率是有限的。一个主要的挑战来自于细胞内的调节机制和途径的重叠性和复杂性。综合治疗是克服这些重叠的调控机制和途径的关键。

Nuclear factor-kappaB(NF-B)是一个Rel家族的转录因子。NF-B的活性功能涉及应激反应和多种细胞致病过程，如感染和炎症，氧化应激，受伤和程序性细胞死亡。异常的NF-B的功能活性与多种肿瘤及癌细胞相关，并涉及细胞增殖，细胞凋亡，血管生成，肿瘤侵袭和转移等多种肿瘤细胞的生物过程之中。NF-B的功能活性还与抗肿瘤细胞对化疗和放射疗法治疗的耐受性有关。(Kim HJ,Hawke N,and Baldwin AS,NF-B and IKK astherapeutic targets in cancer,Cell Death ad Differentiation,(2006)13:738-47；Karin M,Nuclear factor-B in cancer development and progression,(2006)Natur441:431-6)。人们试着通过抑制NF-B活性以增加癌细胞对化疗药物和放射治疗的敏感性以促进癌细胞死亡。(Kim HJ,Hawke N,and Baldwin AS,NF-B and IKK astherapeutic targets in cancer,Cell Death and Differentiation,(2006)13:738-47；Karin M,Nuclear factor-kB in cancer development and progression,(2006)Natur441:431-6；Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi,Nuclear Factor-BInhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs,NATURE REVIEWS CANCER(2005)5:297-309)。然而，这些努力的结果非常有限。

通常在正常细胞中，NF-B停留在细胞质中以非活性形式结合与Inhibitor B(IB)。外部刺激可通过信号过程由I B磷酸激酶(IKK)磷酸化I B，使之脱离NF-B从而活化NF-B，转移入核，调节细胞NF-B调节的基因的转录。已知有两个类似的但不同的IKK，分别作用于不同的信息传导途径，并活化不同的NF-B家族的成员。此外，还有其他的激活NF-B的替代途径，如蛋白激酶CK2(CK2)。在大多数肿瘤细胞中，NF-B处于持续激活。除了IKK经典途径，还有异常的可激活NF-B的替代途径。(Ming Yu,Jason Yeh,and Carter Van Waes ProteinKinase CK2 Mediates Inhibitor-Kappa B Kinase and Aberrant Nuclear Factor-κBActivation by Serum Factor(s)in Head and Neck Squamous Carcinoma Cells CancerResearch,2006July 1；66(13):6722–6731.and other forNFKB activation)。目前市场上已有几十个IKK抑制剂，有的正在用于抗炎疾病的临床实验过程之中。然而这些抑制剂对肿瘤的治疗并不那么有效。这些替代的NF-B活化途径至少是这些IKK抑制剂对肿瘤细胞无效的原因。(Chikashi Nakanishiand Masakazu Toi,Nuclear Factor-B Inhibitors AsSensitizers To Anticancer Drugs,NATURE REVIEWS CANCER(2005)5:抑制297-309)。

已知NF-B能够抑制细胞程序性死亡，包括凋亡和坏死，通过诱导抗凋亡基因的转录，干扰caspase的活性和抑制延长的c-Jun氨基末端激酶(JNK)的活性。(ChikashiNakanishi and Masakazu Toi,Nuclear Factor-B Inhibitors As Sensitizers ToAnticancer Drugs,NATURE REVIEWS CANCER(2005)5:297-309)。抑制NF-B和IKK导致肿瘤细胞死亡，生长抑制和/或增加癌细胞对化疗治疗的敏感性，(KimHJ,Hawke N,and BaldwinAS,NF-B and IKK as therapeutic targets in cancer,Cell Death andDifferentiation,(2006)13:738-47；Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi,NuclearFactor-B Inhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs,NATURE REVIEWS CANCER(2005)5:297-309)。Protesome抑制剂Bortezomib/Velcade(PS341)已被FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤等疾病。已有几十个IKK抑制剂用于抑制NF-B的活性。(Michael Karin,YumiYamamoto and Q.May Wang,The IKK NF-KAPPAB System:A Treasure Stove for DrugDevelopment,Nature Reviews|Drug Discovery 3:17-26,January,2004)。他们多数是针对炎症性疾病的治疗。有几个IKK抑制剂在血液恶性病显示效果。另一方面，目前可用于临床治疗实体瘤的IKK抑制剂缺失。有一些可抑制NF-B的抑制剂可在体外有部分抑制细胞存活和增生的功能，及少量的报告可在体内抑制肿瘤生长。(Hu MC,and Hung MC,Role ofIkappaB kinase in tumorigenesis,(2005)Future Oncol.1:67-78；Luo JL,Kamata H,and Karin M,IKK/NF-kappaB signaling:balancing life and death-a new approachto cancer therapy,(2005)J.Clin Invest 115:2625-32)。然而，这些成功是非常有限的。多数应用IKK抑制剂作为肿瘤治疗的的药物都不太成功，且与成功相距甚远。这可能是由于细胞调节机制的复杂性和从这些抑制剂的其他作用有关。确认关键的可诱导肿瘤细胞死亡的调节通路和联合抑制多个不同的调节部位是成功的关键。

肿瘤坏死因子TNF可诱导活化NF-B。然而，在一定条件下，TNF可诱导细胞死亡。最近的研究指出，NF-B和JNK之间的活性的平衡决定细胞生死的理论。根据这一理论，NF-B与JNK通过活性氧(ROS)相互调解。TNF诱导活化NF-B和JNK。活化的NF-B和JNK均导致细胞增殖。然而，活性氧诱导JNK长期持续的活化则会诱导细胞程序性死亡。相反，活化的NF-B抑制活性氧，由此抑制JNK长期持续的活化，导致细胞增殖。因此，已知NF-B的活性，同时诱导活性氧的生成以活化JNK可将平衡程序性印象细胞死亡-迄今为止，尚没有这样的治疗方法的报告。最重要的是，虽然这种关系的具体理论已经提出，尚无成功运用这一理论的示例。在此说明与之相关的发明的详情。

已观察到应用无磷酸酶活性的KA-IKK1+KA-IKK2联合抑制IKK1和IKK2的活性导致协同抑制NF-B的活性。但是，这种组合对提高化疗药物的疗效影响不大。进一步的研究表明，当使用WST-1试剂与IKK2抑制剂结合IKK1DNA载体转染的综合效应可导致大量的细胞死亡。而同一实验中未用DNA转染没有造成任何细胞死亡(图1，2)。在此，有三个治疗所需的重要成份：转染KA-IKK1，IKK抑制剂和WST–1联合应用。这一过程包括诱导活性氧和活化JNK(图5)并顺应了上述的理论。

进一步的鉴定表明，这种效果与转染的显性负KA-IKK1的DNA没有关系的。相反，是转染pUC19质粒DNA序列队此三项联合治疗起到了关键的作用(图3)。这种组合中转染pUC19质粒可部分由应用干扰素替代(INF)，作为初始治疗(图4)使用。pUC19质粒的DNA序列在这三种药物联合治疗方面发挥重要作用。根据相对人类基因组的BLAST，pUC19的DNA序列分析表明pUC19的DNA序列可以短片段匹配于一些人的mRNA序列和许多人的基因的侧翼地区。由此设计的siRNAs和针对其中一些相关的基因设计的siRNA可代替pUC19质粒的转染也可以用于这三种药物联合治疗导致肿瘤细胞死亡。

细胞的增殖WST-1试剂是一种科研试剂用于测量细胞的代谢作为活细胞的指征，用于测定村活的细胞数量的指标使用。细胞的增殖WST-1是由WST-1，四唑盐和1-mPMS，一个电子耦合试剂(IEA)组成。WST-1是一种不能透过细胞质膜的水溶性四唑盐可以被还原为水溶性的formazan。WST-1被跨膜电子转运系统的载体，1-methoxyPMS(mPMS)还原，在这种情况下，NADH是细胞的还原剂(Berridge,Herst,and Tan,Biotechnology Annual ReviewVol.2:127-52)。这一过程涉及NADH-Oxidase(NOX)并产生活性氧(ROS)。

活性氧是潜在有害的，正常细胞代谢产物，直接影响细胞功能。活性氧生成存在于所有需氧生物，它同时又是信号转导通路必不可少的一部分对调节细胞生长和氧化－还原状态中起重要作用。然而，过剩的高活性氧代谢的产生可以引起致命的连锁反应，涉及氧化和破坏，是影响细胞结构的完整性和生存的关键。事实上，许多抗肿瘤药物，如长春，顺铂，丝裂霉素C，阿霉素，喜树碱，inostamycin，neocarzinostatin(vinblastine,cisplatin,mitomycin C,doxorubicin,camptothecin,inostamycin,neocarzinostatin)和其他许多出抗肿瘤活性都依赖通过ROS导至细胞凋亡的作用，这表明活性氧可作为潜在的抗肿瘤应用的一项基本的原则。用“氧化疗法”作为一个独特的抗癌方法，通过诱导产生的活性氧直接作为癌症治疗实体肿瘤细胞已被提出，但是尚无成功案例。这是由于生成的活性氧缺乏对肿瘤选择性从而造成了严重的副作用(Fang,Nakamura,and Iyer,J Drug TargetVol15:475-86)。

大多数癌细胞的线粒体是有缺陷的，因此依赖于细胞质中的酵解(glycolysis)为其能源来源，这使得NADH积累在细胞质中，使这些癌细胞更多的依赖跨质膜电子运输((Herst et al.Biochim Biophys Acta 1656:79-87；Tan and Berridge Redox Rep 9:302-06)。这种癌症细胞的特殊功能可使之成为选择性治疗肿瘤细胞的治疗方法。

在WST-1和mPMS，各为一类化和物，可以用于这一治疗方法。在WST-1和mPMS的浓度以及两者之间的比例，可以调整和优化，以维持其协同诱导细胞死亡，同时避免引发活性氧的直接毒性。这一发现结合治疗方法提供了一个可诱导低水平的活性氧生成的方法，一个诱导ROS作为信号传输途径和细胞信使的方法。诱导细胞死亡是联合作用的结果。WST–1作为一个试剂并无此作用。此发明找到了一种可诱导产生作为信息传导的ROS同时避免产生大量的具有细胞毒作用的活性氧。

芹菜素(Apigenin)是天然植物黄酮(4',5,7,-trihydroxyflavone)，常见于水果和蔬菜，其中包括苹果，芹菜，香菜，洋葱，柑桔，茶叶，甘菊，小麦苗和一些调味料。芹菜素已被证明具有显着的抗炎，抗氧化，抗致癌特性，目前正在积极研究。芹菜素在细胞和分子水平的研究发现，芹菜素干扰细胞内广泛的关键性的分子，信息和细胞调节途径，包括消耗的HER2蛋白质和制止Her2/Her3-phosphatidylinositide 3激酶(PI3/AKT)的信息调节途径(Way and Lin Future Oncol 1:841-49),抑制HIF,PKC,CDK,VEGF，NF-B,CK2,AKT,MAPK,AR和ER的信息传导和调节途径，活化野生型的P53蛋白，调节细胞周期失控的的检查点诱导细胞凋亡((Induction of caspase-dependent,p53-mediated apoptosis by apigenin inhuman neuroblastoma--Torkin et al.4(1):1--..；Apigenin Inhibits Expression ofVascular Endothelial Growth Factor and Angiogenesis in Human Lung CancerCells:Implication of..；Apigenin inhibits VEGF and HIF-1expression via PI3K/AKT/p70S6K1 and HDM2/p53 pathways--Fang et al.The FASEB 19(3):342--..；Balasubramanian and Eckert Toxicol Appl Pharmacol224:214-19；Birt etal.Carcinogenesis 7:959-63；Patel,Shukla,and Gupta Int J Oncol30:233-45；Satoet al.Biochem Biophys Res Commun 204:578-84)。此外，芹菜素还可产生活性氧，破坏线粒体膜的完整性。目前的研究试验表明，它可以减少DNA氧化损伤，抑制白血病细胞生长和诱导这些细胞分化，抑制肿瘤细胞信号转导，诱导细胞凋亡；作为抗炎行为，而且有反痉挛或解痉的作用。已经提交超过100项有关的芹菜素的专利申请。在这些专利中包括应用芹菜素作为治疗炎症和自身免疫性疾病的药物。此外，还包括应用芹菜素作为癌症化学预防药物的使用和与细胞毒性化疗药物联合应用的协同其作用(美国专利20060189680)。多组研究人员目前正在进行关于芹菜素作为预防药物和协同化疗药物肿瘤治疗效果的研究，以此作为增强化疗的治疗。不过，此协同作用非常有限。有数据显示，在体外应用三个人肿瘤细胞株(HT1080，Cal27和UM-SCC6)测定三种化疗药(紫杉醇，顺铂，阿霉素)联合应用30mM芹菜素未见无明显的协同效应。已有数据显示，芹菜素单独应用100mM未见细胞毒性，只有与其他药物联合应用方可有协同作用。

10-30M芹菜素可代替pUC19质粒转染和IKK抑制剂，与WST-1r达到癌症协同诱导肿瘤细胞死亡。这种作用是芹菜素和WST-1r剂量和时间相关的，并可在多种人肿瘤细胞重复。

芹菜素抑制CK2，它也通过抑制CK2进而抑制IKK和NF-B。WST–1可诱导产活性氧。这种组合治疗的确显示了活性氧的产生和JNK活化，ROS-JNK-NF-B相互关系的理论，和JNK-NF-B的平衡决定细胞生死。另一方面，测试两个CK2抑制剂并没有显示这种抑制作用。针对CK2的siRNA只呈弱的抑制作用。除了对人黑色素瘤细胞株的影响IKK抑制剂并没有显示这种作用。如上所述，芹菜素可能影响更为关键的分子和信号通路。在这个组合中芹菜素治疗作用是独一无二的。真正的机制可能比我们现在认识到的更为复杂。

通常情况下，电子转移发生在线粒体膜。WST-1试剂通过电子细胞膜上的电子转移诱导产生活性氧并将在细胞质的NADH氧化为NAD+。由于大多数的癌细胞中线粒体能量代谢有缺陷，更依赖于细胞质中糖酵解，这将产生在细胞质中NADH的，这种结合的治疗方法提供了一种潜在的特异针对癌细胞的新的治疗方法。

WST-1试剂由WST-1和mPMS组成，也代表了各种四唑盐类和电子耦合试剂分别不同的组合。这种试剂能够进行跨质膜电子转移的过程，并可在此过程中产生活性氧。对这种治疗的重要特征之一是可以通过优化WST-1和mPMS的浓度和两个组成部分的比例控制活性氧产生的水平。它提供了有控制的从细胞内生成ROS作为信息传导分子，促使生成特定的信号，导致程序性细胞死亡，而不是直接破坏细胞的方式。

高水平的ROS损伤细胞中的各种大的调控分子，对于正常细胞可能是灾难性的。此前应用活性氧诱导剂作为癌症治疗的努力的失败是因为这种高毒性。另一方面，低水平活性氧可能是功能的细胞信号传导途径的一个信使。另一方面，ROS可以为信号参与细胞内的信息调节系统。这一项发明可选择性的诱导活性氧的生成，同时避免了大量的活性氧的产生所致的细胞毒性。在WST–1r试剂，WST–1c和mPMS的浓度以及两者之间的浓度比例，已调整和优化，以维持的协同诱导癌症细胞死亡，同时避免了活性氧的直接毒性。诱导细胞死亡是联合治疗的作用，而不是由WST–1r试剂单独所为。

此外，这种治疗方法包括采用脉冲式治疗，这可进一步限制任何长期治疗的潜在毒性。

这项发明的意义包括：

·这一治疗方法攻击的是癌细胞的一种特有的和所依赖的主要代谢途径和方式；

·这种治疗方法指明了一种在肿瘤细胞内选择性的和有控制的诱导产生活性氧作为信息传导的方式作为肿瘤治疗的方法；

·这一治疗方法可持续诱导JNK的磷酸化和激活从而诱导细胞坏死。

·此说明中所用的每一个抑制剂或试剂化学物质，如WST，均代表了一类化合物。这次相关的化合物类别中的其他一些成员用于这种联合治疗的治疗潜力也也作了研究。整个的治疗方法是新的，其所示高癌细胞死亡的结果，并有选择地针对癌细胞的潜能，此治疗的每一个步奏和每一个成分均可成为新的“癌症”治疗的方法，攻击目标与途径。例如，WST–1是以前一种试剂。现在，它被认为是治疗癌症的药。在此之前，WST-1从未被用作癌症治疗；

·本发明为抗癌药物开发提供了新的渠道。

此说明叙述了同时抑制两个IKK1和IKK2导致协同抑制肿瘤细胞中持续地NF-κB在固有活性的证据，和在抑制NF-κB火星后加用四唑盐WST-1后协同促进癌细胞死亡的证据。这两个发现的结合和WST–1的应用提供了一种新的，有效的癌症治疗药物开发的新途径并将对此有深远的影响。

除NF-B外，,信号转导和转录激活因子(Signal transducer and activator oftranscription，Stat)是另一个信息调节的家族，将细胞外信号的刺激移位到细胞核内，起着中介细胞因子和生长激素对基因转炉的调节。这些蛋白质调解细胞对各种刺激的反应导致一系列不同的基因表达，从而存在于许多细胞调解过程中，如细胞的生长和凋亡，起到至关重要的关键作用。STAT，如STAT3在肿瘤细胞的存活和增殖能力中发挥重要作用。然而，单独应用STAT抑制剂或IKK抑制剂对癌症细胞的存活无明显抑制作用。有证据表明，这两个转录因子可相互影响和相互功能合作。其转录启动子结合位点连接在一起，形成模块。此外，联合应用Stattic，一个STAT3抑制剂和IKK抑制剂或芹菜素可以得到协同诱导肿瘤细胞死亡的结果。这种联合抑制提供了一种治疗癌症的方法。

发现一些DNA和siRNA序列及其相应的基因作为癌症治疗的潜在靶目标。

如上所述，转染pUC19质粒对于三项联合治疗的必要性。转染pUC19质粒与化疗药物联合应用可有效性的减少所有四个测试过的化疗药物(paclictaxel，Doxourubicin，顺铂和5氟尿嘧啶)的IC50，使之降低3-30倍。根据pUC19质粒DNA序列设计的siRNA和针对其中一些相应的基因序列的siRNA可替换pUC19质粒与化疗药物合用。由此发现的这些基因是尚很少研究的基因。其中一些仍然是假设基因，这意味着他们还没有被研究。这些基因的发现可能提供抗癌药物开发潜在靶目标。

