CN105492602B - 对麸质不耐受以及相关病症的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供含有猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物，食品以及使用猪笼草蛋白酶或其衍生物调节麸质不耐受以及相关病症(例如乳糜泻)的方法。本发明进一步提供包含猪笼草蛋白酶或其衍生物的药物组合物以及使用猪笼草蛋白酶或其衍生物治疗胃肠道的细菌(例如，艰难梭状芽胞杆菌或幽门螺旋杆菌)感染的方法。本发明进一步提供包含重组猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II或同源蛋白质的组合物以及制备所述组合物的方法。

Description

对麸质不耐受以及相关病症的治疗

技术领域

本文提供用于治疗麸质不耐受以及相关病症(例如，乳糜泻)的组合物、食品和方法。本文进一步提供包含猪笼草蛋白酶或其衍生物的药物组合物以及使用猪笼草蛋白酶或其衍生物治疗胃肠道细菌(例如，艰难梭状芽胞杆菌或幽门螺旋杆菌)感染的方法。本文还提供在氢/氘交换中使用猪笼草蛋白酶或其衍生物的方法。本文进一步提供包含重组猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II或同源蛋白质的组合物及其制备方法。

背景技术

在麸质不耐受的个体体内，对含有麸质的小麦、大麦、黑麦以及可能的燕麦的消化可能会引起异常自体免疫反应，例如，乳糜泻、小麦过敏症和疱疹样皮炎。麸质是富含谷氨酰胺和脯氨酸的麦谷蛋白分子和醇溶蛋白分子的混合物。大多数具有异常自体免疫反应的个体表达人白细胞抗原(HLA)DQ2或DQ8分子。自体免疫反应引起小肠粘膜绒毛萎缩的发生，并伴有隐窝增生和粘膜炎症。乳糜泻的症状可因个体差异而不同并且所述症状可包括疲劳、慢性腹泻、便秘、营养素吸收不良、体重降低、腹胀、贫血中的一种或多于一种并且大大提高发展成骨质疏松和肠恶性肿瘤(淋巴瘤和癌)的风险。

治疗麸质不耐受通常涉及终生严格的不含麸质的膳食。然而，不含麸质的膳食并不方便，会受到限制并且麸质很难避免。因此，本领域亟需对麸质不耐受的有效备选治疗方法。

本领域已知多种细菌会导致胃肠道感染。虽然目前对这些感染的治疗大大依赖于抗生素，但是已发现越来越多的细菌感染对至少一些抗生素具有耐受性。此外，一些细菌种类形成内生孢子，该内生孢子使得这些细菌种类特别难以根除。诸如胃蛋白酶之类的胃部蛋白酶通常无法杀死内生孢子，例如，因为无法分解保护内生孢子的蛋白质包被。因此，本领域亟需有效治疗细菌感染的备选方法。

发明内容

本发明涉及如下发现：酶猪笼草蛋白酶具有较高的裂解蛋白质和寡肽(包括麸质)的蛋白水解活性，尤其是在低pH(例如，约2-3)条件下。猪笼草蛋白酶(EC 3.4.23.12)是起源于植物的天冬氨酸蛋白酶，该天冬氨酸蛋白酶可从多种植物来源中分离或浓缩，所述植物例如猪笼草(肉食性猪笼草植物，carnivorous pitcher plant，在热带地区通常称为瓶子草(monkey cups))的瓶状叶分泌物。

等人的文章“Digestive Enzymes Secretedby the Carnivorous Plant Nepenthes macferlanei L.”，Planta(Berl.)119,39-46(1974)。在本领域中目前已发现猪笼草蛋白酶的活性比胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)的活性高约1000倍，胃蛋白酶是存在于人类胃部的酶，其部分负责将食物蛋白质降解成肽。目前已发现，猪笼草蛋白酶具有比胃蛋白酶松弛得多的特异性(relaxed specificity)，其高效裂解除了氨基酸残基G,S,T,V,I和W之外的大部分氨基酸残基之后的位点。值得注意的是，猪笼草蛋白酶裂解氨基酸残基K,R和P之后的位点。通过比较，胃蛋白酶对疏水氨基酸残基F,L和M表现出高效裂解，但是基本不能对氨基酸残基P,H,K和R之后的位点进行裂解。

