CN115386579A - 一种与谷氨酰胺合成酶基因相关的癌症治疗药物 - Google Patents

一种与谷氨酰胺合成酶基因相关的癌症治疗药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与谷氨酰胺合成酶基因相关的癌症治疗药物，属于基因治疗技术领域；本发明一方面公开了分离的GS基因在筛选癌症的治疗/改善药物方面的用途，另一方面公开了分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含靶向GS基因、并敲低GS基因表达的双链RNA和/或shRNA；并且，进而构建了GS基因的干扰核酸的表达载体、基于该表达载体的病毒、包含该病毒的药物组合物，以及它们在癌症治疗/改善药物方面的用途，特别是提高癌细胞对于具有抑制细胞有丝分裂作用的化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的敏感性方面的用途，能够联合化疗或放疗及其药物，提高化疗或放疗的疗效，未来有可观的临床应用前景。

Description

一种与谷氨酰胺合成酶基因相关的癌症治疗药物
技术领域
本发明涉及一种与谷氨酰胺合成酶基因相关的癌症治疗药物，属于基因治疗技术领域。
背景技术
谷氨酰胺，作为血浆中含量最丰富的氨基酸，是细胞生长和分裂时重要的生物合成原料，为诸如氨基酸、脂肪酸、核苷酸、己糖胺等必需代谢物的生物合成提供氮源和碳源。此外，谷氨酰胺还有助于能量产生和氧化还原平衡。
因此，谷氨酰胺代谢，不仅在正常细胞生长中发挥重要作用，对于支持肿瘤细胞的快速生长和存活也至关重要。
已有研究表明，积极增殖的肿瘤细胞会增加对细胞外谷氨酰胺的摄取和依赖。瘤内血管系统，以及肿瘤细胞周围的成纤维细胞都是肿瘤细胞重要的谷氨酰胺来源。并且，为了适应对谷氨酰胺消耗的高需求，肿瘤细胞通常还会过表达谷氨酰胺转运蛋白。
尽管肿瘤微环境(tumour microenvironment，TME)中有多种谷氨酰胺来源，但相当一部分的肿瘤细胞还是能够通过谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，简称GS)，以谷氨酸和氨基为底物，从头合成谷氨酰胺。在多种细胞生长因子和致癌信号因子的驱动下，谷氨酰胺合成酶通常在肿瘤细胞中过表达。因此，部分研究学者们认为：谷氨酰胺合成酶是通过谷氨酰胺合成代谢(glutamine anabolism)来促进肿瘤细胞的生长(van der Vos,K.E.et al.2012；Yuneva,M.O.et al.2012；Bott,A.J.et al.2015；Cox,A.G.et al.2016；Adebayo Michael,A.O.et al.2019)。
然而，谷氨酰胺的分解代谢(glutamine catabolism)——将谷氨酰胺脱氨基分解为谷氨酸和其他代谢物的过程，在许多癌症类型中也经常处于过度活跃的状态。举例来说，谷氨酰胺酶(glutaminase，简称GLS)，将谷氨酰胺转化为谷氨酸的酶，通常在肺癌、肝癌和乳腺癌中过表达(Wang,J.B.et al.2010；Gao,P.et al.2009；Thangavelu,K.et al.2012；Lukey,M.J.et al.2019；Daemen,A.et al.2018；Lee,J.S.et al.2016；Yu,D.et al.2015)。
肿瘤细胞同时过表达GS和GLS会导致谷氨酰胺的合成代谢和分解代谢同时增强，而这样的改变将会使谷氨酰胺代谢进入无效循环。这一自相矛盾的现象，让本领域研究学者们感到困惑，并由此提出了关于肿瘤细胞代谢的一个重要的疑问：肿瘤细胞如何动态且差异地调节GS和GLS来重构谷氨酰胺合成/分解代谢过程以维持恶性细胞生长？
恶性增殖细胞通常表现出对谷氨酰胺分解代谢的高度依赖，利用胞外的谷氨酰胺进行谷氨酰胺分解代谢以促进肿瘤细胞的增殖；因此，本领域有尝试着将谷氨酰胺酶GLS作为潜在的癌症治疗靶标，并开发合适的谷氨酰胺酶GLS抑制剂以用于癌症的临床治疗。
谷氨酰胺合成酶GS介导的是谷氨酰胺分解代谢的逆过程。基于现有技术的理论水平，本领域研究学者们认为谷氨酰胺合成酶GS主要在胞外谷氨酰胺不足时，通过其代谢酶活性促进肿瘤细胞的存活和生长。
此外，也有研究发现GS以依赖于催化活性(catalytic activity-dependent)、但不依赖于谷氨酰胺合成(glutaminesynthesis-independent)的方式，通过增强血管内皮的细胞迁移来促进小鼠的血管生成(Eelen,G.et al；2018)；这表明GS可能在其常规功能之外，还参与了其他细胞过程。
到目前为止，氨酰胺合成酶GS在人类肿瘤发展过程中的确切作用及其潜在机制仍不清楚。
发明内容
基于现有技术理论，谷氨酰胺合成酶(GS)通常被认为是通过谷氨酰胺合成代谢来促进癌细胞的存活和生长。
然而，本发明的发明人意外发现，在胞外谷氨酰胺充足的情况下，GS降低其酶催化活性，并以不依赖其代谢酶活性功能的方式控制有丝分裂进程来促进癌细胞增殖；当胞外谷氨酰胺充足时，敲降GS能够抑制癌细胞的增殖和体内肿瘤的生长，但抑制GS的酶活性功能没有这方面的效果。
发明人在进一步研究的过程中揭示了上述意外发现背后的机制：GS通过不依赖于代谢酶活性的方式，直接与NUP88相互作用，从而减少NUP88与CDC20的结合，以使得CDC20能够与CDC27正常相互作用，继而保障了CDC20介导的APC/C复合物的正常活化，并驱动有丝分裂从中期到后期的转换。相反的，敲降GS，会导致多种癌细胞系、原代细胞、患者来源的类器官和移植瘤的有丝分裂停滞和多核化。具体的，导致细胞分裂从中期到后期的延迟，阻碍APC/C介导的肿瘤细胞有丝分裂和细胞周期进程。并且，发明人在进一步探究的过程中发现，敲降GS能够增加癌细胞对于具有抑制细胞有丝分裂作用的化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的敏感性，提高化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的疗效。
由此，本发明第一方面提供了分离的谷氨酰胺合成酶基因或谷氨酰胺合成酶在筛选癌症的治疗/改善药物方面的用途。
所述的“分离的谷氨酰胺合成酶基因或谷氨酰胺合成酶在筛选癌症的治疗/改善药物方面的用途”包括：将分离的谷氨酰胺合成酶基因或谷氨酰胺合成酶作为靶标应用于筛选癌症的治疗/改善药物。
具体来说，将分离的谷氨酰胺合成酶基因或谷氨酰胺合成酶作为作用的对象/靶标，对药物进行筛选，以找到可以抑制GS基因表达的药物作为治疗/改善癌症的候选药物。如本发明所述的敲降GS基因的siRNA和shRNA等都是以GS基因为对象筛选获得的，可以作为治疗/改善癌症的候选药物；此外，小分子化学药、抗体药、多肽或蛋白等也可以将GS基因或其蛋白作为作用靶标。
所述治疗/改善癌症的药物为能够特异性抑制GS基因的转录或翻译，或者能够特异性抑制GS基因的表达的分子，从而降低癌细胞中GS基因的表达水平，达到治疗/改善癌症的目的。
所述治疗/改善癌症的药物的施用剂量为足够降低GS基因的转录或翻译，或者足够降低GS基因的表达的剂量。优选的，所述GS基因的表达至少被降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
通过分离的谷氨酰胺合成酶基因或谷氨酰胺合成酶筛选获得的癌症的治疗/改善药物可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述双链RNA(dsRNA)或者短发夹RNA(shRNA)含有GS基因的启动子序列、编码区序列、5’-非翻译区序列以及3’-非翻译区序列的信息。
优选的，所述双链RNA(dsRNA)为小干扰RNA(siRNA)。所述小干扰RNA包含相互互补形成RNA二聚体的第一链和第二链；所述第一链的序列与所述GS基因中的15-27个连续的核苷酸序列(靶序列)相同或基本相同。所述siRNA能够特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性敲降GS基因的表达。