本发明的原始的基本发现包括WST-1作为抗癌药用于抗肿瘤的联合治疗，和从pUC19质粒DNA序列所包含的生物功能，并由此引伸而出的发现可作为治疗癌症特异识别并增加联合治疗和化疗的疗效的的靶目标基因。基于这些发现，本发明描述了联合应用这些化合物和生物分子，以及化疗药物的一些癌症的治疗方法。上述所致的化合物包括水溶性四唑盐，电子中间受体以及两者的结合，作为治疗癌症的药物组合，使用及治疗方法以及其他用于癌症治疗的化学成分，提取物，抑制剂和生物分子的药物组合。为便于理解其相互关系，可参考示意图。

发明内容

本发明提供了药物成分和组合构成和组合治疗癌症的方法和可用于治疗癌症的癌细胞的靶目标，以用于治疗在哺乳动物的癌症达到协同的治疗效果以及较少或没有毒性副作用。

本发明的一个体现，本发明提供了WST-1r的药用成分和可用于联合的治疗的可进行跨细胞质膜电子转移和诱导活性氧生成WST-1r的任何有效的替代品，。在WST-1r和WST－1r任何有效的替代品是一种四唑盐和电子耦合试剂(IEA)的混合物，或者至少一个四唑盐或至少一个IEA。该化合物于药学上可接受的药用介质。

本发明中的一项提供了基因，分子，和核苷酸序列和多肽序列，作为设计癌症患者的治疗需要的抗药物的靶目标。这些目标包括根据pUC19DNA序列中可映射到人类基因组的DNA序列的短小片断相应的多核苷酸序列，蛋白/多肽分子和/或基因组。这些相应的编码分子可能成为提高癌症的治疗效果的靶目标。其他序列也可作为攻击这些靶目标的药物用于癌症的治疗。潜在的药物包括但不限于siRNA，小分子抑制剂，多肽抑制剂，反义RNA，反义寡核苷酸，抗体，抗体片段，蛋白质，DNA的载体显性负和干扰素(干扰素)。具体讲，这些目标包括，但不仅限于，核苷酸序列TRPC6(SEQ ID NO:2),MAGI-3(SEQ ID NO:4),TMEM182(SEQ IDNO:5),SH3PXD2B(SEQ ID NO:3),or c60rf108(SEQ ID NO:14),，和多肽序列TRPC6(SEQ IDNO:6),MAGI-3(SEQ ID NO:8),TMEM182(SEQ ID NO:9),SH3PXD2B(SEQ ID NO:7),orc60rf108(SEQ ID NO:15).。可用于攻击这些人类基因组目标基因的序列包括，但不仅限于，pUC19质粒DNA载体vector(SEQ ID NO:1),siRNA2(SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQID NO:12).。针对这些目标基因合成的siRNA(SEQ ID NO:2to 5and SEQ ID NO:14)是为了证明这些基因可作为癌症综合治疗的目标基因。

本发明的一部分还提供了一种治疗癌症病人方法，包括同时或相继应用，(1)至少转染pUC19质粒或应用至少一个pUC19DNA转染的有效替代品；(2)至少有一个IKK抑制剂；及(3)第三个药物，WST–1r或至少一个WST-1r的有效替代品，于药学上可接受的载体媒介。此联合应用增强了诱导癌细胞死亡的作用，而这些药物单独应用则无任何治疗效应而且不具有毒性。

pUC19质粒DNA转染的有效替代品选自(1)I型干扰素，(2)合成siRNA的核苷酸序列：序列号NO：10–12(SEQ ID NO：10-12)，其DNA序列映射到pUC19质粒DNA序列和人类转录和基因组DNA序列；(3)生物的化合物，生物和非生物的有机，或无机化合物。上述化合物的筛选方法中的生物分子进一步选自可与下述基因的多核苷酸序：TRPC6(SEQ ID NO:2),MAGI-3(SEQ ID NO:4),TMEM182(SEQ ID NO:5),SH3PX D2B(SEQ ID NO:3),or c60rf108(SEQ ID NO:14),和其相应的氨基酸序列：TRPC6(SEQ ID NO:6),MAGI-3(SEQ ID NO:8),TMEM182(SEQ ID NO:9),SH3PXD2B(SEQ ID NO:7),or c60rf108(SEQ ID NO:15)相互作用以干扰其功能的多肽，蛋白质，多肽，抗体，抗体片段，针对这些目标基因合成的siRNA，(SEQID NO:2to 5and SEQ ID NO:14)是为说明这些基因可作为癌症联合治疗的攻击目标。

本发明提供了诱导恶性的癌细胞程序性细胞死亡的方法和一个联合治疗癌症病人的方法。本发明的联合治疗方法包括应用有效剂量WST–1r或任何有效的替代品，即能进行跨细胞质膜电子转移并诱导活性氧生成的替代品，芹菜素，一个可抑制NF-B活性和其他分子和/或信号途径多功能抑制剂，或者至少一个IKK抑制剂。上述综合治疗可提高芹菜素抗肿瘤作用，协同加强诱导肿瘤细胞死亡。

本说明的另一部分提供了一个为肿瘤病人治疗肿瘤的方法。此方法同时或相继应用至少一个治疗有效量的GSK3抑制剂，一个蛋白激酶CK2抑制剂和第三个试剂，WST–1r。更具体化，至少一个治疗有效量的GSK3抑制剂，LICl，至少一个蛋白激酶CK2抑制剂是芹菜素(Apigenin)。该化合物可溶于药学上可接受的载体或介质。这种结合增强了其诱导癌细胞死亡的作用，否则，单独应用则不具有毒性。

本发明的另一部分提供了一个为需要的病人治疗肿瘤的方法包括：同时或相继联合应用，转染pUC19质粒，或者至少一个pUC19质粒的有效的替代品，和至少一个常规的的化疗药物。在此所述的转染pUC19质粒或最少一个pUC19质粒的有效替代品可大幅度提高化疗药物的作用，并大大减少化疗药物毒副作用。

本发明的另一部分，提供了一个协同抑制NF-κB在肿瘤细胞或病人中的活性方法。此方法包括同时或相继转染至少一个显性负激酶死亡(Dominant negative)IKK1DNA载体(IKK1–KA)和至少一个显性负激酶死亡(Dominant negative)IKK2DNA载体(IKK2-KA)。上述至少一个显性负激酶死亡(Dominant negative)IKK1DNA载体(IKK1-KA)和至少一个显性负激酶死亡(Dominant negative)IKK2DNA载体(IKK2-KA)可由IKK抑制剂取代(IKK抑制剂名单)。该化合物可于药学上可接受的载体或介质中。加用WST–1r或WST–1r的有效替代物可进一步提高增加这种组合的抑制作用，诱导肿瘤细胞死亡。

本发明的另一个方面提供了一种诱导肿瘤细胞死亡，治疗肿瘤病人的方法，包括联合应用有效剂量的至少一种能够抑制NF-B抑制剂，和有效剂量的能够抑制STAT3的抑制剂于药学上可接受的载体或介质。具体来讲，能够抑制NF-B抑制剂包括IKK抑制剂或CK2的抑制剂。和有效剂量的能够抑制STAT3的抑制剂包括stattic。该化合物可于药学上可接受的载体或介质。

上述联合应用IKK抑制剂或芹菜和STAT3的抑制剂，stattic治疗癌症，其最实用的肿瘤包括头颈部鳞状细胞癌亚型。

附图说明

图1内源性NF-κB的下游基因的表达水平。UM-SCC-6细胞分别转染图中所示pCDNA(阴性对照)和IKK1-KA,IKK-KA and IKK1-KA and IKK-KA IKK1质粒。I B,p100(A)and CK2(B)的mRNA水平为其值与18sRNA的比值的校正值。数据表明，单纯抑制IKK对NF-κB的活性有很少或没有影响。同时抑制两个IKKs可以抑制协同抑制因子-κB的活性。

图2 IKK-KA转染和应用WST–1r对肿瘤细胞存活的影响。细胞按图1描述治疗后用WST–1r治疗4个小时。24小时后用CCK8试剂盒测定细胞存活。A：由CCK8试剂和定量测定的细胞存活；B：质粒，细胞图像显示细胞IKK1-KA+IKK2-KA IKK1共转染的细胞死亡。

图3。IKK抑制剂IKK1-KA转染和WST–1r联合治疗对细胞存活的影响。A:IKKInhibitor III,B:IKKInhibitor II,C:SC-514；D:细胞图像，E:CCK8试剂测定的IKKinhibitor III对细胞存活的影响F:CCK8试剂测定的IKK inhibitor VII对细胞存活的影响。

图4 HT1080细胞分别转染pUC19，pCDNA3，IKK1-KA，IKK-1KA+PUC19，或pCDNA3+pUC19DNA质粒，继之用3,10,or 30M IKK抑制剂III治疗，然后再经WST-1r治疗。治疗后24，48和96小时分别测定细胞成活。上图应用线性的IKK抑制剂III浓度，下图为IKK抑制剂III的对数浓度。标记：P3:pCDNA3，p9:pUC19，IKK1-KA:IKK1-K44A无磷酸激酶活性的IKK1在pCDNA3载体，GS:WST-1r，I-3:IKK抑制剂III。在治疗后96小时，经任何一个上述的DNA至里转染的，并应用30IKK抑制剂III和WST–1r治疗的细胞的永久死亡。经WST–1r治疗但未经转染细胞在治疗后96小时完全恢复生长。经DNA质粒转染，但没有应用WST–1r的细胞型治疗96小时后部分恢复生长。

图5 WST–1r诱导活性氧产生。HT1080细胞分别经途中标记的方法治疗：A：细胞首先用CM-H2-DCFDA标记，然后用WST-1r治疗30分钟；B：细胞首先用WST-1r治疗4小时，然后用CM-H2–DCFDA标记。所有A和B中竟WST-1r治疗过的细胞均表现出较强的荧光，表明WST-1r诱导产生ROS染色标记。令人惊讶的是，转染DNA质粒和应用IKK抑制剂III也诱导产生ROS。A中IKK抑制剂III单独应用表现出产生其剂量依赖性增加的活性氧，但在B无此作用。由此说明是说活性氧产生的时间过程中不同。DNA转染增加IKK抑制剂III诱发活性氧(A)的生成。只有这三项治疗结合方促进细胞死亡。每一个试剂和不同的组合都可能涉及不同的调控机制，但只有三个试剂结合可导致细胞死亡。(标记：I-3＝IKK inhibitor III,P9＝pUC19DNAtransfection,GS＝WST-1r)

图6 UM-SCC-6应用LiCl和芹菜素联合治疗并加用(左图)或未用(右图)WST–1r的治疗。数据表明，氯化锂的he芹菜素联合应用有协同作用。

图7 DNA转染增强化疗药物疗效的影响。.UM-SCC-6细胞分别转染pUC19,pCDNA3,pCDNA3+pUC19,pIKK1-KA+pUC19,pIKK2-KA+pUC19DNA,pIKK1-KA+pIKK2-KA+pUC19,pIKK1-KA,pIKK2-KA,pIKK1-KA+pIKK2-KA质粒。同时，无DNA的载体为阴性对照，二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。细胞存活率CCK8试剂测定。吸收峰450nm，背景纠正690nm。A：UM-SCC-6细胞应用5氟尿嘧啶治疗，B：UM-SCC-6细胞应用顺铂治疗。

DNA转染协同加强化疗药物的疗效作用，促进癌细胞死亡。HT1080细胞如图中标记，分别转染pUC19,pCDNA3,pCDNA3+pUC19,pIKK1-KA+pUC19,pIKK2-KA+pUC19DNA,pIKK1-KA+pIKK2-KA+pUC19,pIKK1-KA+pCDNA3,pIKK2-KA+p CDNA3,pIKK1-KA+pIKK2-KA+p CDNA3质粒。化疗药物在治疗剂量如图中所示：A:顺铂Cis-Platinum治疗72小时和24小时，治疗后(96小时),B:紫杉醇paclitaxel治疗治疗72小时和24小时，治疗后(96小时),C:5-FU治疗96小时后，D:阿霉素Doxorubicin治疗72小时后.。数据显示，转染协同化疗药物抑制细胞生长的影响。未经转染的细胞化疗药物治疗后细胞恢复生长，经DNA转染的细胞不能恢复，而永久的死亡(A和B)，这表明DNA的转染促进不可逆转的细胞死亡。与其他DNA质粒相比，pUC19中显示了最强的对细胞生长的抑制效应，和促使细胞死亡的作用。

图8 HT1080细胞分别转染IKK1-KA,IKK2-KA and IKK1-KA+IKK2-KA，并结合转染pUC19或pcDNA3质粒。pUC19质粒和pcDNA3作为单独转染作为对照。I B和IL-8mRNA水平测定作为衡量的NF-κB的转录活性指标。数据用相应的18sRNA水平矫正。

图9图示，芹菜素和WST-1r联合治疗协同加强诱导肿瘤细胞死亡。F1B影响芹菜素和WST-1r应用先后顺序对诱导肿瘤细胞死亡的影响。

图10图示示芹菜素和WST-1r应用先后顺序对细胞存活的影响

图11图示芹菜素和WST-1r联合治疗中WST-1R的是进过程和WST-1R和芹菜素的剂量反应关系。

图12图示IKK抑制剂和WST-1r联合应用治疗黑色素瘤细胞。

图13图示IKK抑制剂和WST-1r联合应用治疗秩序对诱导细胞凋亡的影响。

图14图示芹菜素和WST-1r联合治疗诱导的JNK活化。

图15 WST-1r,CCK8和芹菜素(apigenin)或IKK inhibitor III联合作用产生活性氧的的时间过程。

图16图示比较CCK8，XTT and WST-1r的能力。

图17图示比较其他水溶性四唑盐在联合治疗中诱导细胞死亡的能力。

图18图示HT1080：mPMS至细胞死亡的剂量反映关系。

图19图示比较不同细胞对mPMS治疗的反应。

图20图示WST-3和WST-3+mPMS替代的WST-1r与芹菜素联合治疗诱导细胞死亡的作用。

图21图示根据pUC19DNA序列设计的siRNA增强紫杉醇疗效。

图22图示用针对TMEM182和MAGI3的siRNA替代pUC19IKKInhbitor–WST-1r三项联合治疗的作用。

图23图示联合应用WST-1r，CCK8和芹菜素apigenin或IKK抑制剂III诱导活性氧生成的剂量反应关系。

图24图示已知干扰素的效果通常在涉及转染造成的影响，这个实验是要检查DNA转染的作用可以由干扰素替代。HT1080细胞分别应用图中所示不同剂量的不同的干扰素治疗以及无治疗的阴性对照和pUC19DNA转染的阳性对照。图示为WST-1r治疗后24和48小时细胞存活，分别应用线性和对数的IKK抑制剂III浓度和干扰素(INF)治疗剂量为变量表示。共测定14个INF包括：IFN A,IFN B,IFN C,IFN D，IFN F,IFN G,IFN H,IFN ,IFN J,IFN K,IFN 4b,IFN WA,IFN,IFN和IL-6。与pUC19质粒转染阳性对照(图24)比较。所有被侧定的INF均显示部分促进作用(50-80％)。

专利详细说明

1.总述

本发明基于以下的两个基本发现：(1)WST-1r作为药物与apigenin,IKK抑制剂或pUC19质粒DNA导入或任何有效的替代品联合应用可协同诱导细胞死亡，(2)pUC19可诱导死亡的作用来源于其内源性的DNA序列。

上述的第一个发现进一步导致发现一类新的化和物可用作为治疗癌症的组合药物成分。第二个发现进一步导致作为抗癌药物开发的一些靶目标基因的发现。这些基因都是目前尚很少研究的基因，其中有些仍是假设基因。这些发现进一步导致以下几个癌症治疗组合成分和治疗方法的建立。

此发明的一部分描述了WST-1r作为药物用于肿瘤联合治疗的一个组分的说明。

此发明的另一部分描述了以WST-1r相为代表应的一类化合物及其替代物，以及由此类化合物组成的治疗癌症的联合应用的配方。

此发明的一部分描述了发现pUC19质粒具有针对哺乳动物和人类癌细胞的生物效应，并可作为药用成分与IKK抑制剂和WST–1r联合用药作为癌症治疗的方法的说明。

此发明的另一部分描述了pUC19质粒还可与化疗药物联合应用提高化疗药物对癌症治疗的疗效。

根据这一发明，此发明的一部分描述了根据pUC19质粒DNA载体的核苷酸序列设计的siRNA(siRNA#1，siRNA#2，siRNA#3)以及其作为药物用于癌症联合治疗的方法的说明。

同样根据这一发明，此发明的一部分依据对于pUC19质粒DNA载体的核苷酸序列的分析以及与其相关的siRNA的生物功能的实验证据而发现的与癌症治疗有关的基因(TRPC6(序列号:2),MAGI-3(序列号:4),TMEM182(序列号:5),SH3PXD2B(序列号:3),or c60rf108(序列号:14)的核苷酸序列,和多肽序列TRPC6(序列号:6),MAGI-3(序列号:8),TMEM182(序列号:9),SH3PXD2B(序列号:7),or c60rf108(序列号:15)的多肽序列可作为研发抗癌药物的靶目标的基因。

此发明的另一部分提出了关于pUC19生物的和非生物的替代物及其与IKK抑制剂和WST-1r及其替代物联合应用对于治疗了癌症的作用的说明。PUC19的替代物包括各种干扰素和上述的siRNAs。

此发明的另一部分提出了关于pUC19的选自生物的和非生物的有效替代物以及与化疗药联合应用对于治疗了癌症的作用的说明。PUC19的替代物包括各种干扰素和上述的siRNAs。

此发明的另一部分描述了关于联合应用芹菜素(apigein),至少一个IKK抑制剂和WST-1r联合应用用于癌症治疗的方法。

同样也是此发明的一部分描述了至少一个蛋白激酶2CK2)，芹菜素(apigenin)，至少一个GSK3抑制剂,LiCl,以及应用WST-1r作为增强联合应用治疗癌症的方法的说明。

同样也是此发明的一部分描述了一个可通过向癌细胞内同时转入显性负IKK1和IKK2的DNA对NF-B有相乘抑制作用的方法。

同样也是此发明的一部分描述了联合应用至少一个IKK抑制剂或至少一个CK2抑制剂和STAT3抑制剂，Stattic,治疗癌症的组分。

定义

术语“pUC19质粒DNA”代表的是DNA克隆载体(序列号：1)在原核细胞中复制。这个载体的DNA序列首先由J.Messing,Waksman Institute,NJ提交与NCBI基因库on3-MAR-1986and revised by F.Pfeiffer on 16-DEC-1986。在此文中，pUC19质粒已被用作抗癌治疗药物用于转染人类癌症细胞。