猪笼草蛋白酶具有两种已知的同种型：猪笼草蛋白酶I(已知其具有两种变体：猪笼草蛋白酶Ia和猪笼草蛋白酶Ib)和猪笼草蛋白酶II。本领域已发现这两种同种型对氨基酸P和氨基酸D这两者的裂解亲和性均高于胃蛋白酶对氨基酸P和氨基酸D这两者的裂解亲和性。出乎意料地是，本领域已发现猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II的组合相对于单独的猪笼草蛋白酶I具有略微不同的裂解亲和性。具体而言，包含猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II的提取物相对于单独的猪笼草蛋白酶I更加有效地裂解麦胶蛋白的N-末端侧氨基酸Q之后的位点以及麦胶蛋白的C-末端侧的氨基酸P之后的位点。

麸质不耐受以及相关病症和症状(例如，乳糜泻和/或疱疹样皮炎)由患者对小肠粘膜内的麸质的异常免疫反应引起。一些麸质成分耐受胃肽酶和胰腺肽酶的裂解，所述胃肽酶和胰腺肽酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶，等等。虽然不受任何理论的限制，本发明涉及在麸质到达患者的肠道之前由猪笼草蛋白酶将麸质降解成无毒肽，从而降低进入小肠的毒性麸质蛋白质或肽的水平。因为猪笼草蛋白酶是酸稳定的，所以其与胃部pH具有相容性并且其消化麸质，从而调节患者的麸质不耐受或相关病症或症状。

考虑到猪笼草蛋白酶在低pH条件下具有高活性并且具有宽活性谱，猪笼草蛋白酶在胃部消化麸质蛋白的过程中尤其有用。麸质降解为无毒肽也被称为麸质的解毒。尽管不希望受任何理论的限制，本发明发现猪笼草蛋白酶相对于诸如胃蛋白酶之类的胃酶更加有效地实现将麸质降解为无毒肽，所述麸质由富含脯氨酸和谷氨酰胺的蛋白质构成。

本发明进一步涉及诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶及其衍生物在治疗胃肠道细菌感染中的应用。考虑到猪笼草蛋白酶在低pH条件下具有高活性并且具有宽活性谱，猪笼草蛋白酶在治疗胃肠道的细菌感染方面有用。不受理论限制，猪笼草蛋白酶被认为比胃酶在破坏细菌细胞壁和内生孢子包被方面更加有效。

一方面，本发明提供调节患有麸质不耐受的患者体内的麸质不耐受的方法，所述方法包括将有效量的诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶II或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物给药于所述患者。

在一种实施方式中，诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物作为食品添加剂施用，这样，猪笼草蛋白酶或其衍生物与含有麸质的食物结合从而调节或抑制与麸质不耐受相关的病症。猪笼草蛋白酶或其衍生物可单独使用或与上述食物联合使用。一方面，使用猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，使用猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，使用猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。

另一方面，本发明提供调节患者体内由麸质不耐受介导的病症的方法，所述方法包括将有效量的诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于所述患者。所述病症包括，例如，乳糜泻、小麦过敏、麸质敏感和/或疱疹样皮炎。一方面，将猪笼草蛋白酶I或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶II或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物给药于所述患者。

在任何事件中，可在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食物之前将诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于患者，在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食物的同时将诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于患者，或在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食物之后立即将诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶II或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物给药于所述患者。

另一方面，本发明提供用于调节有此需要的患者体内的麸质不耐受或相关病症的方法，所述相关病症例如乳糜泻、小麦过敏、麸质敏感或疱疹样皮炎，所述方法包括在患者进食之前用有效量的猪笼草蛋白酶处理含有麸质或怀疑含有麸质的食品。一方面，用有效量的猪笼草蛋白酶I或其衍生物处理所述食品。一方面，用有效量的猪笼草蛋白酶II或其衍生物处理所述食品。一方面，用有效量的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物处理所述食品。

另一方面，本发明提供包含诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物的食品或组合物。一方面，所述食品或组合物包含猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，所述食品或组合物包含猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，所述食品或组合物包含猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。

另一方面，本发明提供一种用于优化麸质蛋白质在脯氨酸残基处的裂解的组合物，所述组合物包含重组猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II的混合物。一方面，本发明提供一种用于优化麸质蛋白质在谷氨酰胺残基处的裂解的组合物，所述组合物包含重组猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II的混合物。

另一方面，本发明提供包含片段化的麸质的组合物，其中，所述组合物富含在麸质的脯氨酸残基处裂解麸质产生的麸质片段。一方面，本发明提供包含片段化的麸质的组合物，其中，所述组合物富含在谷氨酰胺残基处裂解麸质产生的麸质片段。