所述GS基因中的靶序列即为：当所述siRNA特异性敲降GS基因表达时，与所述的siRNA互补结合的mRNA片段所对应的GS基因中的片段。
优选的，所述GS基因为来源于人的GS基因。
优选的，所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、肠癌、鼻咽癌或皮肤癌。
优选的，所述用途为筛选提高癌细胞对于化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的敏感性的药物方面的用途；所述化疗、化疗药物、放疗或放疗药物具有抑制细胞有丝分裂的作用。
本发明第二方面提供了一种治疗/改善癌症的分离的核酸分子，其中，所述分离的核酸分子包含靶向谷氨酰胺合成酶基因、并敲降谷氨酰胺合成酶基因的表达的双链RNA和/或shRNA。
优选的，所述双链RNA中含有能够在严谨条件下与GS基因杂交的核苷酸序列。
优选的，所述shRNA中含有能够在严谨条件下与GS基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含相互互补形成RNA二聚体的第一链和第二链；所述第一链的序列与所述GS基因的靶序列相同或基本相同。较优选的，所述双链RNA为siRNA(小干扰RNA)。更优选的，所述siRNA是以GS基因序列为靶序列进行RNA干扰序列设计而获得的。
进一步的，所述shRNA包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环片段，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与所述GS基因的靶序列相同或基本相同。更优选的，所述shRNA的正义链片段和反义链片段是以GS基因序列为靶序列进行RNA干扰序列设计而获得的。所述shRNA在细胞内经过酶切加工变成siRNA，进而起到特异性敲低GS基因表达的作用。
所述GS基因中的靶序列即为：当所述siRNA特异性敲降GS基因表达时，与所述的siRNA互补结合的mRNA片段所对应的GS基因中的片段。
优选的，所述靶序列是指GS基因中15-27个连续的核苷酸序列；较佳的，所述靶序列是指GS基因中19-23个连续的核苷酸序列；更佳的，所述靶序列是指GS基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列。
优选的，所述GS基因为来源于人的GS基因。更优选的，所述GS基因的靶序列为如SEQ ID NO：1～13中任一序列所示。
为获得针对人GS基因的双链RNA或shRNA，从NCBI查询获得人GS基因编码区(CDS区)的mRNA序列，运用软件设计特异性敲低人GS基因的siRNA干扰序列，并按照评分高低筛选。经发明人筛选，选取了如SEQ ID NO：1～13中任一序列所示的人GS基因的靶序列。
本发明第三方面提供了一种表达载体，其包含编码如上述shRNA的基因片段，并且所述表达载体能够表达所述shRNA，或者，所述表达载体包含编码上述双链RNA的基因片段，并且所述表达载体能够表达所述双链RNA。
上述表达载体可以为GS基因的干扰核酸的表达载体，将编码上述shRNA或双链RNA的基因片段克隆到已知载体中获得的。优选的，已知载体可以为慢病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体等。
优选的，所述的GS基因的干扰核酸的表达载体为重组病毒载体，是通过将编码上述shRNA或双链RNA的基因片段克隆入病毒载体的编码区而形成的；所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体中任意一种。
所述的GS基因的干扰核酸的表达载体，经过病毒包装后成为有感染力的病毒颗粒，感染癌细胞，进而转录出上述的shRNA或双链RNA，shRNA再在细胞中经过酶切加工等步骤，成为siRNA，最终实现特异性敲降GS基因的表达。
更优选的，所述的GS基因的干扰核酸的表达载体还含有启动子序列和/或编码细胞中可被检测到的标记物的核苷酸序列；所述可被检测的标记物，例如绿色荧光蛋白(GFP)。
更优选的，所述的GS基因的干扰核酸的表达载体是通过将编码上述shRNA或双链RNA的基因片段插入慢病毒载体的两端ITR序列之间的编码区而得到的慢病毒载体。
所述“慢病毒载体”，可以为pLKO、pSIH1、pLL3.7、pLenti以及pGIPZ等。
更优选的，所述的GS基因的干扰核酸的表达载体是通过将编码上述shRNA或双链RNA的基因片段插入腺相关病毒载体的两端ITR序列之间的编码区而得到的重组腺相关病毒载体。
所述“腺相关病毒载体”，可以为血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，也可以为这些血清型衍生的嵌合AAV，例如AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8等。
在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应。在本发明的优选实施方案中，腺相关病毒载体是血清型AAV2或5载体。更优选的，所述腺相关病毒载体为血清型AAV2载体。
本发明第四方面提供了一种病毒，其中，所述病毒是通过将病毒包装体系转染真核细胞所获得；所述病毒包装体系包含上述的表达载体。
在本发明的一个具体实施方案中，所述病毒包装体系为腺相关病毒包装体系，其包含上述的含有GS基因干扰核酸的重组腺相关病毒载体、腺相关病毒的包装质粒和腺相关病毒的辅助质粒。
在本发明的一个优选实施方案中，所述病毒包装体系采用三质粒系统的腺相关病毒包装体系，其包括包装质粒pAAV-RC(含有AAV2外壳蛋白基因)、辅助质粒pHelper(含有能帮助AAV复制的基因)和上述的含有GS基因干扰核酸的重组腺相关病毒载体。
所述腺相关病毒包装体系转染真核细胞，经病毒包装获得腺相关病毒。该腺相关病毒通过感染癌细胞，并转录出上述的shRNA，经酶切加工成siRNA，最终实现特异性敲低GS基因的表达。
在本发明的一个具体实施方案中，所述病毒包装体系为慢病毒包装体系，其包含上述的含有GS基因干扰核酸的重组慢病毒载体、慢病毒的包装质粒和辅助质粒。
在本发明的一个优选实施方案中，所述病毒包装体系采用三质粒系统的慢病毒包装体系，其包括包装质粒pSPAX2、辅助质粒pMD2.G和上述的含有GS基因干扰核酸的重组慢病毒载体。
所述慢病毒包装体系转染真核细胞，经病毒包装获得慢病毒。该慢病毒通过感染癌细胞，并转录出上述的shRNA或双链RNA，shRNA经酶切加工成siRNA，最终实现特异性敲降GS基因的表达。
本发明第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述病毒，以及药学上可以接受的载体或赋形剂。
进一步的，所述药物组合物包含1～99％wt的所述病毒，以及药学上可以接受的载体或赋形剂。
在对药物组合物进行制备/制剂时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或者被包在药物载体中。所述药物组合物可以为注射剂型、片剂、丸剂、粉剂、胶囊剂或口服液体剂(如糖浆剂等)。优选的，采用注射剂型。
在本发明的一个优选实施方案中，所述药物组合物还包含具有抑制细胞有丝分裂作用的药物。
上述的病毒，可以与具有抑制细胞有丝分裂作用的药物组合/联合使用。
在本发明的一个更优选实施方案中，所述具有抑制细胞有丝分裂作用的药物为抗微管药物，或者，所述具有抑制细胞有丝分裂作用的药物为抑制关键代谢酶活性的药物，所述关键代谢酶为促进有丝分裂进程的关键代谢酶。
更优选的，所述抗微管药物选自紫杉醇、长春新碱或长春碱中的任意一种或几种。
在本发明的一个更优选实施方案中，所述抑制关键代谢酶活性的药物为谷氨酰胺酶抑制剂。
在本发明的一个优选实施方案中，所述药物组合物还包含谷氨酰胺合成酶抑制剂。
本发明第六方面提供了上述表达载体，或者上述的病毒，或者，如上述的药物组合物在制备癌症的治疗/改善药物方面的用途。