实验数据表明，pUC19质粒的DNA序列的在体外培养的人癌细胞具有生物效应导致细胞死亡，当与其他成分联合应用时刻具有引导癌症细胞死亡的协同效应。DNA序列分析表明pUC19质粒的DNA序列可以短片段匹配于许多人类的mRNA以及人类基因组和转录侧翼序列位置周边的调节序列匹配。pUC19质粒在此代表短DNA序列，通常是15-100核苷酸序列可匹配到人类的mRNA和/或人类基因组DNA序列的基因侧翼区基地并与之结合。因此，相应的基因产物可为pUC19质粒的靶目标。由此产生的与这些基因相关的多聚核苷酸序列，包括但不限于根据pUC19质粒以及相应的基因的序列设计的siRNA,miRNA,shRNA，氨基酸序列，多肽抑制剂，以及针对这些基因产物的抗体及小分子抑制剂等可影响干扰和抑制这些基因表达水平及其相应基因产物蛋白质的功能活性从而可取代pUC19质粒作为pUC19质粒的的替代物用于癌症的治疗。匹配的DNA序列并没有必要被完全匹配。根据一般规律siRNA与匹配的DNA序列上可以略有不同，允许10％，20％，甚至高达30-40％的变异。这些siRNA,miRNA,shRNA的核苷酸序列可以有部分(10％，20％，直到30-40％)变异。

术语“pcDNA3m的DNA”是真核表达载体3.1版的修订版[序列号：13]，来自Invitrogen公司，但目前已停止生产和销售这个载体。修饰包括去掉位于第13核苷酸的BegIII位点，以及位于核苷酸999-1016的Sp6位点，并于HindII和EcoRI之间插入HA标志。质粒借助化学或脂质体DNA转染试剂转染到了人类癌细胞。实验数据表明pcDNA3的DNA序列对体外培养的人癌细胞可具有生物学功能。当pcDNA3与其他治疗成分联合应用时，可诱导体外培养的人癌细胞死亡的生物效应，以及导致细胞死亡的协同作用。DNA序列分析表明pcDNA3的DNA序列可以短片段匹配于许多人类的mRNA以及人类基因组和转录侧翼序列位置周边的调节序列匹配。pcDNA3在此代表短DNA序列，通常是15-100核苷酸序列可匹配到人类的mRNA和/或人类基因组DNA序列的基因侧翼区基地并与之结合。因此，相应的基因产物可为pcDNA3质粒的靶目标。由此产生的与这些基因相关的多聚核苷酸序列，包括但不限于根据pcDNA3质粒以及相应的基因的序列设计的siRNA,miRNA,shRNA，氨基酸序列，多肽抑制剂，以及针对这些基因产物的抗体及小分子抑制剂等可影响干扰和抑制这些基因表达水平及其相应基因产物蛋白质的功能活性从而可取代pcDNA3质粒作为pcDNA3质粒的的替代物用于癌症的治疗。匹配的DNA序列并没有必要被完全匹配。根据一般规律siRNA与匹配的DNA序列上可以略有不同，允许10％，20％，甚至高达30-40％的变异。siRNA,miRNA,shRNA的核苷酸序列可以有部分(10％，20％，直到30-40％)变异。

术语“siRNA1”[序列号：10]是一个根据pUC19质粒DNA序列”[序列号：1]衍生设计的siRNA。此siRNA序列匹配到人transient receptor potentialcation channel,C亚基,成员6(TRPC6,GeneID:7225),mRNA(gi|19923256|NM_004621.3)同义名:TRP6,FSGS2,FLJ11098。在此siRNA1作为药用于针对TRPC6的癌症治疗。TRPC6可作为与TRPC6DNA序列相匹配的siRNA的攻击目标。此siRNA可抑制TRPC6的表达水平。根据一般规律siRNA与匹配的DNA序列上可以略有不同，允许10％，20％，甚至高达30-40％的变异。TRPC6还可被与其相应的肽，反义RNA,反义寡聚DNA,显性负DNA质粒，抗体和小分子抑制剂所抑制。在此段内上述的siRNA序列是最佳的序列，并不排除其他的siRNA和此段内上述的其他方法用于针对TRPC6的抑制。对TRPC6基因的功能，以前虽有报告其可作为潜在的肿瘤治疗的靶目标，但尚无关于针对TRPC6靶目标的治疗用于与IKK抑制剂或化疗药联合应用协同抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞死亡的报告。

术语“siRNA3”[序列号：12]是一个根据pUC19质粒DNA序列”[序列号：1]衍生设计的siRNA。此siRNA序列匹配到人membrane associated guanylate kinase,WW and PDZdomain containing 3(MAGI3,GeneID:260425),transcript variant 2,mRNA(gi| 23097339|NM_152900.1同义名:MAGI3,MGC163281and the Homo sapiens transmembraneprotein 182(TMEM182,GeneID:130827),mRNA(gi|40255064|NM_144632.2)。在此siRNA3作为针对MAGI3和/或TMEM182靶目标的药用与癌症治疗。MAGI3和/或TMEM182可作为其任何相应的可匹配于MAGI3和/或TMEM182序列的siRNA的靶目标以抑制。根据一般规律siRNA与匹配的DNA序列上可以略有不同，允许10％，20％，甚至高达30-40％的变异。这些siRNA,miRNA,shRNA的核苷酸序列可以有部分(10％，20％，直到30-40％)变异。MAGI3和TMEM182还可被与其相应的肽，反义RNA,反义寡聚DNA,显性负DNA质粒，抗体和小分子抑制剂所抑制。在此段内上述的siRNA序列是最佳的序列，并不排除其他的siRNA和此段内上述的其他方法用于针对MAGI3和MEM182的抑制。对MAGI3基因的功能，以前虽有报告其可作为潜在的肿瘤治疗的靶目标，但尚无关于针对MAGI3靶目标的治疗用于与IKK抑制剂或化疗药联合应用协同抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞死亡的报告。目前尚无任何关于TMEM182与肿瘤相关的研究的任何报告。

术语“siRNA2”[序列号：11]是一个根据pUC19质粒DNA序列”[序列号：1]衍生设计的siRNA。此siRNA序列的2/3匹配到人Homo sapiens SH3 and PX domains 2B(SH3PXD2B),mRNA.(SH3PXD2B,GeneID:285590),mRNA(NM_001017995)同义名:HOFI；FLJ20831；KIAA1295。除此以外，此siRNA2还匹配到其他45个人类基因的DNA序列的侧翼区。在此siRNA2作为药被用于针对SH3PXD2B和所有其他的相关基因用与癌症治疗。SH3PXD2B可作为与SH3PXD2B的DNA序列相匹配的，并可抑制其表达水平功能的siRNA的攻击目标。根据一般规律siRNA与匹配的DNA序列上可以略有不同，允许甚至高达30-40％的变异。SH3PXD2B还可被与其相应的肽，反义RNA,反义寡聚DNA,显性负DNA质粒，抗体和小分子抑制剂所抑制。在此段内所述的siRNA序列是最佳的序列，并不排除其他的siRNA和此段内上述的其他方法用于针对SH3PXD2B的表达和功能的抑制。在此之前尚无任何有关SH3PXD2B基因肿瘤的关系的报告。

术语“TRPC6”[序列号：2]代表人transient receptor potential cationchannel,subfamily C,member 6(TRPC6,GeneID:7225),mRNA(gi|19923256|NM_004621.3)同义词:TRPC6,FSGS2,FLJ11098。在此发明，TRPC6是作为研发抗癌药物治疗的靶目标。TRPC6可以作为任何针对其并可改变其表达水平及分子功能的靶目标方式的改变在运作，其中包括但不限于多聚核苷酸，siRNA，shRNA，反义RNA，反义DNA寡聚体，和显性负的DNA载体，多肽，氨基酸序列，如肽，抗体，小分子抑制剂。TRPC6可被与其mRNA序列相匹配的并可影响其表达与功能的siRNA所攻击。根据一般规律siRNA与匹配的DNA序列上可以略有不同，允许10％，20％，甚至高达30-40％的变异。TRPC6还可被多肽，反义RNA，反义DNA寡聚核苷酸，和显性负的DNA载体，抗体，小分子抑制剂所攻击。上述siRNA1是首选的序列，但这并不排除其他的siRNA和此发明内上述的其他方法用于针对TRPC6的抑制。以前虽有关于TRPC6基因可作为潜在的肿瘤治疗的靶目标的报告，但至今尚无关于针对TRPC6靶目标的治疗用于与IKK抑制剂或化疗药联合应用协同抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞死亡的报告。

术语“MAGI3”[序列号：4]代表人membrane associated guanylate kinase,WWand PDZ domain containing 3(MAGI3,GeneID:260425),transcript variant 2,mRNA(gi |23097339|NM_152900.1).同义词:MAGI-3,MGC163281.MAGI-3。在上皮细胞，MAGI-3与ZO-1和cingulin共同位于细胞紧密连接处。而在原代培养星形胶质细胞，MAGI-3是存在于以E-钙粘蛋白为基础的的细胞连接处以及其灶状粘联斑处(Adamsky K,Arnold K,SabanayH, PelesE.,Junctional protein MAGIKKinteracts with receptor tyrosine phosphatasebeta(RPTP beta)and tyrosine-phosphorylated proteins.(J Cell Sci.2003,116(Pt7):1279-89)。MAGI-3与LPA(2)直接接触并调节LPA(2)诱导激活ERK和RhoA的功能活性(Zhang H,WangD,SunH,Hall RA,Yun CC,Cell Signal.2007Feb；19(2):261- 8.Epub2006Aug9)。MAGI3与癌症有关的功能以前已有报告，但没有报告关于MAGI3作为一个靶目标。抑制其活性并与WST-1r,IKK抑制剂或化疗药物联合应用可用于治疗癌症，从而达到协同抑制促进癌症细胞死亡以治疗癌症的目的。在此MAGI-3是开发抗癌药的靶目标，可以作为任何针对其并可改变其表达水平及分子功能的药物开发，其中包括但不限于多聚核苷酸，siRNA，shRNA慢，反义RNA，反义DNA寡聚体，和显性负的DNA载体，多肽，氨基酸序列，如肽，抗体，小分子抑制剂。在上述siRNA3是首选的序列，但是这并不限制其他siRNA序列和其他方法的应用。根据一般规律siRNA与匹配的DNA序列上可以略有不同，允许10％，20％，甚至高达30-40％的变异。

术语“TMEM182”[序列号：5]代表人trans-membrane protein 182(TMEM182,GeneID:130827),mRNA(gi|40255064|NM_144632.2)。在此TMEM183是作为研发抗癌药物治疗的潜在的靶目标。TMEM182可以作为任何针对其并可改变其表达水平及分子功能的靶目标的治疗药物与方法，其中包括但不限于多聚核苷酸，siRNA，shRNA，反义RNA，反义DNA寡聚体，和显性负的DNA载体，多肽，氨基酸序列，如肽，抗体，小分子抑制剂。在上述siRNA3顺序是首选的序列，但是这并不限制其他siRNA序列和其他上述的方法的应用。根据一般规律siRNA与其所匹配的DNA序列上可以略有不同，允许10％，20％，甚至高达30-40％的变异。该TMEM182目前以假设基因定义于基因库，此前尚无关于此基因的报告亦无任何有关TMEM182与肿瘤的关系的报告。

术语“SH3PXD2B”[序列号：3]代表人SH3and PX domains 2B链接蛋白HOFI(GeneID:285590)含有SH3和PX domain。SH3是Src同源基团3。SH3Domain与富含脯氨酸的配体以中等亲和力选择性的结合，尤其是首选PxxP片段，通过分子内相互作用调节酶活性，改变PX在亚细胞结构的位置。PhoX同源基团存在于p47phox和p40phox。真核细胞未知功能的基团存在于phox蛋白，PLD异构体和一个PI3K异构体。此前尚无任何关于SH3PXD2B的研究报告亦无任何有关SH3PXD2B与肿瘤的关系的报告。此前尚无任何关于SH3PXD2B的研究报告亦无任何有关SH3PXD2B与肿瘤的关系的报告。在此SH3PXD2B是作为研发抗癌药物治疗的靶目标。SH3PXD2B可以作为任何针对其并可改变其表达水平及分子功能的靶目标的治疗药物与方法，其中包括但不限于多聚核苷酸，siRNA，shRNA慢，反义RNA，反义DNA寡聚体，和显性负的DNA载体，多肽，氨基酸序列，如肽，小分子抑制剂。上述siRNA2首选的siRNA序列，但这并不排除上述其他siRNA及其他上述的方法可用于攻击SH3PXD2B的目的。根据一般规律siRNA与匹配的DNA序列上可以略有不同，允许10％，20％，甚至高达30-40％的变异。该TMEM182目前以假设基因定义于基因库，此前尚无关于此基因的报告。

术语“C6orf108”[序列号：6]代表人C6orf108染色体6open reading frame 108[Homo sapiens]GeneID:10591.正式代号C6orf108。此基因是基于可被c-myc激活而发现的。C6orf10的确切的功能尚不清楚。大鼠实验证据表明此基因与细胞分裂繁殖及c-myc介导的细胞转化有关。

术语“干扰素”(干扰素)代表一类是由白细胞和成纤维细胞产生细胞因子。在本文所描述的包括所有I型和II型干扰素和相应的所有干扰素的亚型，包括但不限于IFN A,IFNB,IFN C,IFN D,IFN F,IFN G,IFN H,IFN I,IFN J,IFN K,IFN 4b,IFN WA,IFN IFN andIL-6。

“WST-1c”代表一类水溶性四氮唑盐，WST-1{4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzenedilsulfonate}由ishiyama et al合成于1996(IshiyamM,et al Biol Pharm Bull 1996,19:1515-20)。

术语“WST-1r”代表一个试剂由WST-1c和mPMS以适当的WST-1c和mPMS的浓度及相互比例组成。WST-1r在此作为药物成分用于癌症治疗。

术语“IEA”全名：Intermediate Electron Acceptor中间电子受体。

术语“mPMS”化学名1-甲氧基-5-甲基-phenazinium甲基硫酸，与四唑盐相结合作为“电子耦合剂化合物的行为/中间电子受体”。

术语“Q1”是作为一种中间电子受体的化合物。

术语"WST-1r的有效替代物"表示任何可以替换WST 1r的化合物，代表任何可以替代WST-1c，或任何电子耦合剂，或可单独或以任何形式与任何组成WST-1r的四氮唑盐和中间电子受体结合应用替代此说明中所描述的协同诱导肿瘤细胞死亡的功能的其他成分。"WST-1r的有效替代物"包括但不是限于所有目前可得到的水溶性四氮唑盐：包括但不限于WST-1c,WST-3、WST-4、WST-5、WST-9、WST-10、MTS,WST 11,XTT；中间电子受体：包括但不限于mPMS和Q1；中间电子受体与水溶性四氮唑盐的组合物包括：WST-1+mPMS，WST-3+mPMS，WST-4+mPMS，WST-5+mPMS，WST-9+mPMS，WST-10+mPMS，WST-11+mPMS、XTT mPMS、MTS+mPMS、WST-3+Q1，WST-4+Q1，WST-5+Q1，WST-9+Q1，WST-10+Q1，WST-11+Q1，XTT+q1MTS+Q1。

术语"IKK抑制剂"一词表示所有的可抑制IKK活性的抑制剂。此发明首选的IKK抑制剂是，但不限于IKKInhitorII,IKK Inhibitor III,IKK Inhibitor VI,IKK InhibitorVII,和sc-514。更全面的IKK抑制剂的名单包括但不限于，,i)以确认其对IKK抑制功能的化合物包括但不限于:SPC839(Signal Pharmaceutical Inc.),Anilino-PyrimidineDerivative(Signal Pharmaceutical Inc.),PS1145(Millennium PharmaceuticalInc.),BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute,IKKinhibitor III),SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.),Amino-imidazolecarboxamidederivative(Smithkilne Beecham Corp.),Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives(AstraZeneca),Diarylpybidine derivative(Bayer),Pyridooxazinone derivative(Bayer),Indolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Benzoimidazolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Pyrazolo[4,3-c]quinoline derivative(Pharmacia Corporation),Imidazolylquinoline-carbxaldehyde semicarbazidederivative(Tulark Inc.),Pyridyl Cyanoguanidine derivate(Leo Pharma),IkBKinase Inhibitor Peptide(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(CalBiochem),IKKInhibitor II,Wedelolactone(CalBiochem),IKK Inhibitor VII(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor V N-(3,5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354(CalBiochem),IKK-2Inhibitor VI(5-Phenyl-2-ureido)thiophene-3-carboxamide(CalBiochem),IKK-2Inhibitor VIII ACHP 2-Amino-6-(2-(cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl)-4-(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitril e(CalBiochem).