另一方面，本发明提供消化包含麸质的蛋白质的方法，所述方法包括使所述蛋白质与有效量的猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II接触。

另一方面，本发明提供生成重组猪笼草蛋白酶或其衍生物的方法，所述猪笼草蛋白酶例如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II，所述方法包括在所选择的宿主生物体内表达编码所述猪笼草蛋白酶或其同源物的核酸序列，所述核酸序列已插入适当设计的载体中，从而获得所述猪笼草蛋白酶或其同源物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。

另一方面，本发明提供包含重组猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。

另一方面，本发明提供预防或治疗患者体内胃肠道的细菌或寄生虫感染的方法，所述方法包括将治疗有效量的诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶II或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物给药于所述患者。

本发明的这些方面和其他方面在下文中进一步描述。

附图说明

图1显示了猪笼草蛋白酶优先在(A)裂解位点的P1或N末端侧和(B)裂解位点的P1’或C末端侧裂解。根据氨基酸类型对数据进行分组，并且将数据与来自Hamuro等人的文章“Specificity of immobilized porcine pepsin in H/D exchange compatibleconditions”,Rapid Communications in Mass Spectrometry 22(7):1041-1046(2008)中的胃蛋白酶数据的类似结果进行比较。黑色柱表示猪笼草蛋白酶消化，灰色柱表示胃蛋白酶消化。裂解％表示相对于一组给定残基的总数量在给定残基处观察到的裂解数量。猪笼草蛋白酶数据获自六种变性蛋白的消化物，如实施例2中所描述的。

图2显示了XRCC4复合肽序列图谱，其根据结构域类型进行排布。所述肽在四种不同的酶和底物的比例(65:1至520:1，浅灰色/顶部一系列柱)条件下使用胃蛋白酶消化获得，以及在四种不同的酶和底物的比例(0.0075:1至0.38:1，深灰色/底部一系列柱)条件下使用猪笼草蛋白酶消化获得。

图3显示了在猪笼草蛋白酶消化之后获得的肽的平均MASCOT分数，其由C-末端氨基酸分组。用于每次计算的肽的数目与末端氨基酸有关，所述肽的数目位于柱的上方。肽获自六种变性蛋白的消化物，如实施例2中所描述的。

图4显示了在多种不同的酶和底物的比例(如图例所示)条件下用猪笼草蛋白酶(A)和胃蛋白酶(B)消化的XRCC4的肽离子色谱图(PIC)。酶消化的PIC通过柱上相同的质量负载的底物产生。

图5显示了在37℃条件下，猪笼草蛋白酶对小麦中的麦胶蛋白消化1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、130分钟、360分钟或810分钟之后，使用LC-MS/MS识别的所有肽的平均长度。分数上的95％的置信度切割(p<0.05)用于除去假阳性识别。肽长度的相对标准偏差在插图中显示。

图6显示了在37℃条件下，消化1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、130分钟、360分钟或810分钟之后，由LC-MS/MS识别的肽的数目，根据长度分组。数据如图5所示。

图7显示了与图5相同的数据，作为在37℃条件下，消化10分钟、60分钟、120分钟、360分钟或810分钟之后获得一些长度的概率。

图8显示了猪笼草蛋白酶优先在(A)P1或裂解位点的N末端侧以及(B)P1’或裂解位点的C-末端侧裂解。每个残基的左侧柱表示由猪笼草蛋白酶提取物消化，中间柱表示由纯化的猪笼草蛋白酶提取物消化，以及右侧柱表示由重组的猪笼草蛋白酶I消化。裂解％表示相对于存在的肽总数在给定残基处所观察到的裂解数。猪笼草蛋白酶数据获自麦胶蛋白的消化物，如实施例9所描述的。

图9显示了猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II的蛋白质序列的比对，所述猪笼草蛋白酶I来自奇异猪笼草(Nepenthes mirabilis)，小猪笼草(Nepenthes gracilis)，翼状猪笼草(Nepenthes alata)，玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)，所述猪笼草蛋白酶II来自奇异猪笼草(Nepenthes mirabilis)，小猪笼草(Nepenthes gracilis)，玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)。

图10显示了说明不同物种之间的猪笼草蛋白质相关性的系统树。

具体实施方式

I.释义

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料来实施或测试本发明，但是本文描述了优选的方法、设备和材料。本文引用的所有科技出版物和专利出版物的全部内容通过引用并入本文。本文不被解释为承认由于在先发明而无权优先于上述科技出版物和专利出版物公开的内容。