上述的病毒或药物组合物，可以用于治疗/改善癌症，包括将有效剂量的所述病毒或药物组合物施用于对象。采用该治疗/改善癌症的方法，所述对象癌细胞中的GS基因表达被敲降。进一步的，所述GS基因表达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％被敲降。
所述对象可以为人。
优选的，所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、肠癌、鼻咽癌或皮肤癌。
在本发明的一个优选实施方案中，所述用途为制备提高癌细胞对于化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的敏感性的药物方面的用途；所述化疗、化疗药物、放疗或放疗药物具有抑制细胞有丝分裂的作用。
有效剂量的上述病毒或药物组合物，可以与化疗或放疗组合/联合，例如，可以在化疗或放疗之前或之中，施用于对象，以提高对象的癌细胞对于化疗或放疗的敏感性，从而提高化疗或放疗的疗效。
有效剂量的上述病毒或药物组合物，可以与化疗药物或放疗药物组合/联合使用，以提高对象的癌细胞对于化疗药物或放疗药物的敏感性，从而提高化疗或放疗的疗效。
在本发明的一个更优选实施方案中，所述化疗为微管靶向化疗。
在本发明的一个更优选实施方案中，所述化疗药物为抗微管药物。
应当理解的，在本发明保护范围内，本发明的上述各项技术个特征和下文实施例中具体描述的各项技术特征可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不做一一累述。
附图说明
图1为经本发明实施例的慢病毒溶液处理的多个人类癌细胞系的蛋白质印迹实验结果；
图2为经本发明实施例的慢病毒溶液处理的多个小鼠癌细胞系的蛋白质印迹实验结果；
图3为经本发明实施例的慢病毒溶液处理的多个人类癌细胞系的细胞增殖定量实验结果；
图4为经本发明实施例的慢病毒溶液处理的多个人类癌细胞系和多种小鼠癌细胞系的细胞集落定量实验结果；
图5为经本发明实施例的慢病毒溶液处理的类器官增殖的定量实验结果；
图6为经本发明实施例的慢病毒溶液处理的多个人类癌细胞系的皮下肿瘤生长定量实验结果；
图7为原位植入的Huh7肿瘤的生长定量实验结果；
图8为抑制GS的酶活性的细胞增殖定量实验结果；
图9为抑制GS的酶活性的细胞集落定量实验实验结果；
图10为抑制GS的酶活性的肿瘤生长的定量实验结果；
图11为经本发明实施例的慢病毒溶液处理的多个人类癌细胞系的G2/M期的细胞统计结果；
图12为经本发明实施例的慢病毒溶液处理的多个癌细胞系中多倍体细胞数量统计结果；
图13为本发明实施例的慢病毒溶液，结合GS-WT过表达、GS-R324C过表达的慢病毒溶液处理的多个人类癌细胞系的多核细胞数量统计结果；
图14～16为经本发明实施例的慢病毒溶液和化学药物(紫杉醇、长春新碱和诺考达唑)处理的多个人类癌细胞系的细胞存活能力结果；
图17～19为经本发明实施例的慢病毒溶液和化学药物(紫杉醇、长春新碱和诺考达唑)处理的两种原代NSCLC细胞的细胞存活能力结果；
图20为经本发明实施例的慢病毒溶液和化学药物(紫杉醇、长春新碱和诺考达唑)处理的2个类器官的细胞存活能力结果；
图21为在小鼠的H460肿瘤模型中，采用本发明实施例的慢病毒溶液与紫杉醇联合治疗的肿瘤生长定量实验结果；
图22为在人NSCLC细胞ZL13的肿瘤模型中，采用本发明实施例的慢病毒溶液与紫杉醇联合治疗的肿瘤生长定量实验结果；
图23为接受化疗的NSCLC患者的GS表达与患者对化疗的反应的相关性结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的保护范围，本发明也并不限于这些具体实施方式。
下面实施例和效果数据部分所用到的细胞系，除KP细胞购自中国科学院细胞库以外，其他均获自ATCC。所有细胞系均在补充有10％胎牛血清(HyClone)和100单位/ml青霉素/链霉素的DMEM或RPMI 1640培养基中于37℃下在含有5％CO2的湿润气氛中培养。
癌组织芯片由浙江大学医学院附属第一医院提供。所有患者都提供了样本收集和分析的书面知情同意书。
下述效果数据部分所用到的实验动物，均按照浙江大学医学院附属第一医院批准的指导方针进行护理，以下皆同。
其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的分子克隆实验室手册中所述条件，或者按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，百分比和份数均按照重量来计算。
下述效果数据部分，均采用Windows版Prism 8.0进行统计分析。数据表示为平均值±s.e.m。如果没有特别说明，n代表每个实验中使用的小鼠数量、用细胞进行的生物学独立实验的数量，或在延时实验中分析的细胞总数，如图例所示，除非另有说明。所有结果，包括WB，都代表至少三个独立实验(患者衍生的类器官实验除外)。统计学上的显着差异通过t检验、Mann-Whitney检验、双向方差分析、χ2检验或对数秩检验(在适当情况下)确定，并定义为p<0.05。样本大小和统计分析的细节在相应的图表中指定。当样本量小于5时，假设自变量为正态分布，则应用t检验。应用F-test检验样本方差的相等性。当样本总体具有相同的标准偏差时，使用未配对的双尾t检验；当样本总体不具有相同的标准偏差时，使用带有Welch校正的未配对双尾t检验。当样本量大于5时，如果数据服从正态分布，则使用未配对的双尾t检验；如果数据不服从正态分布，则使用Mann-Whitney检验。应用双向方差分析来比较体外药物治疗多剂量的差异。χ2检验用于比较两组比值的差异。对数秩检验用于生存分析。
实施例
1、靶向谷氨酰胺合成酶基因的干扰序列的设计和筛选
从NCBI查询获得人类的谷氨酰胺合成酶基因的编码区(CDS区)的mRNA序列(参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2752)，运用软件选取了多个合适的靶序列，并通过细胞水平的敲降效果验证选取了如下13个合适的靶序列：
靶序列1(SEQ ID NO：1)：GCACACCTGTAAACGGATAAT
靶序列2(SEQ ID NO：2)：CACACCTGTAAACGGATAATG
靶序列3(SEQ ID NO：3)：GCATCGTGTGTGTGAAGACTT
靶序列4(SEQ ID NO：4)：CCAGGAGAAGAAGGGTTACTT
靶序列5(SEQ ID NO：5)：GACCCTAACAAGCTGGTGTTA
靶序列6(SEQ ID NO：6)：AGGAGAAGAAGGGTTACTTTG
靶序列7(SEQ ID NO：7)：TTCGATGGCTCTAGTACTTTA
靶序列8(SEQ ID NO：8)：GCCATGTATATCTGGATCGAT
靶序列9(SEQ ID NO：9)：ATAACCACTGCTTCCATTTAA
靶序列10(SEQ ID NO：10)：GAAAGTCCAGGCCATGTATAT
靶序列11(SEQ ID NO：11)：GGCTCTAGTACTTTACAGT
靶序列12(SEQ ID NO：12)：CCAGGGTCCATATTACTGT
靶序列13(SEQ ID NO：13)：GTCTGAAGTACATCGAGGA
发明人根据上面的靶序列设计了靶向人类的谷氨酰胺合成酶基因的siRNA干扰序列，并通过细胞水平的敲降效果的验证，最后筛选了下面2个siRNA(siRNA-GS-1～2)序列，参见下表1：
表1
Figure BDA0003412318830000111
发明人对上述的2个siRNA-GS-1～2，并设计了合适的茎环片段序列(在本实施例中，茎环片段对应的DNA序列为：CTCGAG)，由此获得与之对应的2个shRNA(shRNA-GS-1～2)。
shRNA-GS-1～2的正义链即为对应的siRNA-GS-1～2的正义链，shRNA-GS-1～2的反义链即为对应的siRNA-GS-1～2的反义链，具体不再赘述。
发明人设计了扩增shRNA-GS-1～2对应的DNA片段的引物序列(引入了SmaI酶切位点)，发送至上海生工生物技术有限公司进行人工合成；再将合成的单链引物进行退火粘连处理获得带有粘性末端的双链oligo序列。