术语"CK2抑制剂"一词表示所有蛋白激酶2的抑制剂。此发明首选的CK2抑制剂是，但不限于apigenin(芹菜素)。

术语“Apigenin”芹菜素属于黄酮类，广存泛存在于水果和蔬菜中，如苹果，芹菜等。CAS登录号：520-36-5，化学文摘服务名：4H-1-苯并吡喃-4-1,5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)-(9CI)。Apigenin是一个非致崎生物黄酮，存在于叶类植物与蔬菜中(如：西芹，洋蓟，罗勒属植物，芹菜)并对紫外线照射有显著的化学预防活性。现时的实验表明Apigenin可降低DNA氧化损伤，抑制白血病细胞生长和诱导这些细胞分化，抑制肿瘤细胞信号转导，诱导细胞凋亡，具有抗炎，抗痉挛和解痉的作用。Apigenin抑制NFκB，IKK,CK2,MPK,HIF,VEGF和其他分子的活性，调控细胞周期，和血管生的成功能，诱导p53的活化等途径。已知Apigenin可抵抗紫外线辐射引起的氧化和杀伤作用以及具有癌症化学预防的功能。

术语“氯化锂”是一个无机盐，lithedium氯化物，并作为一种合成激酶3(GSK3)抑制剂氯化锂在此代表合成激酶3抑制剂。

术语“IKK”代表Inhibitory kappaB Kinase，是一个磷酸化激酶可磷酸化Inhibitory B(I B)从而活化NF-κB。目前已有两个IKK亚型已经确定。他们是IKK1(IKK )和IKK2(IKK)。俩个IKK分子可由两个相同的IKK亚基，或由IKK1和IKK2混合再与NEMO相结合而组成。IKK是NF-B的上游的很重要的调控因子。术语"IKK抑制剂"一词表示可抑制IKK活性的抑制剂并进而抑制IKK激酶活化NF-B的功能。一个IKK抑制剂可能是一个竞争性、非竞争性的，可逆的或不可逆的IKK抑制剂。竞争性的IKK抑制剂是一个化合物或活性的肽可逆的作用于IKK酶的催化活性中心；"非竞争性的IKK抑制剂"是一种化合物，可逆抑制IKK酶的非催化部位；"IKK不可逆抑制"是一种化合物与IKK酶形成共价键不可逆转的抵毁IKK酶活性。此发明所述"IKK抑制剂"包括但不限于i)已确立的可抑制IKK特性的化合物包括，但不限于：SPC839(Signal Pharmaceutical Inc.),Anilino-Pyrimidine Derivative(SignalPharmaceutical Inc.),PS1145(Millennium Pharmaceutical Inc.),BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute,IKKinhibitor III),SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.),Amino-imidazolecarboxamide derivative(Smithkilne Beecham Corp.),Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives(AstraZeneca),Diarylpybidine derivative(Bayer),Pyridooxazinone derivative(Bayer),Indolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Benzoimidazolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Pyrazolo[4,3-c]quinoline derivative(Pharmacia Corporation),Imidazolylquinoline-carbxaldehyde semicarbazidederivative(Tulark Inc.),Pyridyl Cyanoguanidine derivate(Leo Pharma),IkBKinase Inhibitor Peptide(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(CalBiochem),IKKInhibitor II,Wedelolactone(CalBiochem),IKK Inhibitor VII(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor V N-(3,5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354(CalBiochem),IKK-2Inhibitor VI(5-Phenyl-2-ureido)thiophene-3-carboxamide(CalBiochem),IKK-2Inhibitor VIII ACHP 2-Amino-6-(2-(cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl)-4-(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitril e(CalBiochem).ii)一个特殊的部分，发现具有抗肿瘤活性的IKK抑制剂已，包括但不限于：PS1145(MillenniumPharmaceutical Inc.),BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。

术语“NF-κB”是一个rel蛋白家族，作为细胞核内调节基因表达的转录因子。通常NF-κB蛋白与IκB在细胞浆内形成无活性的NF-κB蛋白复合物。当受到刺激信号时，IKK磷酸化I B使之脱离NF-κB从而使由此释放的游离的NF-κB活化并从细胞浆内进入细胞核以激活NF-κB调节的基因的特别的转录。游离的I B将被protesomes分解。激活的NF-κB倾向于促进细胞增殖和生存。NF-κB的作用可促进癌变过程，肿瘤恶性化的发展及肿瘤细胞对化疗和放射疗法的抗药性。

术语：“c-Jun氨基末端激酶”(JNKs)，最初发现是作为激酶与c-JUN相结合并磷酸化c-JUN位于其分子内转录活化域的第63和73的丝氨酸。此部位是可被有丝裂原活化物激活的磷酸激酶，具有对各种刺激作出反应的能力，例如：细胞因子，紫外线照射，热休克，和渗透压性休克，并与T细胞分化和凋亡有关。

术语“活性氧”(ROS)的包括氧离子，无机和有机的自由基和过氧化物。由于未成对价层电子的存在他们通常是小分子，具有高度的活性。活性氧是氧的正常代谢的自然副产品，并在细胞具有重要的信号传递作用。已知活性氧对多种动物的细胞代谢都有很重要的影响。这些作用不仅包括诱导细胞死亡和细胞凋亡，还包括诱导细胞的防卫基因的反应，和铁的转移运送系统。由此进一步显示活性氧在信息传导与氧化还原中的作用。

术语“癌症细胞”所代表的是从人类的癌症或肿瘤细胞建立的可在体外培养的细胞株，这些细胞已失去接触抑制，具有恶性细胞特征。

术语“癌症”是指一种疾病状态，这种疾病是由于致癌物导致的体细胞恶性转化而形成的癌症，这些癌症细胞可入侵其周围的正常组织，进入淋巴或血液系统是这些恶性细胞可通过淋巴和血液系统扩散到身体其他部位，即癌症转移。

术语“有效剂量”本文提到的“有效剂量”是指一种药物或药品可引起一个细胞，组织，系统，动物或人类达到研究人员和临床医生所期望的生物或医学反应的剂量。进而术语“有效治疗剂量”是指对于一个以前没有用过此治疗的个体在经过此治疗后可达到疾病或症状或副作用的改善，治愈，康复，预防，或减少疾病的进一步发展或恶化的剂量。本术语还表示在一定的范围内有效地加强正常生理功能。

术语“癌症治疗”，表示所给予细胞或哺乳动物的药物或试剂，治疗疗程，所采用的给药或试剂的方法和治疗方法，以及用药顺序和给药间隔。

术语“协同效应”是指应用两个或两个以上的药物治疗并由此得到两种药物作用相乘的治疗效果，即优势相结合的结果以得到比这些药物的累加效应更大的疗效。

术语“化疗药物(代理)”是指任何药物对癌细胞细胞毒作用，且目前作为药物用于治疗癌症。以下所列药物为本说明测试过的的药物。，本发明所述“化疗药物”不局限于在本说明中提到化疗药物。

术语“氟尿嘧啶”,5-氟-2，4-(1H，3H)嘧啶(5-fluoro-2,4-(1H,3H)pyrimidinedione,5-FU)，氟脲嘧啶是目前临床应用的药物。

术语“顺铂”顺铂，cis-diamminedichloroplatinum,是目前临床应用的癌症的化疗药物药物。作为注射溶液PLATINOL.RTM。

术语“紫杉醇(Paclitaxel)”是一种强力抗肿瘤的药物，结合到N-末端区域的β-微管蛋白和促进高度稳定微管的形成抵制解聚，从而阻止正常细胞分裂，并使分裂细胞中止于细胞周期G2/M转换期。

术语“阿霉素(Doxorubicin)”，(8S，10S-10-[3-氨基-2,3,6-trideoxy-.alpha.-L-lyxo-hexopyranosyl)氧]-8-glycoloyl，7,8，9,10-四氢-6,8,11-羟基-1-甲氧基-5，12naphthacenedione盐((8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-.alpha.-L-lyxo-hexopyranosyl)oxy]-8--glycoloyl,7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-1-methoxy-5,12naphthacenedione hydrochloride)，是目前临床常规应用的注射用化疗药。

术语“化合物或药物成分的有效治疗量”，是指足以能够改变细胞培养的癌细胞增殖，在动物尤其是人类的肿瘤的生长或转移，包括防止肿瘤形成和阻止肿瘤的生长，化合物或药物成分的有效治疗量同时也代表可以导致癌细胞死亡或选择性的肿瘤细胞死亡，而对正常细胞的无副作用的药物剂量。

术语“药学上可接受的”表示由联邦或州政府或美国药典或其他监管部门批准承认的可在动物特别是在人类身上使用的。

术语“载体”是指，例如，可用于辅助给药的稀释剂，助剂，辅料，助剂或溶剂。这种药物的载体可为无菌液体，例如水和油，包括石油，动物，植物或合成液体，如：花生油，豆油，矿物油，芝麻油等。水或生理盐水，葡萄糖水和甘油是最常用的载体，尤其是注射液。“Remington的制药科学”介绍了适用的医用载体。它也包括细胞转染试剂，用于提供体外或体内转染DNA和/或RNA进入细胞的试剂。

术语“同时”是指(1)在相同时时间，或(2)在共同的治疗过程中相同的时间。

术语“顺序”是指首先用一个有活性的药，再用另一个有活性的药。第二个活性药物的应用可在应用第一个活性的药之后立即给予或间隔一段是今后在给予。间隔的时间可根据治疗效果决定已得到最好的治疗效果。

二.癌症治疗的靶目标与靶向治疗，

此发明提供了可作为肿瘤治疗的靶目标的基因的核苷酸序列，与这些基因相应的蛋白分子的氨基酸序列，以及能与这些基因及相应的蛋白分子相互作用已达到肿瘤治疗作用的抗体，多肽和小分子化合物。

这些基因与肿瘤治疗关系的发现起源于pUC19(SEQ ID#1)的核苷酸序列。当pUC19(SEQ ID#1)转染肿瘤细胞，并同时合用IKK抑制剂，并与WST-1r或其有效替代物合用时可产生诱导肿瘤细胞死亡的协同效应。pUC19(SEQ ID#1)转染肿瘤细胞还可与化疗药物合用已达到协同治疗效应。pUC19(SEQ ID#1)的这一治疗作用此前从未有过报道，在此是首次发现。pcDNA3v3.1(SEQ ID 13)也发现有相同作用。"NCBI Blast_pcDNA3核苷酸序列(5448字母)"。

pUC19(SEQ ID#1)的抗肿瘤作用源于与其DNA核苷酸序列。pUC19(SEQ ID#1)的DNA序列可匹配于一些特定的信息RNA和许多基因周边的调节部位。可与pUC19(SEQ ID#1)匹配的人类信息RNA包括但不限于：1)Homo sapiens transient receptor potential cationchannel,subfamily C,member 6(TRPC6,GeneID:7225,mRNA:NM_004621.3,SEQ ID#2,#6),(2)Homo sapiens SH3and PX domains 2B(SH3PXD2B,GeneID:285590,mRNA:NM_001017995,SeQ ID#3,#7),(3)Homo sapiens membrane associated guanylate kinase,WW and PDZ domain containing 3(MAGIKK,GeneID:260425,transcript variant 2,mRNA:NM_152900,SeQ ID#4,#8),(4)the Homo sapiens trans-membrane protein 182(TMEM182,GeneID:130827,mRNA:NM_144632,SeQ ID#5,#9)and(5)Homo sapienschromosome 6 open reading frame 108 C6orf108,GeneID:10591SeQID#14,#15).pUC19(SEQ ID#1)与人类基因匹配的序列列于：“NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts andgenome(2686 letters)”,“NCBI Blast_siRNA2Nucleotide sequence(24 letters)”and”NCBI Blast_pcDNA3 Nucleotide sequence(5448letters)”。

在此列出的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO:2,3,4,5and 14)，以及与此衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO:6,7,8,9and 15)可作为肿瘤治疗的靶目标用于发抗肿瘤药物的研发。其中包括但不限于：肽与蛋白质，多肽抑制剂，抗体，小分子抑制剂，siRNAs，shRNA,antisense-RNA，反义寡核苷酸，和dominant negative DNA。在此所说的siRNAs包括但不限于siRNA1(SEQ ID#10)，siRNA2(SEQ ID#11)siRNA3(SEQ ID#12)。

在此应用的作为基因产物的多聚核苷酸和多肽包括：重组多聚核苷酸和多肽，天然的和人工合成的多聚核苷酸和多肽，以及化学修饰的多聚核苷酸和多肽。

在此所述匹配于人类基因周边调节部位的pUC19的核苷酸和的多肽包括：从组多聚核苷酸和多肽，天然的和人工合成的多聚核苷酸和多肽，以及化学修饰的多聚核苷酸和多肽。

在此所述的多聚核苷酸和多态肽的片段也可用于本发明所述的用途。例如：多聚核苷酸序列(SEQ ID#2,3,4,5and 14)的衍生物和类似物可由i)DNA序列的片段且可含有40％以下的错配；ii)插入融合DNA质粒的DNA序列；iii)经过修饰的核苷酸序列所替代。

在此所述的多聚核苷酸和多态肽的片段可用于本发明所述的用途。例如：多肽序列(SEQ ID6,7,8,9and 15)的衍生物和类似物可由：i)一种一个或多个氨基酸被遗传守恒的氨基酸或非遗传守恒的氨基酸所替代，而且这些替代的氨基酸不必是与其相应基因的DNA序列一致；ii)一种其中包含一个或多个氨基酸的替代物；iii)成熟多肽与另一个复合物融合，如一种化合物可增加了多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)一种额外的氨基酸的半衰期中这融入成熟的肽，例如：一个引导肽链，或分泌的序列，或用于纯化成熟多肽的序列(如组氨酸hexapeptide)或蛋白原的序列。相关专业人士可根据此说明制作出或得到这些多肽片段，衍生物，和类似物。

在此所述siRNAs(SEQ ID 10，11、12)的替代物亦可用于本发明所述的用途。示例可能包括但不是限于以(i)可匹配到同一基因其他部位的DNA编码序列的siRNA在的基因siRNA序列；(ii)针对相同的基因的碱基的变异的siRNA但仍有能力减少此基因的表达水平；(iii)任何类型的经过修饰的siRNA，可为核苷酸的修适，或整个siRNA的修饰；(iv)使siRNA序列结合于任何形式的载体，如：质粒或化合物以助于将其送入细胞内。

以上所述基因的mRNA列及其可翻译区的核苷酸序列和氨基酸序列，可根据其基因ID从NCBI序列数据库获取。

在此所述的药剂成分及医疗应用至少部分是基于发现pUC19质粒与IKK抑制剂和WST-1r联合应用对于肿瘤细胞的生长和增殖的抑制作用和诱导肿瘤细胞死亡的作用以及与化疗药物相结合的协同增效的治疗作用。pUC19的这一作用可由能特异靶向改变上述基因或蛋白的表达水平的siRNA，shRNA，化合物或小分子抑制剂、肽抑制剂、抗体、显性负DNA，反义RNA、寡聚反义DNA，和抗体，所替代或可部分被干扰素的作用所替代。

可由此治疗的肿瘤包括但不限于：前列腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、子宫颈癌、胃癌、子宫内膜癌、脑癌、肝癌，膀胱癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈部癌，皮肤癌(包括黑素瘤和基底癌)间皮瘤、食管癌、乳腺癌、(包括小细胞肺癌肺癌、非小细胞癌)肾上腺癌、甲状腺癌、肾癌、胶质母细胞瘤，间皮瘤、肾细胞癌、肉瘤、绒毛膜上皮癌、皮基底细胞癌和睾丸生殖细胞癌。

三、WST-1r作为组合药物成分用于抗肿瘤治疗

此发明提供了一个包括WST-1r和其有效的替代物的药用组分。在此以前，WST-1r从未用作药物，更未用于抗肿瘤治疗。其抗肿瘤作用是其作为测定细胞生长的试剂(细胞增殖-WST-1)时发现的。当WST-1r与(1)芹菜素(Apigenin)及其有效的替代物、(2)IKK抑制剂(3)的Puc19转染或其有效的替代物以及至少一种IKK抑制剂，结合应用时，WST 1r可起到增强诱导肿瘤细胞死亡疗效的协同作用。此药物的成分可以有效的治疗剂量，合适的浓度溶于磷酸盐缓冲液或其它药要用介质中并以有效的剂量用于有适应症的肿瘤病人的治疗。

细胞增殖测定试剂WST 1r由四氮唑盐(tetrazolium盐)WST-1c,{4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzenedilsulfonate}(WST-1，Ishiyam M,et alBiol Pharm Bull 1996,19:1515-20；Berridge MV,et alBiotechnology Annual Review,Vol.II:127-152,2005)，和一个中间电子受体(IEA)1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate(mPMS,Berridge MV,etalBiotechnology Annual Review,Vol.II:127-152,2005)、以适当的浓度比组成并溶于磷酸盐缓冲液中。

WST 1r可用于癌症治疗的活性成分可以是WST-1或mPMS或二者以优化比率浓度的组合，在此说明以上和以下所指的WST 1r，代表具有相同功能和活性的一组化合物或一组由水溶性的四氮唑盐(tetrazolium盐)，与IEA组成的混合物。这些化合物具有，但并不限于，跨细胞膜电子转运的功能和产生活性氧(ROS)的功能。

有效的WST-1c替代物包括，但不是限于其它的四氮唑盐(tetrazolium盐)例如：WST-3、WST-4、WST-5、XTT、等以最适浓度并于可接受的药用介质中。

有效的mPMS的替代物包括其他IEAs，例如但不限于：Q1(Berridge MV,et alBiotechnology Annual Review,Vol.II:127-152,2005)以最适浓度并于可接受的药用介质中。

WST 1r包括至少一种四氮唑盐(tetrazolium盐)的成分WST-1c，和至少一个IEA,mPMS等以最适浓度和比例并于可接受的药用介质中。

WST 1r的有效替代物包括但不限于(1)由至少一个水溶性四氮唑盐(tetrazolium盐)和至少一个IEA组成的混合溶液。例如但并不限于：WST-1+mPMS，WST-3+mPMS，WST-4+mPMS，XTT+mPMS；(2)至少一个，四氮唑盐(tetrazolium盐)，例如，但不限于WST 3；(3)至少一个IEA,例如，但不限于、mPMS以最适浓度和比例并于可允许的药用介质中。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是WST-1r和芹菜素及其他有效的替代品可同时使用也可以任何顺序先后使用从而成为更适宜的法。此法适用于在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是WST-1r和至少有一个IKK抑制剂及其他有效的替代品可同时使用也可以任何顺序先后使用从而成为更适宜的用法。此法适用于在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是按照以下顺序：(1)DNA转染，或干扰素，或siRNA转染或其他有效的替代品，然后同时应用(2)至少有一个IKK，或CK2的或GSK3b抑制剂，然后,(3)再顺序应用WST1r从而成为更适宜的用法。此法适用于在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是按照以下顺序：(1)DNA转染，或干扰素，或siRNA转染或其他有效的替代品，然后同时应用(2)至少有一个IKK，或CK2的或GSK3b抑制剂，然后,(3)再顺序应用WST-1r成分中的电子偶和剂(IEA)，从而成为更适宜的法。此法适用于在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是按照以下顺序：(1)DNA转染，或干扰素，或siRNA转染或其他有效的替代品，然后同时应用(2)至少有一个IKK，或CK2的或GSK3抑制剂，然后,(3)再顺序应用WST-1r中所包含的所有其他成分，从而成为更适宜的用法。此法适用于在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是按照以下顺序：(1)DNA转染，或干扰素，或siRNA转染或其他有效的替代品，然后同时应用(2)至少有一个IKK，或CK2的或GSK3抑制剂，然后,(3)再顺序应用WST-1r任何有效替代物，从而成为更适宜的用法。此法适用于在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是按照以下顺序：(1)DNA转染，或干扰素，或siRNA转染或其他有效的替代品，然后同时应用(2)至少有一个IKK，或CK2的或GSK3抑制剂，然后,(3)再顺序应用WST-1c任何有效的替代物，从而成为更适宜的用法。此法适用于在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是按照以下顺序：(1)DNA转染，或干扰素，或siRNA转染或其他有效的替代品，然后同时应用(2)至少有一个IKK，或CK2的或GSK3b抑制剂，然后,(3)再顺序应用WST-1r成分中的IEA的有效的替代物，从而成为更适宜的用法。此法适用于在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是按照以下顺序：(1)DNA转染，或干扰素，或siRNA转染或其他有效的替代品，然后同时应用(2)至少有一个IKK，或CK2的或GSK3抑制剂，然后,(3)再顺序应用WST-1r成分中任何有效的替代物，从而成为更适宜的用法。此法适用与在此以上及以下的说明。