除非另有说明，对本发明公开的内容的实施使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些常规技术在本领域技术人员的范围内。这些技术例如在下列公开出版物中在文字上进行全面解释。参见，例如，Sambrookand Russell编辑.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第三版(2001)；系列丛书CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人，编辑(2007))；系列丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.,N.Y.)；PCR 1:A PRACTICAL APPROACH(M.MacPherson等人，IRL Press at Oxford University Press(1991))；PCR 2:APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))；ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL(Harlow和Lane编辑(1999))；CULTURE OF ANIMALCELLS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(R.I.Freshney第5版(2005))；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS(M.J.Gait编辑(1984))；Mullis等人，美国专利第4,683,195号；NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATION(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984))；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(M.L.M.Anderson(1999))；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984))；IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES(IRL Press(1986))；B.Perbal,APRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984)；GENE TRANSFER VECTORS FORMAMMALIAN CELLS(J.H.Miller和M.P.Calos编辑(1987)Cold Spring HarborLaboratory)；GENE TRANSFER AND EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS(S.C.Makrides编辑(2003))IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY(Mayer和Walker,编辑,Academic Press,London(1987))；WEIR’S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(L.A.Herzenberg等人，编辑(1996))。

如说明书和权利要求书中所使用的，除非另有明确说明，单数形式冠词“a”，“an”和“the”包括复数指代物。

如本文使用的，术语“包括”是指组合物和方法包括所记载的元素，但是不排除其他元素。当使用“基本由……构成”定义组合物和方法时，其是指排除对组合有任何实质影响的其他元素。例如，如本文定义的，基本由多个元素构成的组合物不排除不会对要求保护的本发明的基本特点和新特点产生实质影响的其他元素。“由……构成”是指排除高于痕量的其他成分和所记载的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方式在本发明的范围内。

如本文所使用的，术语“麸质”通常是指存在于小麦或相关谷物物种中的蛋白质，所述谷物物种包括大麦和黑麦，所述蛋白质对某些个体具有潜在的有害作用。麸质蛋白质包括麦胶蛋白和麦谷蛋白，所述麦胶蛋白例如，α-麦胶蛋白，β-麦胶蛋白，γ-麦胶蛋白和ω-麦胶蛋白，这些蛋白是单体蛋白质，所述麦谷蛋白是由二硫化物键结合在一起的高分子量亚单位和低分子量亚单位的聚集体的高度异质性混合物。许多小麦麸质蛋白质已被表征，参见，例如，Woychik et al.,Amino Acid Composition of Proteins in WheatGluten,J.Agric.Food Chem.,9(4),307–310(1961)。本文使用的术语麸质还包括可从来自含麸质的食品的麸质蛋白质的正常人体消化衍生得到的且导致异常免疫反应的寡肽。这些寡肽中的一些对正常消化酶具有耐受性。包括上述蛋白质和寡肽的麸质被认为在患有麸质不耐受的患者体内的乳糜泻中充当T细胞抗原。

术语“猪笼草蛋白酶”是指酶学委员会编号为EC3.4.23.12的天冬氨酸蛋白酶并且包括猪笼草蛋白酶的所有同种型和变体(例如，I型猪笼草蛋白酶和II型猪笼草蛋白酶)和重组猪笼草蛋白酶及其盐。盐类是指由猪笼草蛋白酶和一种或多于一种碱或者一种或多于一种酸形成的那些盐，所述盐保留游离猪笼草蛋白酶的生物有效性和性质，并且，所述盐不是生物学上不理想的或其他方面不理想的。由无机碱衍生得到的盐包括但不限于：钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐，等等。由有机碱衍生得到的盐包括但不限于：下列胺的盐，伯胺、仲胺和叔胺，包括天然生成的取代的胺在内的取代的胺，环胺和碱性离子交换树脂，例如，异丙胺、三甲基胺、二乙基胺、三乙基胺、三丙基胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明青霉素(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙烯基二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂，等等。可形成盐的酸包括但不限于：无机酸和有机酸，所述无机酸例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，等等；所述有机酸例如，乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸，等等。