同样地，发明人设计了靶向小鼠的谷氨酰胺合成酶基因的siRNA干扰序列，并筛选了下面2个siRNA(siRNA-mGS-1～2)序列，参见下表2：
表2
Figure BDA0003412318830000121
由此获得与siRNA-mGS-1～2对应的shRNA-mGS-1～2，并合成了shRNA-mGS-1～2对应的双链oligo序列。
2、构建敲降谷氨酰胺合成酶基因的重组质粒
获取待克隆插入的干扰片段：采用SmaI内切酶(购自NEB公司的酶切体系)对上述获得的shRNA-GS-1～2和shRNA-mGS-1～2对应的双链oligo序列进行酶切，获得待克隆插入的干扰片段(DNA片段)；
空载体采用pLKO-puro/PLKO-blast(慢病毒载体)，并进行SmaI内切酶。
酶切体系及其具体操作，以及清洁回收等操作参见说明书，不再赘述。
关于构建重组质粒的基本操作：连接(通过T4连接酶连接上述待克隆插入的干扰片段与经酶切的空载体)、连接产物转化感受态细胞、提取重组质粒并鉴定，将测序比对正确的重组质粒进行扩增、提取和纯化等均采用常规实验操作，具体不再赘述。
发明人从细胞水平验证了所设计的多个shRNA-GS和shRNA-mGS的敲降效果；其中，靶序列1-13对应的shRNA-GS的重组质粒都具有敲降效果，其中敲降效果最佳的是shRNA-GS-1～2的重组质粒，即命名为特异性敲降人类谷氨酰胺合成酶基因的敲降质粒shGS-1～2。
靶向小鼠小鼠的谷氨酰胺合成酶基因的干扰序列的重组质粒中，shRNA-mGS-1～2的重组质粒的敲降效果最佳，即命名为特异性敲降小鼠谷氨酰胺合成酶基因的敲降质粒shmGS-1～2。
对照组的敲降质粒(以下也称shScram)是通过将一个无干扰活性(无对应的靶点)的shRNA插入上述的慢病毒空载体而获得。
3、含有上述敲降质粒的慢病毒的制备
本实施例采用的慢病毒包装体系包括两个包装辅助质粒pSPAX2和pMD2.G，以及上述的敲降质粒(shGS-1～2、shmGS-1～2)。
采用该慢病毒包装体系共转染293T细胞，来制备含有上述的敲降质粒的慢病毒溶液，经超滤(0.45μm，Millipore SLHA033SS)和浓缩，获得本实施例的慢病毒的溶液，即含有敲降质粒shGS-1～2、shmGS-1～2的慢病毒的溶液，或者表述为：表达shRNA-GS-1～2、shRNA-mGS-1～2的慢病毒溶液。
对照组为含有上述对照组的敲降质粒shScram的慢病毒溶液。
关于慢病毒的制备，以及制备获得的慢病毒溶液的滴度和纯度的测定、完整性的鉴定等工作，均由发明人实验室按常规实验操作进行，具体不再赘述。
4.含有上述敲降质粒的腺相关病毒的制备
本实施例采用的腺相关病毒AAV2包装体系(三质粒系统)，其包括包装质粒pAAV-RC(含有AAV2外壳蛋白基因)、辅助质粒pHelper(含有能帮助AAV复制的基因)以及上述的敲降质粒shGS-1。
采用该AAV包装体系共转染293T细胞，来制备含有上述的敲降质粒的AAV溶液，经超滤(0.45μm，Millipore SLHA033SS)和浓缩，获得本实施例的AAV溶液，即含有敲降质粒shGS-1的AAV溶液，命名为AAV-shGS。
对照组为含有上述对照组的敲降质粒shScram的AAV溶液，命名为AAV-shScram。
关于腺相关病毒AAV的制备，以及制备获得的AAV溶液的滴度和纯度的测定、完整性的鉴定等工作，均由发明人实验室按常规实验操作进行，具体不再赘述。
效果数据
一、敲降GS能够抑制癌细胞增殖和肿瘤生长
发明人在研究谷氨酰胺合成酶GS基因在癌细胞生长中具体的作用以及机制的过程中，意外地发现：敲降GS能够抑制癌细胞的增殖和肿瘤的生长，但抑制GS的酶活性无法起到抑制癌细胞的增殖和肿瘤的生长的效果。具体实验研究结果如下：
(1)敲降效果的验证
将上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shGS-1～2的慢病毒溶液处理人非小细胞肺癌NSCLC细胞系(H460、SK-MES-1和A549)，以及人肝癌细胞系(Huh7)。对照组采用上述的含有对照组敲降质粒shScram的慢病毒溶液。
将上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shmGS-1～2的慢病毒溶液处理小鼠肺癌细胞系(KP)和小鼠肝癌细胞系(Hepa1-6)。对照组采用上述的含有对照组的敲降质粒shScram的慢病毒溶液。
蛋白质印记实验结果参见图1和图2，从图1和图2的结果可以明显看出，敲降质粒shGS-1～2对于各种人肺癌和肝癌细胞系的GS均具有明显的敲降效果；敲降质粒shmGS-1～2对于小鼠肺癌和肝癌细胞系的GS均具有明显的敲降效果。
蛋白质印记实验操作简述如下：具有等量蛋白质的细胞裂解物通过4％–20％或10％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)分离，转移到Immobilon转移膜(GE Healthcare LifeSciences)上，并用指定的抗体进行免疫印迹反应。所有免疫印迹均通过增强化学发光(Bio-Rad)进行可视化。
(2)抑制癌细胞增殖的实验数据
(2.1)细胞增殖定量实验
在2mM谷氨酰胺存在的培养环境下，采用上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shGS-1～2的慢病毒溶液处理人非小细胞肺癌NSCLC细胞系(H460和SK-MES-1)。对照组采用上述的含有对照组敲降质粒shScram的慢病毒溶液。
在处理后的第1、2、3、4和5天，进行细胞数计数统计(具体操作：贴壁细胞用胰蛋白酶消化，然后悬浮在细胞培养液中。然后将悬浮的细胞与台盼蓝染料(Bio-Rad，145-0013)以1:1的比例混合。利用血细胞计数器对活细胞进行计数。)。
细胞增殖定量实验结果(3次独立重复实验)参见图3；从图3可以看出，经shGS-1～2慢病毒溶液处理后的人非小细胞肺癌细胞的增殖速度显著低于对照组shScram的情况。
为了验证上述基于慢病毒溶液处理的结果，发明人还采用三条靶向GS的siRNA混合oligo序列(对应的靶序列为SEQ ID NO：11～13所示)瞬时敲降A549细胞中的GS，同样的观察到了A549细胞增殖速度的下降。
(2.2)、细胞集落定量实验
在2mM谷氨酰胺存在的培养环境下，采用上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shGS-1～2的慢病毒溶液处理人非小细胞肺癌NSCLC细胞系(H460、SK-MES-1和A549)，以及人肝癌细胞系(Huh7)。
将上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shmGS-1～2的慢病毒溶液处理小鼠肺癌细胞系(KP)和小鼠肝癌细胞系(Hepa1-6)。
对照组采用上述的含有对照组的敲降质粒shScram的慢病毒溶液。
处理后，进行细胞集落形成试验，具体操作：将来自指定细胞系的细胞(1,000或2,000)接种在6孔板中。培养10-14天后，细胞用结晶紫(0.5％结晶紫溶解在20％甲醇中)染色。对于细胞数量定量，染色的菌落计数或溶解在1％十二烷基硫酸钠(SDS)中，并通过酶标仪测量600nm处的吸光度。
细胞集落定量实验结果(3次独立重复实验)参见图4，从图4可以看出，经shGS-1～2慢病毒溶液处理后的各种人肺癌和肝癌细胞系的集落形成的数量均显著低于对照组shScram的情况；经shGS-1～2慢病毒溶液处理后的各种小鼠肺癌和肝癌细胞系的集落形成的数量均显著低于对照组shScram的情况。
(2.3)类器官增殖的定量实验
为了进一步证实敲降GS在癌细胞增殖中的作用，发明人采用上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shGS-1的慢病毒溶液处理两个来源于人类NSCLC样本的原代类器官(primary organoids)(科途医学)。对照组采用上述的含有对照组的敲降质粒shScram的慢病毒溶液。