本发明用于治疗癌症的另一个用法要点是按照以下顺序：(1)应用DNA转染，或干扰素，或siRNA转染或其他有效的替代品，然后(2)应用至少有一个IKK，或CK2的或GSK3b抑制剂，然后,(3)再顺序应用WST-1r中任何有效成分及其中任何有效成分的有效替代物的各种组合，从而成为更适宜的用法。此法适用于在此以上及以下的说明。

至此，本发明提供了应用有效剂量的至少一个WST-1r的有效成分或上述的有效的替代作为对肿瘤病人有效的肿瘤治疗的方法。

每一个组成成分及其有效替代物的最适浓度有可能会不同细胞增殖剂WST-1的浓度。其中每一个成分及其有效的替代物的体内应用的最适浓度与体外的应用浓度也会不同。体外mPMS的有适效浓度范围为20-60M，WST-1c，0.1-1mM，WST-3，0.1-1mM，并溶于药用介质。

根据我们所拥有的最有效的数据WST-1r，WST-3+mPMS和WST-3是最有效的化合物与试剂组份。

由此，本发明提供了以至少一个有效剂量的WST-1r及其有效的替代品作为为癌症病人的治疗方法。

此外，本发明专门提供了应用WST-1r需要的的适宜的治疗时间为，WST-1r需与癌细胞直接接触15分钟至8小时。事宜的WST-1r的治疗时间为30分钟至4小时。最适宜的WST-1r的治疗时间为2-4小时。

可适用与此治疗的肿瘤包括但不限于：前列腺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，宫颈癌，胃癌，子宫内膜癌，脑癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，睾丸癌，头颈部肿瘤，皮肤(包括黑色素瘤和基底细胞癌)，内皮层癌，食道癌，乳腺癌，横纹肌肉瘤，结缔组织肿瘤，肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞癌)，肾上腺癌，甲状腺癌，肾癌，或骨；胶质瘤，间皮瘤肾细胞癌，胃癌，肉瘤，绒毛膜癌，皮肤基底癌，睾丸精原细胞瘤，和肉瘤。

四。抑制剂和WST-1r的组合疗法用于癌症治疗

本发明提供了诱导癌细胞死亡，抑制肿瘤生长，用于治疗肿瘤的新方法。根据本发明的规定，已发现的pUC19质粒DNA转染及其有效替代品和IKK抑制剂组合应用具有促进协同抑制癌症细胞生长和肿瘤的生长和促进协同抑制IKK抑制剂的有效替代品的诱导癌细胞死亡的作用。由此，本发明提供了一个由pUC19质粒DNA转染，或其至少一个有效的替代品，至少有一个IKK抑制剂，和WST-1r，及其有效替代药物联合组成的用于治疗癌症，肿瘤的药用组分及治疗应用步奏和配方，和应用方法。本发明还提供了一个联合应用干扰素，至少一个IKK抑制剂或其效替代物，和WST-1或至少一个WST-1r的有效替代物作为治疗肿瘤的有效方法。此外，本发明还提供了联合应用转染siRNA及其有效替代品,至少一个IKK抑制剂和至少一个WST-1r或至少之一个WST-1r的有效替代品治疗癌症的方法。

该DNA转染，可由以下替代物取代:1)至少一个合适剂量的干扰素，或2)转染至少有一个特异siRNA针对至少一个如前所述的靶基因，或3)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的化合物或小分子抑制剂4)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的抗体,或5)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的反义RNA，6)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的shRNA，7)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的反义寡核甘酸(antisense-oligo)，8)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的显性负(Dominant negative)DNA载体，9)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的肽(peptide和polypeptide)。

目标靶基因包括，但不限于，(1)Homo sapiens transient receptorpotentialcation channel,subfamily C,member 6(TRPC6,GeneID:7225),mRNA(gi|19923256|NM_004621.3)synonyms:TRP6,FSGS2,FLJ11098(SEQ ID#2,#6),(2)Homosapiens SH3和PX domains 2B(SH3PXD2B),mRNA(.(SH3PXD2B,GeneID:285590),mRNA(NM_001017995)synonyms:HOFI；FLJ20831；KIAA1295(SEQ ID#3,#7),(3)Homo sapiensmembrane associated guanylate kinase,WW and PDZ domain containing 3(MAGIKK,GeneID:260425),transcript variant 2,mRNA(gi|23097339|NM_152900.1)synonyms:MAGI-3,MGC163281(SEQ ID#4,#8),和(4)the Homo sapiens transmembrane protein 182(TMEM182,GeneID:130827),mRNA(gi|40255064|NM_144632.2)(SEQ ID#5,#9).

与如上所述相应的靶基因产物包括，但不限于这些基因的mRNA和蛋白质。

上述siRNA以及作为siRNA靶目标的基因的核甘酸序列也可包括这些基因的周边的核甘酸序列。这些序列存于：“NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts and genome(2686letters)”,“NCBI Blast_siRNA2Nucleotide sequence(24letters)”and“NCBIBlast_pcDNA3Nucleotide sequence(5448letters)”，NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts and genome之中.

至少一个干扰素可以选择从I型干扰素亚型，包括，但不限于：IFN A,IFN B,IFNC,IFN D,IFN F,IFN G,IFN H,IFN I,IFN J,IFN K,IFN 4b,IFN WA,and IFN.。

用于以上所述的癌症治疗的干扰素的有效的浓度为10单位/毫升或更低。

适用的IKK抑制剂包括任何所有具有抑制IKK活性的化合物性。

至少一个IKK抑制剂可选自，但不限于以下各组的化合物：1)已知具有抑制IKK活性的化合物：SPC839(Signal Pharmaceutical Inc.),Anilino-Pyrimidine Derivative(Signal Pharmaceutical Inc.),PS1145(Millennium Pharmaceutical Inc.),BMS-345541*(IKK inhibitor III,Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical ResearchInstitute),SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.),Amino-imidazolecarboxamidederivative(Smithkilne BeechamCorp.),Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives(AstraZeneca),Diarylpybidine derivative(Bayer),Pyridooxazinone derivative(Bayer),Indolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Benzoimidazolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Pyrazolo[4,3-c]quinoline derivative(Pharmacia Corporation),Imidazolylquinoline-carbxaldehyde semicarbazidederivative(Tulark Inc.),Pyridyl Cyanoguanidine derivate(Leo Pharma),I BKinase Inhibitor Peptide(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(CalBiochem),IKK Inhibitor II(Wedelolactone(CalBiochem),IKK Inhibitor VII(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor V(N-(3,5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354,CalBiochem),IKK-2Inhibitor VI(5-Phenyl-2-ureido)thiophene-3-carboxamide,CalBiochem),IKK-2Inhibitor VIII(ACHP2-Amino-6-(2-(cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl)-4-(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitril e,CalBiochem).

2)在一些特殊的体现，本发明所述IKK抑制剂组还可包括先前已被列为抗肿瘤剂，包括但不限于PS1145MillenniumPharmaceutical Inc.),BMS-345541*(IKKinhibitorIII,Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。

如上文所述，适合于WST-1r和至少一个的WST-1r的有效替代品包括,但不限于WST-1r和WST-1r的每一个组成成分及其有效的代替品包括：WST-1r及其水溶性四唑盐得替代物，和电子中间受体，mPMS，由所有这些有效替代品可能的各种组合而成的有效替代物，以及这些WST-1和其每一个组成WST-1r的成分的有效的替代品的水溶性四唑盐和电子中间受体的单独成分，在最适浓度并溶于药用介质或佐剂。

本发明的一个要点是，本发明所选用的用于肿瘤治疗的pUC19质粒DNA转染或其有效的替代品，至少有一个IKK抑制剂和WST-1r，或者至少一个WST-1r的有效替代品可按任何顺序进行治疗。然而，pUC19质粒DNA转染或干扰素治疗，或siRNA转染或其他有效替代品，至少有一个IKK抑制剂和WST-1r或WST-1r的至少一个有效的替代品可同时或顺序应用与治疗癌症病人和肿瘤细胞。换句话说，可首先进行pUC19质粒DNA转染，或首先应用至少有一个IKK抑制剂，或首先应用WST-1r，或至少一个WST-1r的替代型物，或者pUC19质粒DNA转染，至少有一个IKK抑制剂和WST-1r或至少有一个WST-1r的替代物可在同时应用。此外，当如上面所述的pUC19质粒DNA转染，换为siRNA转染，干扰素应用，或针对靶目标基因的小分子，与至少有一个IKK抑制剂和WST-1r，或者至少有一个WST-1r的有效的替代物应用，这些化合物的应用可以以任何顺序进行。

可以适用于这一治疗方法的肿瘤包括癌和肉瘤，但不限于以上所述的癌症和肿瘤。不过，具有异常合NF-κB活性的癌症和肿瘤细胞对此治疗方法会更加敏感。

本发明在此还包括了另一个可为诱导肿瘤细胞死亡和抑制癌症病人的肿瘤的方法。根据此本发明，已发现联合应用在有效浓度的黄酮类(flavonoids)成分，apigenin，或其有效的替代品，或IKK抑制剂与有效浓度的WST-1r或其有效替代品可协同诱导肿瘤细胞死亡。由此，本发明提供了一种应用于肿瘤治疗的药物组分和实际应用的步鄹与方法。此方法包括联合应用有效剂量的黄酮类(flavonoids)成分，尤其是apigenin，或其有效的替代品，或IKK抑制剂与有效浓度的WST-1r或其有效替代品组成，并溶于药用介质中。

以上和以下的说明，从细胞或体内移除这些治疗对于诱导肿瘤细胞死亡是必要的。

适用的黄酮(flavonoids)包括，但不限于芹菜素(apigenin)及其有效的替代品溶于药用介质之中

适用的芹菜素(apigenin)的有效的替代品包括溶于药用介质之中的，具有芹菜素的抑制作用的化合物。

使用的IKK抑制剂已如上所述，以及下面将会提到的，IKK抑制剂包括各种具有抑制IKK活性的化合物于用药介质之中。至少一个IKK抑制剂包括，但不限于以下各组的化合物：1)已知具有抑制IKK活性的化合物：SPC839(Signal PharmaceuticalInc.),Anilino-Pyrimidine Derivative(Signal Pharmaceutical Inc.),PS1145(MillenniumPharmaceutical Inc.),BMS-345541*(IKK inhibitor III,Bristol-Myers SquibbPharmaceutical Research Institute),SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.),Amino-imidazolecarboxamide derivative(Smithkilne Beecham Corp.),Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives(AstraZeneca),Diarylpybidine derivative(Bayer),Pyridooxazinone derivative(Bayer),Indolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Benzoimidazole carboxamide derivative(Aventis Pharma),Pyrazolo[4,3-c]quinoline derivative(Pharmacia Corporation),Imidazolylquinoline-carbxaldehyde semicarbazide derivative(Tulark Inc.),Pyridyl Cyanoguanidine derivate(Leo Pharma),I B Kinase Inhibitor Peptide(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(CalBiochem),IKK Inhibitor II(Wedelolactone(CalBiochem),IKKInhibitor VII(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor V(N-(3,5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354,CalBiochem),IKK-2Inhibitor VI(5-Phenyl-2-ureido)thiophene-3-carboxamide,CalBiochem),IKK-2Inhibitor VIII(ACHP2-Amino-6-(2-(cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl)-4-(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitril e,CalBiochem).2)在一些特殊的体现，本发明所述IKK抑制剂组还可包括先前已被列为抗肿瘤剂，包括但不限于PS1145MillenniumPharmaceutical Inc.),BMS-345541*(IKKinhibitor III,Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。

如上文所述，适合于WST-1r和至少一个的WST-1r的有效替代品包括,但不限于WST-1R和WST-1r的每一个组成WST-1r的成分及其有效的代替品包括：WST-1r及其水溶性四唑盐的替代物，电子中间受体(IEA)的替代物，和由所有这些WST-1和mPMS的有效替代品所组成的各种可能的组合，以及与WST-1r每一个组成成分WST-1和mPMS而成的有效替代物，还包括这些WST-1和其每一个组成WST-1r的有效的替代品的水溶性四唑盐和电子中间受体的WST-1和mPMS单独成分，在最适浓度并溶于药用介质或佐剂。

芹菜素(Apigenin)的有效浓度可能因不同类型细胞的而不同。体外首选的剂量是在10-100M(微摩)范围。

由此以上及以下的关于WST-1r及其有效的替代品的每一个组分的有效浓度可能会不同于作为细胞增殖测定剂的WST1r中每一个成分的浓度。每一个组成成分及其有效替代物的最适浓度也会不同。体内应用的最适浓度与体外的应用浓度也会不同。体外应用WST-1r细胞增生试剂的最适浓度是3-10％于药用介质中。体外mPMS的有效浓度范围为20-601M，WST-1c，0.1-1mM，WST-3，0.1-1mM，并融于药用介质。

本发明的一个特殊要点是，本发明所选用的用于肿瘤治疗的WST-1r或其有效的替代品，至少有一个IKK抑制剂和芹菜素(apigenin)，或者至少一个芹菜素(apigenin)的有效替代品可按任何顺序进行治疗。然而，芹菜素(apigenin)，或芹菜素(apigenin)的有效替代品，至少有一个IKK抑制剂和WST-1r或WST-1r的至少一个有效的替代品可同时或顺序应用于治疗病人和癌细胞。换句话说，可首先应用apigenin，或首先应用至少有一个IKK抑制剂，或WST-1r，或至少一个WST-1r的有效替代型物，或者芹菜素(apigenin)，至少有一个IKK抑制剂和WST-1r或至少有一个WST-1r的有效替代物可在同一时间进行应用。此发明的治疗首选顺序是同时应用WST-1r或WST-1r的有效替代品和apigenin或apigenin的有效替代品，或者至少有一个IKK抑制剂，然后加用apigenin或IKK抑制剂保持另一个24小时。

本发明的另一个要点是，是所有上述和以下的体现，治疗用的WST-1r需与细胞接触15分钟至8小时。适宜的时间在30分钟至4小时。最佳时间是2-4小时。需移除WST-1r或其有效的替代品对于促使细胞死亡。

由此，本发明提供了治疗癌症病人的方法。此治疗方法需要应用有效剂量的至少一个WST-1r或其有效的替代品并与apigenin，或者至少一个其有效替代品于药用介质中联合应用。

由此，本发明提供了治疗癌症病人的方法。此治疗方法需要应用有效剂量的至少一个WST-1r或其有效的替代品并与至少一个上述的IKK抑制剂，于药用介质中联合应用。

可适用与此治疗的肿瘤包括但不限于：前列腺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，宫颈癌，胃癌，子宫内膜癌，脑癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，睾丸癌，头颈部肿瘤，皮肤(包括黑色素瘤和基底细胞癌)，内皮层癌，食道癌，乳腺癌，横纹肌肉瘤，结缔组织肿瘤，肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞癌)，肾上腺癌，甲状腺癌，肾癌，或骨；胶质瘤，间皮瘤肾细胞癌，胃癌，肉瘤，绒毛膜上皮癌，皮肤基底癌，睾丸精原细胞瘤，和肉瘤。

适用于至少一个IKK抑制剂与WST-1r及有效替代品联合治疗方法的肿瘤包括，但不仅限于部分癌，与肉瘤，如黑色素细胞瘤，如：SK-Mel-5,和T294黑色素细胞瘤细胞以及对此联合治疗有反应的癌细胞及肿瘤。

本发明还提供了协同抑制癌细胞中NF-B活性的方法。根据本发明，当用无磷酸激酶活性的显性负(dominant negative)IKK1-KA和IKK2-KA同时转染细胞pUC19质粒DNA转染可起到协同抑制NF-kB在癌细胞中活性的作用。联合应用WST-1r或WST-1r的有效替代物这种抑制作用，可进一步加强这种抑制作用。

同上所述，pUC19质粒DNA的转染可由以下方法代替：1)应用至少一个合适剂量的干扰素，或2)转染至少有一个特异siRNA或shRNA针对至少一个如前所述的基因，或3)针对至少有一个如前面所述的目标基因和/或其基因产物的化合物或小分子抑制剂4)针对至少有一个如前面所述的目标基因和/或其基因产物的抗体,或5)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的反义RNA，6)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的反义寡核甘酸(antisense-oligo)，并与至少一个IKK抑制剂联合应用。

至少一个干扰素包括，选自，但不限于：:IFN A,IFN B,IFN C,IFN D,IFN F,IFNG,IFN H,IFN I,IFN J,IFN K,IFN 4b,IFN WA,IFN ,IFN or IL-6。

可作为目标靶基因，并作为该siRNA，shRNA，小分子抑制剂，多肽抑制剂，抗体，反义RNA，反义寡核苷酸，和抗体的靶目标的mRMA和蛋白包括，但不限于：(1)Homo sapienstransient receptor potential cation channel,subfamily C,member 6(TRPC6,SEQ ID2,6),(2)Homo sapiens SH3and PX domains 2B(SH3PXD2B,SeQ ID#3,#7),(3)Homosapiens membrane associated guanylate kinase,WW and PDZ domain containing 3(MAGIKK,SeQ ID#4,#8),(4)the Homo sapiens transmembrane protein 182(TMEM182,SeQ ID#5,#9)and(5)the C6orf108(Seq ID#14,#15)。

如上文所述，适用于WST-1r和至少一个的WST-1r的有效替代品,包括，但不限于WST-1R和WST-1r的每一个组成成分及其有效的代替品包括：组成WST-1r的水溶性四唑盐及其有效的替代物，WST-1r的每一个组成成分以及WST-1r的每一个组分的有效的代替品，以及由所有这些WST-1r每一个组分的有效替代品组成的各种可能的组合而成的有效替代物，和包括WST-1r以及这些有效的替代品与WST-1r的有效成分，WST-1和mPMS的各种可能的组合。