猪笼草蛋白酶衍生物包括生物等同物、其片段和延长的猪笼草蛋白酶及其盐，这些衍生物保持了蛋白水解活性。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶衍生物包括猪笼草蛋白酶的生物等同物。“生物等同物”包括与猪笼草蛋白酶具有至少约80％同源性或一致性的那些生物等同物，可选地，与猪笼草蛋白酶具有至少约85％同源性的那些生物等同物，或可选地，与猪笼草蛋白酶具有至少约90％同源性的那些生物等同物，或可选地，与猪笼草蛋白酶具有至少约95％同源性的那些生物等同物，或可选地，与猪笼草蛋白酶具有98％同源性的那些生物等同物，或者可选地，“生物等同物”包括由在严格条件下与编码猪笼草蛋白酶核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽或蛋白质，同时该多肽或蛋白质保持期望的结构并表现出猪笼草蛋白酶蛋白水解活性的至少一部分。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶衍生物是具有全长猪笼草蛋白酶蛋白质中的至少约20个连续氨基酸的猪笼草蛋白酶片段，或者是具有全长猪笼草蛋白酶蛋白质中的至少约50个连续氨基酸的猪笼草蛋白酶片段，或者是包含猪笼草蛋白酶中的100或多于100个连续氨基酸至猪笼草蛋白酶的完整蛋白质的猪笼草蛋白酶片段。猪笼草蛋白酶衍生物还包括具有额外序列的猪笼草蛋白酶。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶衍生物具有猪笼草蛋白酶的蛋白水解活性中的至少约10％，或猪笼草蛋白酶的蛋白水解活性中的至少约50％，或猪笼草蛋白酶的蛋白水解活性中的至少约70％，或猪笼草蛋白酶的蛋白水解活性中的至少约90％，或猪笼草蛋白酶的蛋白水解活性的100％或更高。

本文使用的“其生物等同物”是“其等同物”的同义词，“其等同物”在涉及参比蛋白质，抗体，多肽或核酸时是指具有最小同源性但仍然保持期望的结构或功能性的那些等同物。在可选的实施方式中，术语多核苷酸的“生物等同物”是指在严格条件下与参比多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸的生物等同物。除非在本文中另有明确记载，应当考虑到的是，本文提到的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等同物。例如，等同物是指具有至少约80％的同源性或一致性，可选地具有至少约85％的同源性或序列一致性，或可选地具有至少约90％的同源性或序列一致性，或可选地具有至少约95％的同源性或序列一致性，或可选地具有98％的同源性或序列一致性，或可选地具有99％的同源性或序列一致性，并且表现出与参比蛋白质、多肽或核酸基本等同的生物活性。

多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有某一百分比(例如，80％，85％，90％或95％)的“序列一致性”是指当比对时进行比较的两个序列中相同碱基(或氨基酸)的百分比。比对和百分同源性或序列一致性可使用本领域已知的软件程序确定，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，1987)补充部分30,第7.7.18节,表7.7.1中所描述的那些软件程序。优选地，缺省参数用于比对。一种比对程序是BLAST，其使用缺省参数。程序的实例包括使用下列缺省参数的BLASTN和BLASTP：Genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝nonredundant,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的具体细节可在如下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。

合适的表达载体包括能够表达操作性地连接至调节元件的多核苷酸的载体，所述调节元件例如，能够调节这些DNA表达的启动子区域和/或增强子。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，例如，质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，所述其他载体在引入合适的宿主细胞之后使插入的DNA表达。合适的表达载体包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些表达载体以及维持为附加型(episomal)的那些表达载体或整合至宿主细胞基因组的那些表达载体。

本文使用的术语“载体”是指非染色体核酸，该非染色体核酸包括完整复制子，这样，所述载体可在进入细胞内部时被复制，例如通过转化过程进入细胞内部。载体可以是病毒载体或非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、乳多空病毒(papovirus)或其他改良的天然生成的病毒。用于递送核酸的示例性的非病毒载体包括裸DNA，与阳离子脂质体络合的DNA，与阳离子聚合物一起或与阳离子聚合物结合的DNA；阴离子和阳离子脂质体；DNA-蛋白质络合物和包含与阳离子聚合物缩合的DNA的颗粒(所述阳离子聚合物例如，异源聚赖氨酸，限定长度寡肽以及聚乙烯亚胺)，在一些情况下，DNA包含在脂质体中；以及使用包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元络合物。

非病毒载体可包括质粒，所述质粒包含能够在体外、体内或从体内至体外被递送至靶细胞的异源多核苷酸。所述异源多核苷酸可包含目标序列并且可被可操作地连接至一个或多于一个调节元件并且可控制目标核酸序列的转录。本文使用的载体无需能够在最终靶细胞或受治者中复制。术语载体可包括表达载体和克隆载体。