人类NSCLC患者来源的原代类器官的培养操作，参见文献Sachs,N.et al.2019。将对照组和实验组的慢病毒溶液应用于受感染的类器官，并用嘌呤霉素选择类器官的受感染部分。选择后，将类器官接种到96孔板中进行7天增殖测定，具体的，使用Cell-Titer-Glo测定法(Promega)对类器官增殖进行定量测定。
类器官增殖的定量实验结果(4次独立重复实验)参见图5，从图5可以看出，经shGS-1慢病毒溶液处理后的两个NSCLC原代类器官的增殖量化值均显著低于对照组shScram的情况。
(3)抑制体内肿瘤生长的实验数据
(3.1)皮下肿瘤生长的定量实验
采用上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shGS-1的慢病毒溶液处理人非小细胞肺癌NSCLC细胞系(H460和A549)，通过嘌呤霉素筛选得到稳定敲降GS的细胞系。将上述细胞消化计数，按1×105个或1×106个细胞每个位点注射到裸鼠背部两侧皮下。对照组采用上述的含有对照组的敲降质粒shScram的慢病毒溶液。于注射后第10、12、14、16、18和20天，测定小鼠的皮下肿瘤体积；其中，每组H460肿瘤使用10只裸鼠，每组A549肿瘤使用6只裸鼠。
皮下肿瘤生长定量实验结果参见图6，从图6可以看出，经shGS-1慢病毒溶液处理后的H460和A549细胞，注射所形成的皮下肿瘤的体积均显著低于对照组的情况。
(3.2)原位植入的Huh7肿瘤的生长定量实验
将Luc2转导的Huh7细胞(Luc2-transduced Huh7 cells)植入裸鼠的肝脏。肿瘤细胞植入后第18天，静脉注射上述实施例第4部分获得的AAV-shGS；对照组注射AAV-shScram；每组使用9只裸鼠。通过测量荧光素酶活性来监测肿瘤生长。
原位植入的Huh7肿瘤的生长定量实验结果参见图7，从图7可以看出，注射了含有敲降质粒shGS-1的AAV溶液后，Huh7肿瘤生长的量化值(荧光量Flux)显著低于对照组的情况。
上述第一部分的实验内容，以多种癌细胞系，原代细胞，肿瘤类器官和移植瘤为研究模型，均证明了敲降GS能够抑制癌细胞的增殖和肿瘤的生长。
二、抑制GS的酶活性对癌细胞增殖和肿瘤生长的影响
图8为抑制GS的酶活性的细胞增殖定量实验结果。具体而言，在2mM谷氨酰胺存在的培养环境下，采用1mM MSO(蛋氨酸亚砜亚胺，一种抑制GS的酶催化活性的特异性抑制剂)处理H460和SK-MES-1细胞；对照组(Ctrl)采用溶剂处理；每组3次独立重复实验。
从图8可以看出，对照组(Ctrl)和处理组(MSO)的细胞增殖情况基本一致。
图9为抑制GS的酶活性的细胞集落定量实验实验结果。具体而言，在2mM谷氨酰胺存在的培养环境下，采用1mM MSO(蛋氨酸亚砜亚胺，一种抑制GS的酶催化活性的特异性抑制剂)处理H460、SK-MES-1和KP细胞；对照组(Ctrl)采用溶剂处理；每组3次独立重复实验。
从图9可以看出，对照组(Ctrl)和处理组(MSO)的细胞集落增殖情况基本一致。
图8和图9的结果证明，采用MSO处理H460和SK-MES-1细胞，抑制其GS酶活性，不影响癌细胞的增殖。
图10为抑制GS的酶活性的肿瘤生长的定量实验结果，具体的，将Luc2转导的Huh7细胞(Luc2-transduced Huh7 cells)植入裸鼠的肝脏。肿瘤细胞植入后第20天，腹腔注射MSO(20mg/Kg)，对照组注射PBS；每组使用5只裸鼠。通过测量荧光素酶活性来监测肿瘤生长。
从图10可以看出，处理组(MSO)的Huh7肿瘤生长的量化值(荧光量Flux)略低于对照组(PBS)的情况。
综合上述效果数据第一部分和第二部分的结果分析如下：
关于体外的癌细胞增殖实验，将图3与图8的结果对比、图4与图9的结果对比，可以看出，在胞外谷氨酰胺充足(2mM)的条件下，敲降GS能够显著抑制人非小细胞肺癌细胞H460和SK-MES-1细胞的增殖，然而抑制GS酶活性(MSO处理)对癌细胞的增殖没有明显影响。鉴于这些癌细胞是在谷氨酰胺充足培养基环境中培养，这说明，敲降GS与抑制GS酶活性两者对癌细胞增殖影响的差异，不应当归因于GS酶活性催化谷氨酰胺合成的过程。
体内的肿瘤生长实验也同样证明GS对肿瘤生长具有促进作用。参见图6，敲降GS显著抑制了体内肿瘤的生长。换句话说，体内肿瘤的生长也需要GS。
此外，为了更直接地比较体内敲降GS与体内抑制GS活性对于肿瘤生长的影响，我们将图7与图10的结果对比。可以看出，AAV介导的敲降GS显著地有效抑制了原位植入的Huh7肿瘤的生长，然而抑制GS酶活性(MSO处理)仅轻微影响了Huh7肿瘤的生长。
综上，上述效果数据第一部分和第二部分的结果表明：敲降GS能够抑制癌细胞的增殖和体内肿瘤的生长，但抑制GS的酶功能没有这方面的效果。
三、胞外谷氨酰胺的可利用量直接影响GS的功能转换
作为哺乳动物中唯一一种从谷氨酸产生谷氨酰胺的酶，GS的酶活性功能在谷氨酰胺有限时起到了至关重要的作用(Bott,A.J.et al.2015)。
发明人在研究中发现，当胞外谷氨酰胺被剥夺时，MSO处理(1mM)和敲降GS都能诱导细胞死亡。例如，当胞外谷氨酰胺的浓度为0mM时，无论是MSO(1mM)处理，还是采用含有敲降质粒shGS-1～2的慢病毒溶液处理H460细胞，都能够显著诱导细胞凋亡(流式细胞实验结果)。
当胞外缺乏谷氨酰胺时，癌细胞对GS催化活性的中断会变得高度敏感，即使是非常低剂量的MSO(10μM)也足以显著抑制细胞存活。
相比之下，当癌细胞在2mM谷氨酰胺环境中培养时，MSO处理不会诱导细胞死亡。
这些数据表明，当细胞外谷氨酰胺的不足时，GS的代谢酶活性功能(催化活性)是癌细胞存活所必需的；当细胞外谷氨酰胺足够时，癌细胞的存活不需要GS的催化活性。
接下来，在谷氨酰胺充足的培养条件下，发明人证明了GS的代谢活动会受到抑制，也未对肿瘤细胞生长产生影响。具体的，发明人通过15N同位素掺入和代谢物示踪实验发现：当癌细胞在谷氨酰胺充足(2mM)的培养条件下，15NH4 +掺入谷氨酰胺的情况大大减少。这说明，与谷氨酰胺缺乏的条件相比，在谷氨酰胺充足的条件下GS的催化活性显着降低。
与GS的催化活性降低情况相一致的是，当癌细胞在谷氨酰胺充足(2mM)的培养条件下，敲降GS不会改变细胞内谷氨酰胺和谷氨酸的总体水平。
再者，采用质谱法的代谢定量分析(quantitative metabolic profiling usingmass spectrometry)结果表明：敲降GS不会影响与谷氨酰胺代谢相关的主要代谢物以及其他氨基酸的水平。
谷氨酰胺分解代谢促进谷胱甘肽(GSH)合成和三羧酸循环(TCA)循环。与上面提到的敲降GS不改变细胞内谷氨酰胺和谷氨酸的总体水平的情况相一致的是，GSH、二硫化谷胱甘肽(GSSG)和包括TCA循环的组分、核苷酸和己糖胺在内的其他与谷氨酰胺分解代谢相关的生物分子的水平，都没有显着改变。
综合上述第一部分和第二部分所证明的“GS在谷氨酰胺充足条件下所起的作用”，第三部分所列出的这些结果表明在谷氨酰胺充足的情况下，GS的功能从酶依赖性、促存活转变为非酶依赖性、促增殖。
四、GS是癌细胞增殖所必需的，与其催化活性无关
为了进一步验证GS在癌细胞增殖中所起的具体作用(非代谢功能)，发明人在内源性GS-敲降的H460细胞中表达野生型(WT)GS(以下称为GS-WT)或酶催化失活的GS-R324C突变体(Haberle,J.et al.2015)。
在谷氨酰胺不足的情况下，GS-WT的回复表达能够完全逆转因内源性GS-敲降所导致的细胞存活下降，但是GS-R324C的回复表达无法做到。
与之相反的，在谷氨酰胺充足的条件下，GS-R324C和GS-WT的回复表达都能够完全逆转因内源性GS-敲降所导致的细胞增殖下降。
发明人还检测了当H460细胞在0.5mM谷氨酰胺(中等水平的谷氨酰胺)培养条件下，GS-R324C的表达所起的作用。结果表明酶催化失活的GS-R324C突变体可以部分逆转因GS-敲降所导致的细胞增殖下降；这表明在谷氨酰胺水平适中时，除了产生谷氨酰胺的作用以外，GS的非代谢功能也有助于细胞生长。
同样的，在A549和Huh7细胞中也观察到GS-R324C的回复表达对细胞增殖的促进作用。