如上所述至少一个IKK抑制剂选自，但不限于以下各组的化合物：1)已知具有抑制IKK活性的化合物：SPC839(Signal PharmaceuticalInc.),Anilino-PyrimidineDerivative(Signal Pharmaceutical Inc.),PS1145(Millennium PharmaceuticalInc.),BMS-345541*(IKK inhibitor III,Bristol-Myers Squibb PharmaceuticalResearch Institute),SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.),Amino-imidazolecarboxamide derivative(Smithkilne Beecham Corp.),Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives(AstraZeneca),Diarylpybidine derivative(Bayer),Pyridooxazinone derivative(Bayer),Indolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Benzoimidazole carboxamide derivative(Aventis Pharma),Pyrazolo[4,3-c]quinoline derivative(Pharmacia Corporation),Imidazolylquinoline-carbxaldehyde semicarbazide derivative(Tulark Inc.),Pyridyl Cyanoguanidine derivate(Leo Pharma),IkB Kinase Inhibitor Peptide(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(CalBiochem),IKK Inhibitor II(Wedelolactone(CalBiochem),IKKInhibitor VII(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor V(N-(3,5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354,CalBiochem),IKK-2Inhibitor VI(5-Phenyl-2-ureido)thiophene-3-carboxamide,CalBiochem),IKK-2Inhibitor VIII(ACHP2-Amino-6-(2-(cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl)-4-(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitril e,CalBiochem).2)在一些特殊的体现，本发明所述IKK抑制剂组还可包括先前已被列为抗肿瘤剂，包括但不限于PS1145MillenniumPharmaceutical Inc.),BMS-345541*(IKKinhibitor III,Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。首选的IKK抑制剂是可以抑制IKK1和IKK2磷酸激酶的活性的IKK抑制剂。

本发明提供了另一个诱导癌细胞死亡，和抑制肿瘤的方法。按照本发明的规定，联合应用GSK3抑制剂和CK2的抑制剂，同时合用WST-1r或至少其中一个WST-1r的有效替代物可有协同抑制肿瘤生长的作用。由此，本发明提供了一个作用于部分癌症细胞和癌症病人治疗的药物组分。这一药物组分包括至少一个GSK3抑制剂，至少有一个CK2的抑制剂和WST-1r或至少其中一个WST-1r的有效替代物于药用载体。同时，本发明还提供了一种治疗肿瘤病人的有效方法，包括联合应用至少一个CK2的抑制剂和至少一个GSK3bata抑制剂。适用于此治疗方法的GSK酶3bata抑制剂包括任何例如具有GSK酶3bata抑制剂活性的化合物，如：氯化锂。适用于CK2的抑制剂，包括但不限于：芹菜素(apigenin)。

上述至少一个CK2的抑制剂选自，但不限于：TBB，TBBz，大黄素(emodin)，CK2的抑制剂3(Sigma)的化合物组成的组分。

上述适用于WST-1r和至少一个的WST-1r的有效替代品包括,但不限于WST-1r和WST-1r的每一个组成成分以及WST-1r的每一个组分的有效的代替品，还包括WST-1r以及由所有这些WST-1r每一个组分的有效替代品组成的各种可能的组合而成的有效替代物，以及这些有效的替代品与WST-1r的有效成分的各种可能的组合。

根据本发明，用于癌细胞或肿瘤病人治疗的至少有一个GSK3bata抑制剂，和至少一个CK2的抑制剂，可同时或相继顺序应用。换言之，可首先应用至少有一个GSK3bata抑制剂或，首先应用至少有一个CK2的抑制剂，或者可同时应用至少有一个GSK3bata抑制剂和至少一个CK2的抑制剂。此外，当使用一个以上的GSK3bata抑制剂和/或CK2的抑制剂，这种化合物可以按任何顺序应用。

可用于此癌症治疗方法的肿瘤细胞包括，但不限于UM-SCC-6细胞。此癌症治疗方法也可以用于，但不限于治疗本说明中前面所列的癌症。

本发明提供了增强或协同化疗药物对癌症的治疗作用的效果的另一个方法。基于本发明的发现，pUC19质粒DNA转染还协同加强化疗药物抑制肿瘤生长，并促进癌细胞死亡。因此，本发明提供了一个由联合应用pUC19质粒DNA转染病人或至少一个其有效替代品作为癌症治疗药物成分和至少一个化疗药物的治疗方法。加用在药用介质中的WST-1r或WST-1r的有效替代物与上述疗法联合应用可进一步提高这种诱导癌症细胞死亡的作用。本发明还提供了一种应用至少一个有效剂量的DNA转染，或DNA转染的有效替代品，并联合应用至少一个化疗药物作为治疗癌细胞或癌症的方法。在首选的体现，作为最适宜的用于转染的DNA是此前所属的原核细胞克隆质粒pUC19(SEQ ID 1)。

至少一个pUC19质粒DNA转染的有效替代品包括但不限于：1)至少一个合适剂量的干扰素，或2)转染至少有一个特异siRNA针对至少一个如前所述的靶基因，或3)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的化合物或小分子抑制剂4)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的抗体,或5)针对至少有一个如前面所述的目标基因和/或其基因产物的反义RNA，6)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的shRN A，7)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的反义寡核甘酸(antisense-oligo)，8)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的显性负DNA载体，9)针对至少有一个如前面所述的目标靶基因和/或其基因产物的肽。

适用的干扰素选自各种IFN亚型的家族成员，包括，但不限于：IFN A,IFN B,IFNC,IFN D,IFN F,IFN G,IFN H,IFN I,IFN J,IFN K,IFN 4b,IFN WA,and IFN,IFN andInterlukine-6(IL-6)。本发明的首选的干扰素是IFN和IFN亚族。用于以上所述的癌症治疗的干扰素的有效的浓度为10单位/毫升或更低。

可作为目标靶基因，并被至少一个化合物，或小分子抑制剂，至少一个特异的siRNA，shRNA，反义RNA，反义寡聚DNA，显性负DNA，至少一个多肽抑，至少一个抗体，至少一个抑制剂的靶目标的包括，但不限于：(1)Homo sapiens transient receptor potentialcation channel,subfamily C,member 6(TRPC6,SEQ ID 2,6),(2)Homo sapiens SH3andPX domains 2B(SH3PXD2B,SeQ ID 3,7),(3)Homo sapiens membrane associatedguanylate kinase,WW and PDZ domain containing 3(MAGIKK,SeQ ID 4,8),(4)theHomo sapiens transmembrane protein 182(TMEM182,SeQ ID 5,9)and(5)the C6orf108(Seq ID 14,15)。

相应的基因的产物包括，但不限于，相应的从这些基因转录的核甘酸序列和由此产生的蛋白质的氨基酸序列。

上述siRNA和shRNA序列以及作为siRNA靶目标的基因的核甘酸序列也可包括：“NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts and genome(2686letters)”,“NCBI Blast_siRNA2Nucleotide sequence(24letters)”中的匹配于这些人类基因的周边的核甘酸序列。

如上所述，适用的siRNAs包括上述siRNA1(SEQ ID No：10)，siRNA2(SEQ ID No：11)，和siRNA 3(SEQ ID No：12)以及所有潜在的可配对于人类基因组DNA序列的pUC19质粒DNA序列片段(10-100bp或更长)。通常，这些siRNA序列变化与基因的确切序列比较可以高达40％。此外，这些siRNAs的抑制功能还可由可以被匹配于相应的靶基因序列的其他部分的siRNA和/或shRNA，和可攻击这些靶目标的小分子抑制剂，多太(peptide)抑制剂，抗体，反义RNA，反义寡核甘酸和显性负DNA的质粒所替代。靶目标的基因产物，以及作为上述siRNA靶目标的基因包括，但不限于：(1)TRPC6，(SEQ ID No：2，6)(2)SH3PXD2B，(SEQ IDNo：3，7)，(3)MAGIKK，(SEQ ID No：4，8)，(4)TMEM182，，(SEQ ID No：5，9)，(5)C6orf108(SEQID No：14，15)。

上述适合于WST-1r和至少一个的WST-1r的有效替代品包括,但不限于WST-1r和WST-1r的每一个组成成分以及WST-1r的每一个组分的有效的代替品包括：WST-1r以及由所有这些WST-1r每一个组分的有效替代品组成的各种可能的组合而成的有效替代物，以及这些有效的替代品与WST-1r的有效成分的各种可能的组合。

合适的化疗药物包括但不限于：紫杉醇(Taxol.RTM)，顺铂，多西紫杉醇，卡铂，长春新碱，长春碱，甲氨蝶呤，环磷酰胺，中华映管-11，5氟尿嘧啶(5-FU的)，吉西他滨，雌莫司汀，卡莫司汀，阿霉素(阿霉素)，足叶乙_，三氧化二砷，伊立替康，和埃博霉素衍生物。首选的化疗药物是紫杉醇(Taxol.RTM。)，顺铂，和5氟尿嘧啶(5-FU)。

本发明的一个要点是，首选治疗应用顺序是：首先应用pUC19DNA质粒转染或至少一个它的有效替代品，然后在pUC19DNA转染后应用化疗药物。。然而，pUC19质粒DNA转染或至少一个其有效的替代品之一可与化疗药物同时或相继应用于治疗给予癌细胞或病人。换句话说，可首先应用pUC19质粒DNA转染，也可首先应用化疗药物。

可适用于此治疗的肿瘤包括但不限于上述癌和肉瘤。

除上所述，本发明还提供了另外的抑制NF-B活性和抑制肿瘤生长的方法。根据本发明的发现，用无磷酸激酶活性的显性负IKK1和IKK2(IKK1_-KA和IKK2-KA)同时转染肿瘤细胞可协同抑制NF-B的活性和肿瘤的生长。如应用无磷酸激酶活性的显性负IKK1和IKK2(IKK1_-KA和IKK2-KA)同时转染肿瘤细胞以将抑制NF-kappaB的活性，如再同时联合应用WST-1r或至少一个WST-1r的有效替代品，可进一步抑制癌细胞生长。由此，本说明提供了一个抑制NF-κB的活性和肿瘤的药用组分包括：联合应用转染至少一个IKK1-KA和至少一个IKK2-KA以及同时合用WST-1r或至少一个WST-1r的有效替代型物于药用介质治疗癌症病人。此外，本说明还提供了同时抑制IKK1和IKK2磷酸激酶活性以有效的抑制NF-κB的活性和/或为病人提供治疗癌症的方法。有效抑制IKK1和IKK2激酶活性方法可由下列方法替代：应用针对IKK1和/或IKK2的(1)siRNA(2)反义RNA，(3)反义寡脱氧核甘酸，(4)小分子抑制剂，(5)多太(peptide)抑制剂，(6)抗体，单独或同时以任何结合的方式联合应用，尤其是与，WST-1r或至少一个WST-1r的有效替代品合用。

在一个特定的表述，本发明所述IKK抑制剂包括，但不限于以下各组的化合物：SPC839(Signal Pharmaceutical Inc.),Anilino-Pyrimidine Derivative(SignalPharmaceutical Inc.),PS1145(Millennium Pharmaceutical Inc.),BMS-345541*(IKKinhibitor III,Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute),SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.),Amino-imidazolecarboxamide derivative(SmithkilneBeecham Corp.),Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives(AstraZeneca),Diarylpybidine derivative(Bayer),Pyridooxazinone derivative(Bayer),Indolecarboxamide derivative(Aventis Pharma),Benzoimidazole carboxamidederivative(Aventis Pharma),Pyrazolo[4,3-c]quinoline derivative(PharmaciaCorporation),Imidazolylquinoline-carbxaldehyde semicarbazide derivative(Tulark Inc.),Pyridyl Cyanoguanidine derivate(Leo Pharma),IkB KinaseInhibitor Peptid-(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(CalBiochem),IKK Inhibitor II(Wedelolactone(CalBiochem),IKK Inhibitor VII(CalBiochem),IKK-2 Inhibitor V(N-(3,5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354,CalBiochem),IKK-2Inhibitor VI(5-Phenyl-2-ureido)thiophene-3-carboxamide,CalBiochem),IKK-2Inhibitor VIII(ACHP2-Amino-6-(2-(cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl)-4-(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitril e,CalBiochem).

本发明的一个要点是，应用转染无磷酸激酶活性的显性负IKK1-KA和IKK2-KA，或本说明上述的其他任何方式抑制IKK的活性，和联合应用如上所述WST-1r，或其至少一种WST-1r的有效替代品，可同时应用或顺序应用。换句话说，可首先进行转染无磷酸激酶活性的IKK1-KA和IKK2-KA，或应用本说明上述的其他任何方式抑制IKK的活性，或首先应用NOX的底物/活化剂(WST-1r，或其至少一种WST-1r的有效替代品)，或两者可同时联合应用。如同时应用多余于一个的IKK抑制剂，可以任何顺序进行。

可适用与此方法的癌症包括但不限于上述各种癌症。

本发明提供了另一个诱导癌细胞死亡，抑制肿瘤的方法。根据本发明，IKK抑制剂或CK2的抑制剂与Stat3的抑制剂，stattic，或者至少一个stattic的有效替代品联合应用可得到协同促使癌细胞死亡，抑制肿瘤的生长的作用。由此，本发明提供了一个用于癌症细胞和癌症治疗的药物组分，包括至少一个IKK抑制剂或至少一个CK2的抑制剂，加之stattic或至少为一个stattic的有效的替代品于药用介质。此外，还提供了一种联合应用至少一个IKK抑制剂或至少一个CK2的抑制剂，与stattic或至少为一个stattic的有效的替代品治疗癌症的方法。适合的IKK抑制剂如前所述。适用的CK2的抑制剂，包括但不限于：芹菜素(apigenin)。适用的Stat抑制剂需能抑制Stat磷酸化，激活和细胞核转移的抑制剂，包括，但不限于stattic。IKK抑制剂或CK2的抑制剂和stattic可以任何顺序或方式的应用。首选的应用方式是同时应用。

五，给药方式及药品成分和化合物

本发明涉及的药物成分，可以通过任何合适的方式给予，例如，通过注射，口服，鼻腔吸入，或其他方法。一般来说，本发明所包括的药品成分还报括其他药用的稀释剂，防腐剂，增溶剂，乳化剂，助剂和/或运营商载体。这些成分可以包括各种缓冲剂成分的稀释剂(如：Tris-HCl，醋酸盐，磷酸盐)，pH值和离子强度，如清洁剂和助溶剂(例如，吐温80，Polysorbate80)添加剂，抗氧化剂(例如，抗坏血酸，焦亚硫酸钠)，防腐剂(例如，Thimersol，苯甲醇)和膨胀的物质(如乳糖，甘露醇)。这些成分可以被纳入特殊微粒，如聚乳酸，聚羟基酸等，或将脂质体聚合化合物的工艺制作。这些成分可能会影响本发明的药物的物理性能，状况，稳定性，体内释放的速率和速度，药物的体内清除速体率。例如，见Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.(1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18042)pages 1435-1712。本发明的药物成分，可以，比如说，在液态形式，或可以在干燥粉末状(如冻干)。药物组合物的应用方法已在以上给予介绍。

另一个要点是，本发明的药物成分，可以通过可控释系统提供，如使用静脉注射，植入渗透泵，皮肤贴剂，脂质体，或其他给药方式。在一特定的情况下，可使用输液泵给药(见Langer,supra；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.(1987)14:201；Buchwald et al.,Surgery(1980)88:507；Saudek et al.,N.Engl.J.Med.(1989)321:574)。在另一些情况下，可应用高分子材料，(见Medical Applications ofControlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Press:Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,DrugProduct Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley:New York(1984)；Ranger and Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.(1983)23:61；see also Levyet al.,Science(1985)228:190；During et al.,Ann.Neurol.(1989)25:351；Howard etal.,J.Neurosurg.(1989)71:105).。在另一种情况下，控制释放系统，可以放置在动物目标组织附近，由此可只需要系统性给药剂量的一小部分(见：Goodson,in MedicalApplications of Controlled Release,supra,(1984)vol.2,pp.115-138)。特别是，控释设备可以直入动物异常的免疫激活或肿瘤部位附近。其他控制释放系统在兰格的综述中介绍((Science(1990)249:1527-1533)。

程序性的细胞死亡的结论是根据正常细胞没有细胞毒性，而肿瘤细胞100％死亡的观察结果。这项发明涉及的癌细胞死亡是之前从未报导的。此发明其所涉及的机理可能是一个新的细胞调节的途径，在此发明中制定的应用程序活化癌症细胞的程序性死亡提供了进一步深入研究的模型。换句话说，相关专业人士可根据此诱导癌症细胞死亡的核心分子事件进行此过程。因此，此发明也要求此模型作为进一步研究的权利。

虽然上面和下面已经证明特定的实验结果和数据，一个从事肿瘤研究的专业人士可通过阅读本说明根据说明其所介绍的化合物名称，通过变化用药剂量，应用的顺序及时间，所述药物的有效的替代物，可得到相同或类似的结果。这些药物可以应用在任何哺乳动物的任何癌症。发明人指出在这个说明或任何后继文件没有对任何应用条件加以限制。发明人还指出，这项发明可单独应用，也可与传统的癌症治疗方法如化疗和放疗合用，但是，并没有对这一发明使用的范围加以任何限制。也可与化疗和放射疗法的联合使用，这个发明可减少化疗或放疗毒性由于化疗和放疗的剂量。最后，此发明可能会进一步增加肿瘤细对常规化疗，放疗的敏感性，减少化疗/辐射剂量。

以上述的说明和描述，并不包括，也不能用于限制此发明在今后应用的的全部。在今后应用过程中还会进行与上述说明一致的修改和变更。因此，应该指出，该发明的范围定义于权利要求及其相应的描述。

本发明现通过在下面的示例进行更详细地说明。在此声明这些例子只会描述了本发明的具体应用，但不以任何方式对此发明加以限制。此发明提供了核苷酸和氨基酸序列的数据。在某种程度上，这些新的序列数据可作为开发新的癌症治疗的新的靶目标，并不对本发明加以任何限制。所说靶目标是指应用以上方法进一步作药物开发发展的潜在目标。虽然此说明没有具体详述其它小分子药物的DNA，RNA，siRNA和已知的癌症治疗技术的所有其他方法使用辐射治疗的方法，专业人士可修改调整具体的应用方法和步鄹。