“同源性”或“一致性”或“类似性”是指两种肽或两种核酸分子之间的序列类似性。同源性可通过比较每个序列的某一个位置来确定，所述序列可出于比较的目的进行比对。当被比较的序列中的某一位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配位置或同源位置的数目的函数。“不相关”或“非同源性”序列与本发明公开的序列中的一个序列共享小于40％的一致性，或可选地共享小于25％的一致性。

“杂交”是指可在不同“严格程度”条件下进行的杂交反应。增加杂交反应的严格程度的条件是本领域周知的并且在本领域中公开，参见，例如，Sambrook and Russell编辑.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版。相关条件的实例包括(以严格程度增加的顺序)：孵育温度25℃，37℃，50℃和68℃；缓冲液浓度10X SSC,6X SSC,1X SSC,0.1X SSC(其中，SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)以及使用其他缓冲系统的它们的等同物；甲酰胺浓度0％，25％，50％和75％；孵育时间5分钟至24小时，以及逐渐增加洗涤持续时间，逐渐增加洗涤频率或逐渐减低洗涤的缓冲液浓度。

在一种实施方式中，“治疗有效量”是指预防或改善患者体内的症状或产生期望的生物结果(例如，改善临床指征，延缓疾病的发作，等等)的化合物的量。有效量可由本领域普通技术人员来确定。所选择的剂量水平可取决于正在治疗的病症的严重程度以及正在被治疗的患者的病症和先前医疗史。然而，以低于实现期望的治疗效果所需的剂量作为化合物的起始剂量并且逐渐增加剂量直至实现期望的效果在本领域技术人员的能力范围内。

本文使用的“同时给药”或共治疗包括一同给药药剂，或在彼此之前或之后给药。

术语“调节(modulate或modulating)”是指对受治者体内的疾病或失调的任何治疗，所述受治者例如，哺乳动物，所述“调节”包括：

·预防疾病或失调或者防止受到疾病或失调的影响，即，使异常生物反应或症状不发展；

·抑制疾病或失调，即，阻止或抑制异常生物反应和/或临床症状的发展；和/或

·缓解疾病或失调，即，使异常生物反应和/或临床症状衰退。

本文使用的术语“预防”是指对有此需要的患者进行预防性治疗。所述预防性治疗可通过向处于患上疾病风险中的受治者提供合适剂量的治疗剂来完成，从而基本上防止疾病的发作。

本文使用的术语“病症”是指疾病状态，将本文提供的化合物、组合物和方法用于该疾病状态。

本文使用的术语“患者”或“受治者”是指哺乳动物，并且包括人类和非人类哺乳动物。在本文的具体实施方式中，患者或受治者是人类。

在数值之前使用的术语“约”表示数值可在合理的范围内发生改变，例如，±5％,±1％,和±0.2％。

II.方法

一方面，本发明提供用于调节患有麸质不耐受的患者体内的麸质不耐受的方法，所述方法包括将有效量的诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于所述患者。

在一种实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物作为食品添加剂施用，这样，猪笼草蛋白酶或其衍生物与含有麸质的食品结合以调节或抑制与麸质不耐受相关的病症。猪笼草蛋白酶或其衍生物可单独使用或与这些食品联合使用。

另一方面，本发明提供调节患者体内由麸质不耐受介导的病症的方法，所述方法包括将有效量的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于所述患者。这些病症包括，例如，乳糜泻、小麦过敏、麸质敏感和疱疹样皮炎。猪笼草蛋白酶或其衍生物可在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之前给药于患者，在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品的同时给药于患者，或在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之后立即给药于患者。

在一些实施方式中，诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之前给药于患者。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在所述猪笼草蛋白酶或其衍生物至少部分有效(例如，原始活性的至少约10％，20％，50％，70％，90％)降解将要被患者食用的食品中的麸质的时间段内施用。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用食品之前不超过约4小时，3小时，2小时，1小时或30分钟施用。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品的同时给药于患者。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物与食品一同施用，例如食品的成分或食品的添加剂。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物与食品分开施用。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之后立即给药于患者。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在食品中的麸质的至少一部分(例如，至少约10％，20％，50％，70％，90％)仍然在患者胃中的时间段内施用。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在患者食用食品之后不超过4小时，3小时，2小时，1小时或30分钟施用。