与上述的发现相一致的是，敲降GS抑制H460细胞在小鼠体内的生长，但是GS-WT和GS-R324C的回复表达都能够逆转肿瘤生长下降的情况。类似的，在Huh7细胞的异种移植模型中也观察到了GS-WT和GS-R324C的回复表达能够逆转敲降GS所导致的体内肿瘤生长下降的情况。
综上，第四部分所列出的这些结果表明GS的非代谢酶活性是癌细胞增殖和体内肿瘤生长所必需的。
综合上述第三和第四部分的内容，发明人进一步总结分析认为：GS通过其所具有的双重功能来支持营养丰富或贫乏的肿瘤微环境(Tumor Microenvironment，TME)中的肿瘤细胞存活和增殖。具体来说，不同于一般的血浆环境(谷氨酰胺浓度保持相对恒定)，肿瘤微环境中的谷氨酰胺浓度情况较为复杂。在肿瘤组织的边缘区域，由于靠近血管，其谷氨酰胺通常维持在相对较高水平。在这一区域，GS可以通过非酶活性功能确保适当的有丝分裂并促进快速的癌细胞增殖。相比之下，在肿瘤核心区域，由于谷氨酰胺的浓度受到限制，肿瘤细胞更依赖GS的代谢酶活性来实现谷氨酰胺的从头合成。GS的双重功能能赋予肿瘤细胞更强的应对TME中谷氨酰胺浓度波动的影响，进而支持癌细胞的存活和增殖。
并且，上述第四部分也证明了，当细胞外谷氨酰胺水平保持在中等水平时，GS的酶依赖性(代谢酶活性)和非酶依赖性功能(非代谢酶活性)都是癌细胞生长所必需的。
因此，本领域技术人员在现有技术的基础之上，并获知上述第三和第四部分所揭示的技术启示后，可以合理推测到，将“敲降GS的方式”与“抑制GS的酶活性”的方式组合/联合应用于癌症的治疗/改善，例如将敲降GS的药物与谷氨酰胺合成酶抑制剂进行组合/联合以应用于癌症的治疗/改善。
五、GS控制有丝分裂进程以调节细胞增殖
为了阐明GS介导的细胞增殖背后的机制，发明人进行了细胞周期分析，发现敲降GS导致G2/M期细胞数量增加。
具体的，在2mM谷氨酰胺存在的培养环境下，采用上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shGS-1～2的慢病毒溶液处理人非小细胞肺癌NSCLC细胞系(H460、SK-MES-1和A549)，并统计处于G2/M期的细胞百分比。对照组采用上述的含有对照组的敲降质粒shScram的慢病毒溶液。每组3次独立重复实验。
G2/M期的细胞统计结果参见图11，可以看出，经shGS-1～2慢病毒溶液处理后的人非小细胞肺癌细胞处于G2/M期的细胞百分比，显著高于对照组shScram的情况。该结果表明GS是有丝分裂进展所必需的。
与上述结果一致地，发明人还发现了：GS敲降使得细胞周期蛋白B1(一种G2/M特异性细胞周期蛋白)的表达水平上调；但是，GS-WT或GS-R324C的回复表达能够显著抑制GS-敲降H460细胞中的G2/M延迟和细胞周期蛋白B1的累积；这说明GS调节G2/M进程，不依赖其催化活性。
之后，发明人应用了基于H2B-GFP标记的活细胞成像方法来研究有丝分裂过程中具体哪一步受GS敲降的影响。最终发现，GS表达的减少会导致有丝分裂从中期到后期转变的停滞，由此延长了有丝分裂的进程；但是，WT或GS-R324C的回复表达能够有效地恢复延迟的有丝分裂进程。
此外，发明人还发现，GS敲降虽然影响有丝分裂的持续时间，但不会引起有丝分裂过程中染色体分离的明显变化。
有丝分裂停滞之后，癌细胞可以通过称为有丝分裂滑移(mitotic slippage)的过程恢复细胞周期，这一过程会随之导致细胞凋亡或多倍体。虽然敲降GS没有改变癌细胞的存活率(凋亡细胞数量没有发生显著改变)，但敲降GS诱导了多个癌细胞系中多倍体细胞(DNA含量>4n)的激增，参见图12。
类似的，敲降GS导致多核细胞数量增加了3倍，而GS-WT或GS-R324C的回复表达完全解除了这种异常，具体参见图13。
体内研究结果与上述的体外研究结果基本一致。敲降GS导致H460肿瘤的多核化，而GS-WT或GS-R324C的回复表达可以减弱这些缺陷。
综上，第五部分所列出的这些结果表明GS以独立于其酶活性的方式控制有丝分裂进程，敲降GS导致G2/M的延迟，导致有丝分裂从中期到后期转变的停滞，由此延长了有丝分裂的进程。
鉴于以上揭示的GS与细胞有丝分裂进程之间的关联性，本领域技术人员可以合理推测到：将“敲降GS的方式”与“其他抑制细胞有丝分裂的方式”组合/联合应用于癌症的治疗/改善，例如将敲降GS的药物，与具有抑制细胞有丝分裂的药物组合/联合应用于癌症的治疗/改善。
此外，GS与细胞有丝分裂进程之间的关联性也引发了发明人对于其他与有丝分裂直接相关的代谢酶的思考。
众所周知，细胞分裂在很大程度上依赖于充足的营养供应，因此细胞代谢在细胞周期进程中起着至关重要的作用。例如，在细胞有丝分裂G1-S期过渡期间，糖酵解被激活并且是满足G1期晚期检查点所必需的，而阻断糖酵解或降低葡萄糖供给会阻碍细胞通过该限制点。此外，由GLS介导的谷氨酰胺分解代谢在G1-S期和S-G2/M期转化过程中被活化，并对这些过程的正常进行不可或缺。这是因为谷氨酰胺分解代谢所产生的代谢物是合成细胞分裂所需大分子的必需底物。
因此，本领域技术人员在现有技术的基础之上，并结合上述第五部分所揭示的技术启示，可以合理推测到，将“敲降GS的方式”与“抑制关键代谢酶(促进有丝分裂进程的关键代谢酶)的活性”的方式组合/联合应用于癌症的治疗/改善，例如，将敲降GS的药物与谷氨酰胺代谢酶抑制剂进行组合/联合以应用于癌症的治疗/改善。
六、GS与NUP88直接作用以确保有丝分裂的进程
为了明确GS调节细胞有丝分裂的分子机制，发明人利用免疫共沉淀(co-IP)偶联蛋白质组学技术对GS的结合蛋白进行了分析。分析结果显示，包括NUP88、NUP214、RAE1和NUP98在内的几种核孔复合蛋白能够有效地被免疫共沉淀下来。
尽管这些核孔复合蛋白的典型作用是维持核孔的完整性和功能，但它们已被证明可确保APC/C(一种E3泛素连接酶)在有丝分裂期间具有适当的活性(Ibarra,A.&Hetzer,M.W,2015)。因此，NUP88、RAE1、NUP98的异常调节导致了包括多核化和非整倍体在内的有丝分裂缺陷(Hashizume,C.,Nakano,H.,Yoshida,K.&Wong,R.W.2010；Blower,M.D.,Nachury,M.,Heald,R.&Weis,K.2005)，其表型与敲降GS导致的细胞缺陷高度相关。
特别是，由于NUP88的过表达已被证明能够促进肿瘤生长，NUP88与癌症的发展和恶化密切相关(Naylor,R.M.,Jeganathan,K.B.,Cao,X.&van Deursen,J.M.2016)。因此，发明人决定跟进NUP88与GS的潜在相互作用，并研究这种相互作用是否影响GS在调节有丝分裂和癌细胞增殖中的功能。
发明人通过co-IP分析证实了GS和NUP88在癌细胞中的相互作用。为了研究GS是否直接与NUP88相互作用，发明人利用HEK293T细胞对FLAG-GS和V5-NUP88进行了表达和纯化。通过体外的pull down实验，发明人证明GS与NUP88之间存在直接相互作用。
此外，GS与NUP88之间的相互作用，不依赖于包括NUP98、RAE1或NUP214在内的其他NUP的存在。例如，敲降NUP214不影响GS和NUP88的相互作用。
研究表明，NUP88除了在核膜上构成核孔复合物的作用以外，仅在有丝分裂期间核膜破裂时才调节有丝分裂(Hashizume,C.,Nakano,H.,Yoshida,K.&Wong,R.W.2010)。由此，发明人对处于分裂间期或有丝分裂前中期的细胞中进行了co-IP分析，发现当细胞在进行有丝分裂时，GS与NUP88之间的相互作用大大增强。
相比之下，因谷氨酰胺不足导致细胞周期停滞在G1和S期，谷氨酰胺的缺乏减少了GS与NUP88的相互作用。与这一现象一致的，免疫染色实验结果表明GS倾向于在分裂中期与H460细胞中的NUP88共定位，但在具有完整核膜的分裂间期其共定位则显著减少。这些结果表明GS在有丝分裂期间与NUP88相互作用。
然后，发明人还检测了NUP88与GS的相互作用是否取依赖后者的酶活性。与GS-WT相比，GS-R324C突变蛋白与NUP88具有相似的结合能力。这表明，NUP88与GS的相互作用不依赖于GS的催化活性。