实例

示例1协同抑制NF-κB的活性

概述：通常情况下，体外NF-κB活性测定是通过人造报告基因分析，电子凝胶阻滞分析，及最近的DNA结合和ELISA法。然而，这些方法都采用外源DNA寡核苷酸或结构进行测量特定NF-κB的DNA结合转录活性的共识和NF-κB启动子序列。此外，NF-κB启动子作用是不同于真正的启动子序列。真正的启动子需要多个蛋白分子之间复杂的相互作用，而人为的NF-κB启动子可能引入人为的影响。

实验方法：UM-SCC 6细胞的细胞，effectene(Qiagen的)转染1)20％的显性负IKK1－KA(K44A)和80％pUC19中，2)20％的显性负IKK2-KA(K44A)和80％pUC19质粒转染,3)20％的显性负IKK1-KA(K44A)，20％的显性负IKK2-KA(K44A)和60％pUC19，4)20％pcDNA3和80％pUC19为阴性对照。所有细胞转染均持续72小时。然后，所有试验的细胞均用GeneSpectra药箱(Panomics)的细胞裂解液裂解并所有试验的细胞均用GeneSpectra药箱测定I B,p100,CSNK2B mRNA的水平。I B,p100,CSNK2B mRNA的水平均经相应的同时测定的18SRNA矫正。

在此之前，用无磷酸激酶活性的IKK1－K44A或IKK2－K44A单独转染UM-SCC-6细胞和其他头颈部鳞状细胞癌的肿瘤细胞我们看到部分(～50％)抑制NF-κB的活性。以内源性的I B,p100and CK2等NF–κB的下游基因作为NF-κB的活性指标，单独转染无磷酸激酶活性的IKK1－K44A导致20％抑制NF-κB的活性，而单独转染无磷酸激酶活性的IKK2－K44A，对NF-κB的活性无抑制作用。相反，当用无磷酸激酶活性的IKK1－K44A或IKK2－K44A同时抑制IKK1和IKK2，所有三个目标基因的表达水平均降低90％(图1A和B)。两种不同的测定结果说明前者可能有人为因素的影响。此外，我们的实验结果与目前关于IKK1和IKK2独立的通过不同的途径激活NF-κB的概念相矛盾。相反，我们的数据显示同时抑制IKK1和IKK2可得到协同抑制的作用。此结果暗示IKK1和IKK2两者之间有潜在的互换功能。

示例2同时对IKK1和IKK2抑制也可导致癌细胞死亡

除了抑制NF-κB的活性，同时用K44A-IKK1and K44A-IKK 2转染SCC-6细胞还导致细胞死亡(图2)。同时转染K44A-IKK1and K44A-IKK 2后48小时85％的细胞数目减少(图2WST–1no no)和大量的细胞死亡(图2b)。该数据代表了7组平行实验的平均值。

这一结果表明，抑制NF-κB的活性并导致癌细胞死亡，这种作用只能通过同时抑制两种IKK1和IKK2才能达到。此外，共转染的K44A-IKK1和K44A-IKK2sensitize还可增强UM-SCC-6细胞对顺铂和5–FU的敏感性10至100倍。

示例2四唑染料WST–1r增加IKKs双重抑制造成的癌细胞死亡。

在此研究中，常规的WST-1r的方法不能准确的测定细胞的数量。这是因为原IKK磷酸激酶抑制NF-κB的活性干扰这一测量。此外，我们发现，同时抑制IKK1和IKK2磷酸激酶的活性后应用WST-1r起到协同细胞死亡的作用(图2)。在图2A我们展示同时转染K44A-IKK1和K44A–IKK2导致80％细胞死亡。如加用WST-1r于K44A-IKK1和K44A–IKK 2共转染的细胞，可导致95％以上细胞死亡。图中所标示的实施的结果为7组平行实验的平均值。

示例3四唑染料WST-1促进协同杀死癌细胞的DNA转染与IKK抑制剂联合作用导致的SCC–6死亡。

概述：为进一步研究IKK抑制剂是否能有转染K44A-IKK1和K44A-IKK2导致癌症细胞死亡类似的效力，由于无IKK-1抑制剂，此实验采用联合应用转染K44A–IKK1和可抑制NF-κB活性的IKK2抑制剂。结果显示10M IKK抑制剂III,20M抑制剂IV,VI and VII,30M for抑制剂II and sc-514and 60M for MLN120b均导致大量肿瘤细胞死亡。当IKK抑制剂与转染K44A-IKK-1和用时可导致更多细胞死亡，但二者差异是有限的。然而，当在应用K44A-IKK1转染和IKK抑制剂后和用WST–1r，则导致协同细胞死亡。WST–1增加这些癌细胞对此治疗的敏感性，从而使达到同样效果所需的IKK2抑制剂的浓度可降低千倍以上。联合抑制超过1万倍以上浓度的IKK2抑制剂使用的少。这种协同作用的应用适用于全部七个已经过测试过的IKK2抑制剂。图3显示了联合应用转染K44A-IKK-1与IKK抑制剂III或IIV造成的这种协同的癌细胞死亡。抑制剂II,VI,sc-514and MLN120b也有相似的作用。这些数据表明，IKK抑制剂可能只会使癌细胞脆弱，需要与WST，第三个试剂，结合应用引起癌细胞死亡。因此，此数据表明，在IKK1，IKK2以及与WST以下三种药物联合治疗抑制-1可以协同促进癌细胞的死亡，并会与癌症治疗有关。

另一方面，数据还显示，与对照组比较(pCDNA3+pUC19)，K44A-IKK1(K44A-IKK1+pUC19)的差异非常有限。更详细的分析发现，这是pUC19的影响，因此上述联合作用应为：pUC19DNA转染，IKK2抑制剂和WST-1的联合作用。

示例4WST-1促进三项联合治疗所致HT1080人肉瘤细胞死亡。

方法：HT1080细胞培养在96孔板分别转染pUC19，pCDNA3,IKK1-KA,IKK1-KA+PUC19,和pCDNA3+pUC19DNA质粒，然后顺序应用IKK抑制剂和WST–1r。除对照组外，每一组细胞转染一种上述所列质粒24小时，然后应用3-30M IKK抑制剂III,24小时后，再应用WST4小时，然后再继续培养过夜后再用CCK8药箱进行测定并与此后24，48和96小时测定。

数据显示，(1)肿瘤细胞经转染DNA并应用IKK抑制剂III，并应用WST-1r治疗后24，48和96小时均表现出IKK抑制剂III剂量依赖性的细胞生长抑制和减少的细胞成活。然而转染pUC19或IKK1-KA并无明显区别(图4)。(2)与未加用WST-1r的细胞比较，加用WST-1r的细胞治疗后24，48和96小时进一步诱导的肿瘤细胞死亡，降低细胞存活率；(3)在治疗后96小时，所有未经转染的细胞重新生长到与无治疗的阴性对照相等的水平，经过DNA转染达没有经过WST-1治疗的细胞也部分恢复生长，(4)在96小时后，与经过各种治疗的肿瘤细胞相比，只有经过DNA转染的细胞也同时应用WST–1r治疗仍然没有恢复细胞生长。这一结果表明DNA转染细胞和应用IKK抑制剂造成这些细胞损伤。加用WST进行三项联合治疗，进一步促进这些肿瘤细胞100％死亡。在24小时后的存活细胞测定的差异也包括了由于WST-1r对于应用CCK8检测细胞存活测定的影响。在治疗48小时后这种影响减弱；96小时后这种影响完全消除。细胞形态学检查发现，在应用WST-1r 24小时之后，30M IIKK抑制剂III治疗过的细胞大部分死亡。然而，未用WST-1r治疗过的为死亡的细胞又可重新生长。反之，经过DNA转染，IKK抑制剂III和WST-1r治疗的肿瘤细胞为100％死亡。这些数据表明WST-1r增强IKK抑制剂III的效果的作用，并诱导促进肿瘤细胞死亡，而转染pUC19质粒也可有助于抑制细胞生长的综合效应。

示例7干扰素取代pUC19质粒转染，以加强IKK抑制剂III和WST–1r的作用。

概述：实验数据表明，DNA转染可协同IKK抑制剂III和WST–1r的三项联合的治疗作用导致肿瘤细胞死亡。此外，已知干扰素(IFN)的反应与DNA转染有关。在此，检验干扰素是否可作为pUC19DNA治理转染的替代品。

方法：HT1080细胞培养在96孔板顺书须应用干扰素，IKK抑制剂III和WST–1治疗。每一组细胞用一种2-1000单位干扰素亚型治疗24小时，随之相继用3-30M的IKK抑制剂III治疗24小时和WST–1r 4小时，然后经24和48小时后用CCK8试剂盒测定细胞成活性。总共测试了15干扰素亚型包括：IFN A,IFN B,IFN C,IFN D,IFN F,IFN G,IFN H,IFN I IFN J,IFN K,IFN 4b,and IFN WA,IFN,IFNand IL-6。

结果：(图24)与未应用干扰素治疗的细胞比较，结果表明干扰素剂量依赖性，和IKK抑制剂III IKK剂量相关的抑制肿瘤细胞生长和增加细胞死亡。根据治疗后48小时的测定结果，与pUC19质粒DNA转染并联合应用30M IKK抑制剂III和WST-1r相比，应用干扰素可达到80-90％的pUC19质粒DNA转染造成的抑制肿瘤细胞生长抑制和促进肿瘤细胞死亡的作用。

示例5WST-1诱导活性氧(ROS)生成。

概述：Ishiyama et al在1996年首次描述了WST-1(IshiyamM,et alBiol PharmBull1996,19:1515-20).)。这是一个细胞增殖检测试剂由罗氏公司生产的。WST-1是由氮唑盐WST-1({4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzenedilsulfonate})和电子耦合试剂稀释与磷酸盐缓冲液。WST-1可通过线粒体琥珀酸裂解四氮唑还原酶系统。这种分裂被用来作为对活细胞的测量依据。然而，已发现WST-1不能透过细胞膜，在细胞表面被还原，或在通过跨细胞膜电子传输系统(tPMET，Berridge,MVet al,Biotechnol Annu Rev,2005；11:127052)。另外，WST-1可以被细胞表面的NAD(P)H氧化酶还原(Berridge,MV,et al,Antioxid Redox Signal,2000,2:231-42,Scalett,DJ,etal,Biofactors,2004,20:199-206)本发明已发现当WST–1r与DNA转染，或干扰素，或siRNA转染以及至少一个IKK，或CK2的抑制剂或GSK3促进肿瘤细胞死亡的作用。从理论上说，JNK活化和NF-κB的活性之间的平衡决定细胞死亡或存活。长时间的JNK活化诱导细胞程序性死亡。活性氧生成诱导的JNK活化而NF-κB的活性导致抑制ROS水平(Luo,JL,et al,J.Clin.Invest,(2005)115:2625-32,Shen,HM,et al,Free Radical Biology&Medicine2006,40:928-939)。本发明发现，WST-1诱导肿瘤细胞活性氧生成，促进细胞死亡。

方法：HT1080细胞培养在可进行细胞培养的载玻片上并顺序进行pUC19质粒的转染和IKK抑制剂III的治疗。然后，一部分细胞使用荧光染料CM-H2-DCFDA标记细胞内的活性氧，然后用WST-1r 30分钟(图10-A)或另一部分细胞先用WST-1r治疗2小时，然后使用CM-H2-DCFDA活性氧(图5-b)项。结果用带有Spotlight软件的数码相机记录。人工曝光控制以保证荧光强度的可比性。

以上两个实验均记录了显著的WST–1诱导的活性氧代的生成(图5A和B)。在图8-A，IKK那些经pUC19质粒转染并应用了IKK抑制剂III,但未经WST-1r治疗的细胞也产生与IKK抑制剂III剂量依赖性的细胞活性氧生成。此结果表明，IKK抑制剂III也可引发活性氧产生。

示例6氯化锂和芹菜素(Apigenin)联合应用的协同作用，和WST–1可进一步加强此作用。

总述：LiCl是众所周知的GSK3的抑制剂，而apigenin是CK2的抑制剂。GSK3和CK2均可影响NF-κB的活性。此实验旨在检查响LiCl和apigenin联合应用以替代DNA转染的协同抑制作用。

方法：UM-SCC6细胞培养在96孔板，并分别应用1，3，10，30，100M LiCl和1，3，10，30，100M芹菜素的各种不同组合治疗24小时，然后进行WST–1r治疗。细胞存活性应用CCK8测定试剂盒测定。

数据显示，与阴性对照组相比，可见氯化锂和芹菜素剂量相关的抑制细胞生长和增加的细胞死亡。10M芹菜素和30mM LiCl联合应用可得到协同抑制作用。(图6A)条。加用WST-1进一步增强这种抑制作用(图6B型)。

示例7转染pUC19质粒协同化疗药物对UM-SCC-6细胞的杀伤作用。

UM-SCC-6细胞经分别转染pUC19DNA,pCDNA3,pUC19+pCDNA3,IKK1-KA+pUC19,IKK2-KA+pUC19,and IKK1-KA+IKK2-KA+pUC19,IKK1-KA+pCDNA3,IKK2-KA+pCDNA3,orIKK1-KA+IKK2-KA+pCDNA3,48小时，然后应用不同剂量的5－氟尿嘧啶(5-FU,图7a)或顺铂(Cis-Platinum,图7b为96或72小时)96和72小时，并于治疗72he 96小时后测定细胞生长和存活。pUC19质粒转染的细胞表现出对细胞生长和存活的最强的抑制作用。

示例8转染pUC19质粒协同化疗药物对HT1080细胞的杀伤作用

HT1080细胞经分别转染pUC19DNA,pCDNA3,pUC19+pCDNA3,IKK1-KA+pUC19,IKK2-KA+pUC19,and IKK1-KA+IKK2-KA+pUC19,IKK1-KA+pCDNA3,IKK2-KA+pCDNA3,or IKK1-KA+IKK2-KA+pCDNA3,48小时，然后应用不同剂量的化疗药96和72小时，并于治疗72和96小时后测定细胞生长和存活。

药物治疗：顺铂(Cis-Platinum)30ng/ml–3g/ml(图7D),紫杉醇(Paclitaxel)1nM–10M(图7C),5-FU 50nM-500M(data not shown),阿霉素(Doxorubicin)30nM–3.3M(数据未显示)。

结果：DNA载体转染可导致对化疗药作用不同程度的加强和协同效应。与其他DNA质粒转染相比，pUC19质粒DNA的单独转染展示了对化疗药的疗效的最强劲的协同作用。转染pUC19质粒导致化疗药物的IC50比相应的未用pUC19质粒转染的肿瘤细胞分别降低约10倍。加之，在治疗后96小时后顺铂或紫杉醇(Paclitaxel)治疗但未经pUC19质粒转染的细胞恢复生长，而转染DNA质粒的细胞，特别是单独应用pUC19质粒转染的细胞的死亡是不可逆转的，这意味着它们分别为100％的死亡。这些数据表明，这些化疗药物抑制癌细胞的生长，但不能杀死这些细胞。与转染pUC19质粒相结合可促进细胞死亡。

示例9)pUC 19转染协同无磷酸激酶活性的K44A-IKK抑制NF-κB的活性。

图1显示了同时抑制IKK1和IKK2磷酸激酶活性可协同抑制NF-κB的活性。在此实验中pUC19中被用作DNA转染载体。为审查pUC19是否在其中发挥了对抑制NF-κB的活性的协同作用，HT1080细胞分别转染不同的质粒，或共转染各种不同的组合的质粒包括：20％dominant negative IKK1-KA(K44A)and 80％pUC19,ii)20％无磷酸激酶活性的IKK2-KA(K44A)and 80％pUC19,iii)20％无磷酸激酶活性的IKK1-KA(K44A),20％无磷酸激酶活性的IKK2-KA(K44A)and 60％pUC19,iv)20％pCDNA3and80％pUC19作为阴性对照v)100％pUC19作为另一个阴性对照,以及另一组转染包括vi)20％无磷酸激酶活性的IKK1-KA(K44A)and 80％pCDNA3,vii)20％无磷酸激酶活性的IKK2-KA(K44A)and 80％pCDNA3,viii)20％无磷酸激酶活性的IKK1-KA(K44A),20％无磷酸激酶活性的IKK2-KA(K44A)and60％pCDNA3，持续72小时。在结束转染后，经过治疗的细胞用GeneSpectra包(Panomics)的裂解液裂解并测定NF-κB调控的基因的mRNA的表达水平，并以同时测量的18sRNA水平矫正，作为NF-KAPPAB的转录活性。pUC19质粒和pcDNA3转染色细胞作为对照。

结果表明相比于pCDNA3,pUC19对I B(图8A)CSN(图8B)and p100(图8C)mRNA转录水平显示出更强的抑制作用。

示例10联合应用WST和芹菜素(Apigenin)协同加强诱导肿瘤细胞死亡。

方法：UM-SCC6，MDA-MB-231，Cal27，HT1080，B6-5和A431细胞分别给与3％的WST–1r或100M芹菜素(Apigenin)或3％的WST–1r和100M芹菜素(Apigenin)，与未经处理的细胞为平行对照，DMSO作为溶剂对照，持续治疗4小时。治疗后，所有细胞换為正常培养液并继续培养24小时。细胞存活经CCK8药箱测定。

结果：与未经治疗的对照细胞相比较，联合应用WST-1R和芹菜素(Apigenin)诱导所有6个被测定的肿瘤细胞株75％至95％的细胞死亡。(图9)。

示例11芹菜素(Apigenin)和WST–1r应用治疗顺序对诱导细胞凋亡治疗的影响。

方法：UM(图)和(图)细胞按照图中及以下所示的顺序先后组合应用％和M的芹菜素(Apigenin)。未经治疗的细胞作为阴性对照。细胞存活用CCK8试剂盒性测定，并用未经治疗的细胞的测定结果矫正为相对于对照细胞的百分比(％正常阴性对照)。对照：细胞不做任何治疗，或只应用芹菜素(Apigenin)治疗，根据图中所示的剂量24小时，然后换为正常培养液继续培养24小时后测定细胞存活；Ap→WST：细胞先应用芹菜素(Apigenin)根据图中所示的剂量24小时，然后加入终浓度为10％的WST-1r 4小时后换为正常培养液继续培养24小时后测定细胞存活；WST+Ap：细胞首先应用10％的WST-1r分别和根据图中所示的剂量的芹菜素(Apigenin)4小时后换为正常培养液继续培养24小时后，测定细胞存活；.WST+Ap→Ap：细胞首先应用10％的WST-1r分别和根据图中所示的剂量的芹菜素(Apigenin)4小时后换为正常培养液并继续应用相应剂量的芹菜素(Apigenin)培养24小时后，测定细胞存活；WST→Ap：细胞首先应用10％的WST-1r 4小时后换为正常培养液并应用根据图中所示的剂量的芹菜素(Apigenin)培养24小时后，测定细胞存活。