另一方面，本发明提供预防或治疗患者的胃肠道细菌感染或寄生虫感染的方法，所述方法包括将包含有效量的猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物给药于所述患者。例如，所述细菌感染可由诸如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，炭疽杆菌(Bacillusanthracis)，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)，沙门氏菌(Salmonella)，弯曲菌(Campylobacter)，大肠杆菌(E.coli)，志贺氏杆菌(Shigella)，艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和李斯特单核细胞增生菌(Listeriamonocytogenes)之类的细菌引起。一方面，所述组合物包含猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，所述组合物包含猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，所述组合物包含猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。

艰难梭状芽胞杆菌是天然生成的肠道菌群的小亚群。然而，作为医院、疗养院或类似机构中的患者的大部分人通过摄取细菌孢子而暴露于艰难梭状芽胞杆菌。艰难梭状芽胞杆菌在伺机条件下可在胃肠道中泛滥，这通常由于采用破坏正常肠道菌群的广谱抗生素进行治疗而引起。细菌释放可导致腹胀、腹泻和严重腹痛的毒素。艰难梭状芽胞杆菌感染是假膜性结肠炎的最常见的病因，在极少数病例中，所述假膜性结肠炎发展成威胁生命的中毒性巨结肠。大量长期住院的患者获得艰难梭状芽胞杆菌的比例为：住院长达两周的患者中大约13％的患者获得艰难梭状芽胞杆菌，并且住院多于四周的患者中50％的患者获得艰难梭状芽胞杆菌。Clabots,CR；Johnson,S；Olson,MM；Peterson,LR；Gerding,DN(September1992)."Acquisition of Clostridium difficile by hospitalized patients:evidencefor colonized new admissions as a source of infection".Journal of InfectiousDiseases 166(3):561–7。

螺旋杆菌已被发现存活于哺乳动物和一些鸟类的上胃肠道的内膜内以及肝脏中。幽门螺旋杆菌感染高达50％的人群并且对于人类而言可能是病原性的。幽门螺旋杆菌与消化性溃疡、慢性胃炎、十二指肠炎和胃癌密切相关。其他螺旋杆菌物种也与这些病症相关，所述其他螺旋杆菌物种包括猪螺旋杆菌(H.suis)，猫螺旋杆菌(H.felis)，H.bizzozeronii以及H.salomonis。

一方面，将治疗有效量的本发明的药物组合物给药于已知患有或怀疑患有胃肠道感染的患者。另一方面，将组合物给药于处于感染风险中的患者，例如，长期住院的患者和/或处方给予广谱抗生素的患者。

通常，诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物以安全且足以产生期望的麸质解毒作用或治疗细菌感染作用的量施用。猪笼草蛋白酶或其衍生物的化合物剂量可随多种因素发生改变，所述多种因素例如所施用的特定的猪笼草蛋白酶或其衍生物，患者对麸质的敏感性，所食用的含麸质的食品的量和类型，药代动力学性质，给药模式，接受者的年龄、健康状况和体重，症状的性质和程度，治疗的频率以及共同治疗(如果有的话)的类型，以及化合物的清除速率。本领域技术人员可基于上述因素确定合适的剂量。化合物可开始以合适的剂量给药，可基于临床反应根据需要调节剂量。诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物的量可基于本发明的描述由标准临床技术确定，所述量在治疗例如与病原菌感染有关的疾病或由病原菌感染引起的疾病方面有效。此外，体外分析可任选地用于帮助确定最优剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于给药路径，疾病或失调的严重度并且应当根据医师的判断和每个受治者的情况确定。

成年患者的剂量或给药方案可成比例地调节成用于儿童和婴儿的剂量或给药方案，并且成年患者的剂量或给药方案也可调节成用于其他给药或其他形式，例如与分子量或免疫反应成比例。给药或治疗可根据医师的意见以合适的时间间隔重复。

总体而言，猪笼草蛋白酶或其衍生物在需要时给药，所述需要时例如当患者将要或正在或已经食用了含有麸质或怀疑含有麸质的食物，或者患有或怀疑患有细菌感染时。可选地，包含猪笼草蛋白酶或其衍生物的药物组合物可给药于有此需要的患者。在任何情况下，所述药物组合物可以每天约0.001mg/kg体重至约1000mg/kg体重的剂量给药或对于普通人而言以每剂约1mg至约100g的剂量给药。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物可在每天0.001mg/kg体重、0.01mg/kg体重、0.1mg/kg体重、1mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重、50mg/kg体重、100mg/kg体重、500mg/kg体重或1000mg/kg体重的条件下给药或在上述这些值中的任何两个值之间的范围(包括端点值)条件下给药。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物可在每剂1mg、10mg、100mg、200mg、500mg、700mg、1g、10g、20g、50g、70g、100g的条件下给药或在上述这些值中的任何两个值之间的范围(包括端点值)条件下给药。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物可每天给药1次、2次、3次等等，取决于患者食用含有麸质的食品的次数或取决于细菌或寄生虫感染的类型、严重性或风险。