全长GS蛋白由N端b-Grasp域和C端催化域组成。不同GS缺失突变体的表达表明GS的b-Grasp结构域与NUP88相互作用，并且其C端催化结构域的破坏不干扰GS与NUP88的相互作用。对GS的深入结构分析显示，GS组装为具有高电荷表面的十聚体，其中两个带正电荷的区域(patches)可能通过电荷-电荷相互作用介导其与其他蛋白质的结合。值得注意的是，patch 1的残基K103到P108位于b-Grasp域内。
将该区域(patch 1的残基K103到P108)删除，可以导致GS和NUP88之间的相互作用消失。更重要的是，将该区域内四个带正电荷的残基替换为带负电荷的残基(以下简称GS-m4突变体)也显著抑制了GS与NUP88的相互作用。虽然GS-m4突变体失去了与NUP88结合的能力，但它可以完全抑制在谷氨酰胺缺乏条件下由GS敲降引起的细胞死亡。这表明GS-m4突变体保持了GS的催化活性，并且GS和NUP88之间的相互作用不依赖于GS的酶功能。然而，GS-m4突变体不能恢复在谷氨酰胺充足条件下由GS敲降引起的生长抑制。此外，延时分析显示由GS敲降引起的有丝分裂停滞不能通过GS-m4突变体的回复表达来解决。同样的，GS-m4突变体也不能在GS敲降时改善多倍体的情况。
综上，第六部分所列出的这些结果表明GS与NUP88的相互作用对于癌细胞的有丝分裂进展和增殖至关重要。
七、GS与NUP88的相互作用保障APC/C的正常活化
APC/C的活化触发从中期到后期的转变，并确保从有丝分裂退出。
细胞分裂周期蛋白20(CDC20)和细胞分裂周期20的相关蛋白1(CDH1)是APC/C的共激活因子，并在有丝分裂进程中发挥重要作用(Chang,L.F.,Zhang,Z.,Yang,J.,McLaughlin,S.H.&Barford,D.2014；Pines,J.2011)。
已有研究报道NUP88以依赖APC/CCDH1或APC/CCDC20的方式调节有丝分裂的不同机制。例如，NUP88的过表达可以驱动NUP88-RAE1/NUP98复合物的强制形成；并且通过形成NUP88-RAE1/NUP98复合物，从而可以在有丝分裂开始之前，提前激活APC/CCDH1，从而降低PLK1表达，干扰有丝分裂过程中的染色体分离，导致非整倍体(Naylor,R.M.,Jeganathan,K.B.,Cao,X.&van Deursen,J.M.2016)。
发明人发现敲降GS没有改变NUP88-RAE1/NUP98复合体的形成或降低PLK1的表达，这说明GS调节有丝分裂的过程是不依赖于NUP88-RAE1/NUP98-APC/CCDH1轴。波形蛋白(Vimentin)也被报道通过与NUP88的相互作用介导了NUP88的有丝分裂调节过程(Makise,M.,Nakamura,H.&Kuniyasu,A.2018)。然而，发明人发现敲降GS并没有改变这两种蛋白质的相互作用。
已有的研究报道，过表达的NUP88会发生异常细胞质定位，从而使得NUP88在核膜崩解之前与NUP98和RAE1发生相互作用；但除了APC/CCDH1机制，NUP88还可以直接与CDC20(APC/C复合物的关键辅助因子)相互作用，NUP88与CDC20的结合可以抑制APC/CCDC20并导致有丝分裂缺陷(Hashizume,C.&Wong,R.W.2013)。
鉴于上述发现和已有研究报道，发明人合理推测：GS可能在核膜崩解后与内源性NUP88相互作用。
发明人首先通过使用体外pull down分析证实了NUP88和CDC20的相互作用。重要的是，发明人发现GS-WT蛋白的引入能有效地抑制NUP88和CDC20的相互作用，而GS-m4突变体无法干扰这个相互作用。这些数据表明GS和NUP88的相互作用可以影响NUP88与CDC20的结合。同时，我们发现敲降GS增强了H460细胞中NUP88和CDC20之间的相互作用。并且，通过GS-WT或GS-R324C的回复表达能削弱这个增强效果。
APC/CCDC20在中期被活化，在此期间CDC20与CDC27(APC/C复合物的核心成分)的结合增加。敲降GS增强了在APC/CCDC20活化期间的NUP88和CDC20的相互作用。因此，CDC20与CDC27的结合降低，这表明APC/CCDC20的活化在GS敲降时受到抑制。
CDC20与CDC27的结合也可以被NUP88隔离，通过CDC20-CDC27的pull down实验也能证明这一点。
基于这些结果，发明人提出了一个模型，即GS与NUP88的结合允许CDC20和CDC27之间合适的相互作用，而敲降GS会释放NUP88以结合和隔离CDC20，从而阻断CDC20-CDC27相互作用。值得注意的是，在GS敲降的情况下，MAD2和CDC20的相互作用没有发生改变。因此，GS介导的对APC/CCDC20活化的调节不是由有丝分裂检查点复合物(MCC)的改变所介导。此外，谷氨酰胺水平的改变不影响NUP88-CDC20相互作用。
与上述这些发现一致的是，敲降GS增强了securin和细胞周期蛋白B1的表达，而它们是APC/C E3连接酶的经典靶标。GS-WT或GS-R324C的回复表达消除了这些增强效果。此外，敲降GS能延缓H460细胞从分裂前中期(PrM，通过诺考达唑处理)开始的分裂进程，这进一步间接证明GS可以调节APC/C活性。这些结果也与发明人利用延时摄影技术获得的发现一致，即细胞分裂中期到后期的过渡因GS敲降而延迟。发明人进一步验证了CDC20在敲降GS所导致的细胞分裂异常中所具有的功能。通过在对照和敲降GS的H460细胞中过表达CDC20。发明人发现CDC20的过表达可以有效地抑制由敲降GS引起的生长缺陷和有丝分裂停滞。
综上，第七部分所列出的这些结果表明，在有丝分裂进展中，GS通过不依赖于GS酶活性的方式，直接与NUP88相互作用，从而减少NUP88与CDC20的结合，以使得CDC20能够与CDC27正常相互作用，继而保证了APC/CCDC20的正确和及时激活(APC/C复合物的正常活化)，并驱动有丝分裂从中期到后期的转换；换句话说，敲降GS，导致细胞分裂从中期到后期的延迟，阻碍APC/C介导的肿瘤细胞有丝分裂和细胞周期进程。
八、敲降GS增加了癌细胞对于化疗或放疗的敏感性
上述第七部分证明了，GS对于有丝分裂从中期到后期的转换至关重要。鉴于微管重组也是执行有丝分裂从中期到后期转换的关键步骤，发明人也沿此方向进行了进一步探究。
发明人在探究中意外发现，敲降GS除了使肿瘤细胞发生有丝分裂停滞以外，还导致了经诺考达唑(微管聚合抑制剂)处理的H460细胞凋亡数量的显著增加。
为此，发明人希望能进一步揭示：敲降GS是否能够增加癌细胞对于具有抑制细胞有丝分裂作用的化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的敏感性。
发明人选择了紫杉醇和长春新碱，两个已知的、具有抑制细胞有丝分裂作用的癌症化疗药物。
具体的，在2mM谷氨酰胺存在的培养环境下，采用上述实施例的第3部分制备获得的含有敲降质粒shGS-1的慢病毒溶液处理人非小细胞肺癌NSCLC细胞系(H460、SK-MES-1和A549)；对照组采用上述的含有对照组的敲降质粒shScram的慢病毒溶液；转导之后，再用不同浓度的紫杉醇、长春新碱和诺考达唑处理三天，统计相对细胞存活率；每组做3次独立重复实验。
实验结果参见图14、15和16，可以看出，敲降GS明显降低了各浓度紫杉醇、长春新碱和诺考达唑处理后的细胞存活率，证明敲降GS显著增加了癌细胞(H460、SK-MES-1和A549)对于化疗药物紫杉醇和长春新碱、以及微管聚合抑制剂所诱导的增殖抑制和细胞凋亡的敏感性。
然而，敲降GS并未改变癌细胞对于阿霉素(doxorubicin)的反应。这说明，这种敏感性似乎对于具有抑制细胞有丝分裂作用的化疗药物，例如抗微管药物，具有特异性。
相反地，通过MSO抑制GS活性不会改变癌细胞对任何这些药物的敏感性。
为了进一步证实，发明人将分析扩展到了一组超过30个的NSCLC细胞系，发现GS的表达水平与对紫杉醇和长春碱(长春新碱的衍生物)的耐药性显着相关。
此外，发明人敲降了从NSCLC患者中新鲜分离的两种原代NSCLC细胞(ZL17和ZL13)中的GS表达，参见图17～19，可以看出，敲降GS显著增加了原代NSCLC细胞对于紫杉醇、长春新碱和诺考达唑的敏感性。