结果显示，上述四种治疗方法均可诱导细胞死亡(图10的A，B)，但最有效的治疗顺序可能会根据特定的细胞株而异。GS+Ap→Ap从两个细胞系均显示为最佳组合顺序。

示例12WST–1r和芹菜素(Apigenin)联合应用治疗的时间历程和反应剂量关系。

方法：Cal27(C1)，HT1080(C2)和UM-SCC6(C3)细胞给与不同治疗浓度的(1％，3％和10％)WST-1r，并同时联合应用不同剂量的芹菜素(Apigenin 3，10，30和100M)持续0.5，1，2或4，然后，更换为相应浓度的芹菜素(Apigenin)继续治疗24小时后，用CCK8试剂盒测定细胞成活并用未经治疗的对照校正为其的％。

结果：结果显示，所有三个经过测定的细胞系均显示出WST–1r治疗的时间和剂量依赖的和芹菜素(Apigenin)治疗剂量依赖的细胞死亡，联合应用10％WST-1r 0.5hour和100M芹菜素apigeinin)治疗Cal27和UM-SCC6以及3％WST-1r 1hour和100M芹菜素apigeinin)治疗HT1080细胞可协同诱导细胞死亡(80％)。增加WST-1r治疗时间至4小时10％WST–1r联合应用30M芹菜素apigeinin)治疗HT1080和UM-SCC6细胞，以及联合应用30M芹菜素apigeinin)和10％WST–1r治疗Cal27细胞1小时均可将诱导细胞死亡提高到80-90％。

示例13联合应用IKK抑制剂和WST治疗对黑色素瘤细胞系的作用。

方法：SK-Mel-5和T294人黑色素瘤细胞分别应用终浓度为1％或3％的WST-1r治疗4小时，然后换用正常培养液并加入3M或10M IKK抑制剂III继续培养24个小时。然后换用正常细胞培养液再继续培养48小时后用CCK8试剂箱测定细胞存活。

结果：数据表明，3％WST-1r与10M IKK抑制剂III联合应用可协同诱导细胞死亡。

示例14IKK抑制剂III和WST–1r联合应用治疗顺序对诱导细胞凋亡治疗的影响。

方法：T294细胞按照图中下面所示的不同顺序先后分别应用3％WST–1r和3或10M的IKK抑制剂III。未经治疗的细胞作为阴性对照。细胞存活用CCK8试剂盒性测定，并用未经治疗的阴性对照细胞的测定结果矫正为相对于对照细胞的百分比(％正常阴性对照)。对照：细胞无任何治疗，或只应用IKK抑制剂III根据图中所示的剂量治疗24小时，然后换为正常培养液继续培养24小时后测定细胞存活；I3→WST：细胞先应用IKK抑制剂III根据图中所示的剂量24小时，然后加入终浓度为3％的WST-1r 4小时后换为正常培养液继续培养24小时后测定细胞存活；.WST+I3：细胞首先应用3％的WST-1r分别和根据图中所示的剂量的IKK抑制剂III治疗4小时后换为正常培养液继续培养24小时后，测定细胞存活；.WST+I3→I3：细胞首先应用3％的WST-1r分别和根据图中所示的剂量的IKK抑制剂III治疗4小时后换为正常培养液并继续应用相应剂量的IKK抑制剂III培养24小时后，测定细胞存活；WST→I3：细胞首先应用10％的WST-1r 4小时后换为正常培养液并应用根据图中所示的剂量的IKK抑制剂III培养24小时后，测定细胞存活。

结果：数据显示，.WST+I3→I3WST→I3治疗顺序可协同诱导细胞死亡(图13)。

示例15WST–1r和芹菜素(Apigenin)联合治疗诱导JNK活化。

方法：UM-SCC6细胞用WST-1r和芹菜素指定的剂量治疗4小时，然后应用测定JNK的FACE药箱(Qiogen)分别测定磷酸化的JNK和总JNK，再用总JNK将磷酸化的JNK进行矫正为磷酸化的JNK/总JNK的比值，并用crystal violet染色所得的细胞总数进行矫正，以进行比较。

结果：数据显示，UM-SCC6细胞显示出WST–1r和芹菜素剂量相关的JNK的磷酸化(图14)。联合应用WST–1r和芹菜素进一步增加JNK磷酸化。3％和10％，WST-1r与100M芹菜素联合应用治疗UM-SCC6细胞可协同诱导JNK的磷酸化。相反，10M芹菜素有抑制JNK磷酸化的作用。这一结果支持联合应用WST–1r与芹菜素可诱导JNK活化的假说。

示例16WST-1r和芹菜素，IKK抑制剂III联合应用致活性氧生成的剂量反应关系。

方法：UM-SCC6细胞用10M CM-H2-DCFDA标记15分钟，然后分别用不同剂量的WST-1r或CCK8试剂与不同剂量的芹菜素(A)或IKK抑制剂III(B)联合应用治疗4个小时。然后测定CM-H2-DCFDA标记的Ex485/Em535荧光强度用于测定ROS的生成。

结果：数据显示，WST–1r诱导产生其剂量依赖性的活性氧(ROS，图23A和B)。另一方面，4小时CCK8治疗剂量只产生低水平和非常有限的活性氧水平，且与CCK8剂量不相关。芹菜本身不能导致产生活性氧。然而，与单纯应用相应浓度的WST-1r相比，芹菜素结合应用1％和3％WST-1r的确显示芹菜剂量依赖性，有限的，但稳定的，活性氧的生成。.(图23-A)。.相反，10％的WST-1r与芹菜素联合应用导致活性氧水平的下降(图23-B)。此外，当芹菜素与CCK8结合，芹菜也可增加活性氧生成水平(图23-A)。这种效果是芹菜素剂量依赖性。

同样，单独应用IKK抑制剂III，或联合应用IKK抑制剂III和WST-1r可得到与上述情芹菜素相似的作用(图23–B)。5M IKK抑制剂III增加活性氧水平,而10M IKK抑制剂III降低活性氧水平(图23-B)。然而，IKK抑制剂III和WST-1r结合活性氧的生成与水平无影响。

示例17WST-1R和芹菜素，IKK抑制剂III联合应用所致久活性氧生成的时间历程。

方法：UM-SCC6细胞用10M CM-H2-DCFDA标记15分钟，然后分别用不同剂量的WST-1r或CCK8试剂与不同剂量的芹菜素(A)或IKK抑制剂III(B)联合应用治疗不同的时间，从15分钟至4个小时。在每一个时间点测定CM-H2-DCFDA标记的Ex485/Em535荧光强度用于测定ROS的生成。

结果：数据显示，WST-1r诱导持续增加的活性氧生成，这种增加至少持续4个小时以上(图15-B和D)，而CCK8只有诱导产生低水平的，而且是一过性的活性氧的增加(图15-A和C)。

示例18CCK8,-XTT和WST–1r与芹菜素联合应用诱导细胞死亡的作用能力。

方法：HT1080和UM-SCC6细胞联合应用10％WST–1r，CCK8或XTT与不同剂量的芹菜素进行治疗4小时，然后再换为正常生长培养基再培养24小时。细胞存活用CCK8试剂盒测定。

结果：数据显示，对HT1080和UM-SCC6细胞两个测定的肿瘤细胞株，CCK8不能至细胞死亡，而与WST-1r相比，XTT诱导细胞死亡的作用居中(图16)。

示例19比较其他四唑盐诱导细胞死亡作用的能力

方法：HT1080和UM-SCC6细胞分别应用下列之一：1mM WST-1,0.4mM WST-3,0.5mMWST-4,0.5mMWST-5，或单独应用0.12mM mPMS，或0.4mM WST-3+0.12mM mPMS,0.5mMWST-4+0.12mM mPMS,0.5mM WST-5+0.12mM mPMS，，并联合应用芹菜素进行治疗4小时。然后换为正常培养液继续培养24小时。细胞存活用CCK8试剂测定。

结果：数据显示，WST-3，WST-3+mPMS和WST-4+mPMS并与芹菜素相结合的诱导细胞死亡的作用与WST–1r的相应作用相似的效果(图17AB)。WST-1，WST-4，和WST-5单独应用没有这样的效果(Fig17A，B)。WST-3+mPMS的作用强于WST–1r诱导细胞死亡的作用。

示例20HT1080细胞mPMS至细胞死亡的剂量反应关系。

方法：HT1080细胞分别与不同浓度的mPMS,并与1mM的WST-1r及10，30或100M的芹菜素合用4小时，然后再换为正常细胞培养液再继续培养24小时。细胞存活经用CCK8试剂盒测定。1mM WST-1，0.12mM的MPM和10％WST–1r作为平行对照。

结果：数据显示，mPMS和芹菜素分别剂量依赖的细胞死亡(图18)。

图19根据各种治疗所致的细胞存活相对于芹菜素浓度制图。此图还包括各种相应的对照。数据标签：Ctrl：未经处理的阴性对照，GS：WST–1r，mPMS：1.2mM的MPM单独应用，WST-1：WST-1单独应用，1：1mMWST–1r加0.12mM mPMS，2：1mMWST–1r加0.1mM的mPMS，3：1mMWST–1r加0.08mM mPMS，4：1mM WST–1r加0.06mM的mPMS，5：1mM WST–1r加0.04mMmPMS，6：1mMWST–1r加0.02mM的mPMS。

结果:数据显示mPMS导致的其剂量依赖的细胞死亡。0.12mM的mPMS有极高细胞毒性。

与WST–1r合用可减弱其毒性。当mPMS与WST–1r和芹菜素联合应用，数据显示，mPMS和芹菜素剂量依赖的细胞死亡。0.08mM WST-1+0.12mM mPM显示类似于WST-1r所致的细胞死亡作用。1mM WST–1，0.06mM mPMS以及100M芹菜素联合应用导致100％的细胞死亡。

示例21WST3替代WST-1r与芹菜素联合应用诱导肿瘤细胞死亡。

方法：UM-SCC6，HT1080，Cal27，SK-Mel-5和HEKa细胞，单独应用WST-3，或联合应用WST-3和10或30M芹菜素4小时，然后换为正常的细胞培养液继续培养24小时。之后，用CCK8试剂盒测定细胞存活。细胞存活数据标准化为未经处理的对照细胞的百分比。

结果：数据显示，30M芹菜素(apigenin)he 50M WST-3l联合治疗的SCC6，Cal27，HT1080和SK-Mel-5肿瘤细胞显示出超过80％的细胞死亡(图20A,)。与之相反，与这些肿瘤细胞同时，经同样治疗的原代培养人鳞状上皮细胞，HEKa能耐受这种治疗。这种敏感性的差异为治疗肿瘤提供了一种可特意杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的治疗窗口。

示例22)WST-3+mPMS替代WST-1r与芹菜素组合治疗诱导细胞死亡的作用。

方法：UM-SCC6，HT1080，Cal27，SK-Mel-5和HEKa细胞，应用0.1mM WST-3加30MmPMS，或单独应用WST-3，或无治疗对照，联合应用10或30M芹菜素4小时，然后换为正常的细胞培养液继续培养24小时。之后，用CCK8试剂盒测定细胞存活。细胞存活数据标准化为未经处理的对照细胞的百分比。

结果：数据显示，经0.1mM WST-3加30M mPMS和30M芹菜素治疗的导致90％以上的UM-SCC6，HT1080，Cal27，SK-Mel-5肿瘤细胞死亡(图20B，C,D)。另一方面，与这些肿瘤细胞比较，同时进行的经同样治疗的原代培养人鳞状细胞HEKa细胞对这一治疗不敏感。这一治疗的条件，是一个肿瘤细胞特异的治疗窗口口。这种敏感性的差异为治疗肿瘤提供了一种可特异杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的治疗窗口。

示例23pUC19质粒和有根据pUC19的DNA序列演化出的siRNAs可增强紫杉醇(Paclictaxel)治疗效果。

方法：HT1080细胞转染pUC19质粒和根据pUC19的DNA序列设计的siRNAs和针对与此相应的目标基因的siRNA24小时，然后的给与3，10，30和100nM的紫杉醇治疗48小时。紫杉醇治疗后，细胞在正常细胞培养液中继续培养24至72小时。细胞存活率用CCK8试剂箱监测。每24小时测定一次。细胞存活数据用未经治疗的对照细胞标准化为其百分比。这项研究所用的siRNA包括单独应用siRNA#1,siRNA#2,siRHA#3,siRNA targeting TRPC6,SH3PXD2B,C6orf108,TTBK1,MAGI3,and TMEM182以及联合应用siRNA32+#3,and针对TRPC6,SH3PXD2B,C6orf108,TTBK1,MAGI3,and TMEM182的siRNA以及联合应用siRNA32+#3,and siRNA#1+#2+#3+#4+#5(siRNA∑1-5)。

结果：所示数据代表紫杉醇治疗后72小时的测定结果。细胞存活的数据显示，紫杉醇剂量依赖性细胞死亡和由pUC19质粒转染的和siRNA转染的进一步增强的细胞死亡(图21)。pUC19质粒转染，以及转染针对TRPC6,SH3PXD2B,C6orf108,TTBK1,MAGI3,and TMEM182的siRNA和联合转染siRNA#2+#3,和siRNA#1+#2+#3+#4+#5使紫杉醇的IC50减少超过3倍。转染siRNA#2,siRHA#3,和针对SH3PXD2B,C6orf108的siRNA使紫杉醇的IC50下降超过2.5倍。这些数据支持这一假设的pUC19质粒的DNA序列包含短片段的功能序列以攻击和干扰相应基因的表达水平和细胞功能。至少，经测试所列的这些基因(TRPC6，SH3PXD2B，C6orf108，MAGI3和TMEM182)可作为靶目标基因用于药物设计以提高化疗药物的疗效作用。在此所示的可攻击这些基因的siRNAs也可以作为一种工具用于来达到提高化疗药物的疗效作用这个目的。此外，这些综合治疗诱导肿瘤细胞死亡，而不是简单的抑制细胞生长。治疗后72小时，经过治疗的细胞不能重新生长。这一功能更增加了治疗作用的持久性。

示例24用针对TMEM182和MAGI3的siRNA替代转染pUC19质粒用于pUC19-IKK I抑制剂III–WST-1r–1的联合治疗。

方法：HT1080细胞分别转染siRNA#3，或从pUC19的DNA序列衍生的，针对MAGI3，和TMEM182设计的siRNAs，或可针对pUC19质粒所能攻击的基因的siRNA24小时，然后应用IKK抑制剂III治疗24小时，再加入WST-1r治疗4小时后，换为正常细胞培养液再继续培养24小时。每24小时用CCK8试剂箱细胞测定存活率一次。数据标准化为未经处理的对照细胞的百分比。AllStar siRNA(Qiagen)作为siRNA转染的阴性对照，pUC19质粒转染用作阳性对照。

结果：数据显示，IKK抑制剂III剂量依赖性细胞死亡。转染针对MAGI3和TMEM182的siRNA具有协同诱导细胞死亡的作用(图22)。同样，这些数据显示，攻击TMEM182和MAGI3可以提高癌症的治疗效果。

核苷酸序列和多肽的氨基酸序列

Seq ID

#1pUC19nucleotide sequence

#2TRPC6nucleotide sequence

>gi|19923256|ref|NM_004621.3|Homo sapiens transient receptorpotentialcation channel,subfamily C,member 6(TRPC6),mRNA

#3SH3PXD2B nucleotide sequence

>gi|63055058|ref|NM_001017995.1|Homo sapiens SH3and PX domains 2B(SH3PXD2B),mRNA

#4MAGI3nucleotide sequence

>gi|23097339|ref|NM_152900.1|Homo sapiens membrane associatedguanylate kinase,WW and PDZ domain containing 3(MAGIKK),transcript variant 2,mRNA

#5 TMEM182 nucleotide sequence

>gi|40255064|ref|NM_144632.2|Homo sapiens transmembrane protein 182(TMEM182),mRNA

#6 TRPC6 peptide sequence

>gi|5730102|ref|NP_004612.2|transient receptor potentialcationchannel,subfamily C,member 6[Homo sapiens]

#7 SH3PXD2B Polypeptide

>gi|63055059|ref|NP_001017995.1|SH3 and PX domains 2B[Homo sapiens]

#8 MAGI-3 membrane associated guanylate kinase,WW and PDZ domaincontaining 3Polypeptide sequence

>gi|23097340|ref|NP_690864.1|membrane-associated guanylate kinase-related 3 isoform2[Homo sapiens]

#9 TMEM182 polypeptide sequence

>gi|40255065|ref|NP_653233.2|hypotheticalprotein LOC130827[Homosapiens]

#10 siRNA1

Sense:UGA AUU CGA GCU CGG UAC CCG GGG A

Antisense:UCC CCG GGU ACC GAG CUC GAA UUC A

#11 siRNA 2

Sense:CAG GAA AGA ACA UGU GAG CAA AAG

Antisense:CUU UUG CUC ACA UGU UCU UUC CUG

#12 siRNA3

Sense:CUU UUA AAU UAA AAA UGA AGU UUU A

Antisense:UAA AAC UUC AUU UUU AAU UUA AAA G

#13 pcDNA3m

SEQ ID NO#14 C6orf108

>gi|40354200|ref|NM_199184.1|Homo sapiens chromosome 6 open readingframe 108(C6orf108),transcript variant 2,mRNA

SEQ ID NO#15 C6orf108

>gi|40354201|ref|NP_954653.1|putative c-Myc-responsive isoform2[Homosapiens]

Claims (3)

1.一种能够改变、干扰、抑制SEQ ID NO:8所示TMEM182活性的合成的siRNA，其序列如SEQ ID NO:12所示。

2.一种治疗人纤维肉瘤的药物组合物，该药物组合物包括SEQ ID NO:12所示的siRNA和紫杉醇；或者该药物组合物包括SEQ ID NO:12所示的siRNA、IKK抑制剂Ⅲ与WST-1r。

3.一种如SEQ ID NO:12所示的siRNA在制备治疗人纤维肉瘤的药物组合物中的应用，该药物组合物中化疗药物为紫杉醇；或者该药物组合物中化疗药物为IKK抑制剂Ⅲ与WST-1r。

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