在NSCLC患者来源的2个类器官中也观察到GS敲降导致对紫杉醇的敏感性增加，参见图20。
最重要的是，GS-WT或GS-R324C的回复表达逆转了GS敲降细胞中增强的敏感性。与此形成鲜明对比的是，GS-m4突变体不能逆转增强的药物敏感性。这些发现表明GS增强了癌细胞对于化疗药物的抵抗力，不依赖于GS的催化活性，而是依赖于GS与NUP88的相互作用。
发明人还研究了GS的非代谢功能的临床应用。
在小鼠模型中，发明人发现：与敲降GS或紫杉醇单独诱导相比，敲降GS与紫杉醇的联合治疗对抑制H460细胞的肿瘤生长具有协同作用；具体的，如图21所示，敲降GS与紫杉醇的联合治疗的协同指数(combination index，CI)约为0.58，敲降GS后，紫杉醇对肿瘤生长抑制作用增加了大约2倍。在由新鲜分离的人NSCLC细胞ZL13产生的肿瘤模型中，也观察到敲降GS与紫杉醇治疗的协同作用，参见图22。这些结果表明，敲降GS可以有效地使癌细胞对包括紫杉醇在内的抗微管药物敏感。对于癌症的临床治疗，可以应用敲降GS与微管靶向治疗/抗微管药物的联合治疗方法。
此外，发明人还证实了接受化疗的NSCLC患者的GS表达与患者对化疗的反应密切相关，高水平GS的NSCLC患者发生耐药的风险增加了三倍，参见图23，证明GS在NSCLC中过表达并且在NSCLC化疗抗性中起重要作用。
总之，第八部分在多种癌细胞系、原代细胞、肿瘤类器官和移植瘤在内的各种研究模型中均证明了敲降GS能够增加癌细胞对于具有抑制细胞有丝分裂作用的化疗药物的敏感性。鉴于该结果，以及上述第五～七部分的研究结果，本领域技术人员可以合理推测到：敲降GS能够增加癌细胞对于具有抑制细胞有丝分裂作用的化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的敏感性，提高化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的疗效。
此外，鉴于无法穷举目前已知的所有癌细胞和肿瘤模型，但根据现有技术中的已有报道，GS在包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、肠癌、鼻咽癌或皮肤癌等多种癌细胞中高表达(Yuneva,M.O.,et.al.2012；Christa L,et.al.1994；Kung,H.N.,et.al.2011；Fan,S.,et.al.2018；Bott,A.J.,et.al.2019；6.Tardito,S.,et.al.2015；Fu,S.et.al.2019)；以及现有技术中，抑制细胞有丝分裂药物和相关技术在上述多种肿瘤临床治疗中的广泛应用；本领域技术人员在获知上述第一部分所证明的“敲降GS能够抑制癌细胞的增殖和肿瘤的生长”的实验结果，以及上述第二至八部分所揭示的“GS在癌细胞增殖中的作用和机制”的基础上，可以合理推测到：基于本发明精神实质的方案可以应用于治疗/改善肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、肠癌、鼻咽癌或皮肤癌等多种癌症。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0003412318880000011
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Claims (20)

1.分离的谷氨酰胺合成酶基因或谷氨酰胺合成酶在筛选癌症的治疗/改善药物方面的用途。
2.如权利要求1所述用途，其特征在于：所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、肠癌、鼻咽癌或皮肤癌。
3.如权利要求1所述用途，其特征在于：所述用途为筛选提高癌细胞对于化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的敏感性的药物方面的用途；
所述化疗、化疗药物、放疗或放疗药物具有抑制细胞有丝分裂的作用。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于：
所述分离的核酸分子包含靶向谷氨酰胺合成酶基因、并敲降谷氨酰胺合成酶基因的表达的双链RNA和/或shRNA。
5.如权利要求4所述的分离的核酸分子，其特征在于：
所述谷氨酰胺合成酶基因的靶序列为如SEQ ID NO：1～13中任一序列所示；
所述双链RNA为siRNA，其包含相互互补形成RNA二聚体的第一链和第二链；所述第一链的序列与所述谷氨酰胺合成酶基因的靶序列相同或基本相同；
所述shRNA包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环片段，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与所述谷氨酰胺合成酶基因的靶序列相同或基本相同。
6.一种表达载体，其特征在于，
所述表达载体包含编码如权利要求4或5中所述shRNA的基因片段，并且所述表达载体能够表达所述shRNA，或者，
所述表达载体包含编码如权利要求4或5中所述双链RNA的基因片段，并且所述表达载体能够表达所述双链RNA。
7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，
所述表达载体为重组病毒载体，是通过将编码如权利要求4或5中所述shRNA或所述双链RNA的基因片段克隆入病毒载体的编码区而形成的；
所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体中任一一种。
8.一种病毒，其特征在于：所述病毒是通过将病毒包装体系转染真核细胞所获得；所述病毒包装体系包含权利要求7所述的表达载体。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求8所述病毒，以及药学上可以接受的载体或赋形剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包含具有抑制细胞有丝分裂作用的药物。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于：所述具有抑制细胞有丝分裂作用的药物为抗微管药物，或者，
所述具有抑制细胞有丝分裂作用的药物为抑制关键代谢酶活性的药物，所述关键代谢酶为促进有丝分裂进程的关键代谢酶。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于：所述抗微管药物选自紫杉醇、长春新碱或长春碱中的任意一种或几种。
13.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于：所述抑制关键代谢酶活性的药物为谷氨酰胺酶抑制剂。
14.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包含谷氨酰胺合成酶抑制剂。
15.如权利要求9所述药物组合物，其特征在于：所述药物组合物采用注射剂型、片剂、胶囊剂或口服液体剂。
16.如权利要求6或7所述的表达载体，或者如权利要求8所述的病毒，或者，如权利要求9至15中任意一项所述的药物组合物在制备癌症的治疗/改善药物方面的用途。
17.如权利要求16所述用途，其特征在于：所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、肠癌、鼻咽癌或皮肤癌。
18.如权利要求16所述用途，其特征在于：所述用途为制备提高癌细胞对于化疗、化疗药物、放疗或放疗药物的敏感性的药物方面的用途；
所述化疗、化疗药物、放疗或放疗药物具有抑制细胞有丝分裂的作用。
19.如权利要求18所述用途，其特征在于：所述化疗为微管靶向化疗。
20.如权利要求18所述应用，其特征在于：所述化疗药物为抗微管药物。
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