本发明的化合物可作为单独的活性剂给药或它们可与其他药剂联合给药(同时给药、顺序给药或分开给药或者通过共制剂给药)，所述其他药剂包括显示出相同或类似治疗活性并且对于这种联合给药确定安全且有效的其他化合物。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物与诸如胃部蛋白酶(例如，胃蛋白酶和胃蛋白酶原)之类的另一酶，诸如Chen等人在Aspartic proteases gene family inrice:Gene structure and expression,predicted protein features andphylogenetic relation,Gene 442:108–118(2009)中所描述的另一天冬氨酸蛋白酶，以及诸如美国专利第7,910,541号中所描述的脯氨酰基内肽酶(PEP)、二肽基肽酶IV(DPP IV)和二肽基羧肽酶(DCP)或半胱氨酸蛋白酶B之类的酶一同给药。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶与另一药剂一同给药于患者。可与猪笼草蛋白酶一同给药的药剂的非限定性实例包括组织谷氨酰胺转移酶的抑制剂，诸如HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，康白丁(compactin)，洛伐他汀(lovastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，普伐他汀(pravastatin)和阿伐他汀(atorvastatin))之类的抗炎剂，白三烯受体拮抗剂(例如，孟鲁司特(montelukast)和扎鲁司特(zafirlukast))，COX-2抑制剂(例如，塞来昔布(celecoxib)和罗非昔布(rofecoxib))，p38MAP激酶抑制剂(例如，BIRB-796)；诸如色甘酸钠(色甘酸)，吡嘧司特(pemirolast)，普希罗米(proxicromil)，瑞吡司特(repirinast)，硫蒽唑(doxantrazole)，氨来占诺(amlexanox)，奈多罗米(nedocromil)以及普克罗米(probicromil)之类的肥大细胞稳定剂；抗溃疡剂，诸如抗组胺剂(例如，阿伐斯汀(acrivastine)，西替利嗪(cetirizine)，地氯雷他定(desloratadine)，依巴斯汀(ebastine)，非索非那定(fexofenadine)，左西替利嗪(levocetirizine)，氯雷他定(loratadine)和咪唑斯汀(mizolastine))之类的抗过敏剂，谷氨酰胺转移酶2(TG 2)的抑制剂，抗TNFα药剂，以及抗生素。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶与抗生素一同给药，所述抗生素例如，青霉素、头孢菌素、碳青霉烯、多粘菌素、利福霉素、闰年霉素(lipiarmycin)、喹诺酮、磺胺、β-内酰胺、氟喹诺酮、糖肽、酮内酯、林肯酰胺、链霉杀阳菌素、氨基糖苷、大环内酯物、四环素、环脂肽、甘氨酰环素或恶唑烷酮。这些类别中的抗生素是本领域已知的。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶和抗感染药剂(例如，抗真菌三唑或两性霉素)共同给药。这些抗感染药剂可包括碳青霉烯(例如，美罗培南或亚胺培南)以拓宽治疗有效性。

本文还提供猪笼草蛋白酶或其衍生物在制备用于治疗或预防上述病症和疾病中的一种的药物中的应用。

组合物

诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物可以多种组合物的形式单独给药或与合适的药学上可接受的载体或稀释剂或膳食成分一同给药。

因此，另一方面，本发明提供包含猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物。在一些实施方式中，所述组合物是可食用的组合物。在一些实施方式中，所述组合物是膳食补充品。在一些实施方式中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方式中，所述组合物是食品或食品添加剂。所述组合物可被配制成固体、半固体或液体形式，例如，片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、注射液、凝胶和微球。猪笼草蛋白酶或其衍生物的给药可以各种不同的方式实现，例如，通过口服给药的方式实现。

在一些实施方式中，药物组合物包括治疗有效量的药剂和药学上可接受的载体。在特定实施方式中，术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他通用药典中列举的用于动物，更加具体地用于人类。术语“载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这些药物载体可以是无菌液体，例如水和油类，所述油类包括石油、动物、植物或合成的来源中的那些油类，例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用作液体载体。

合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇，等等。如果需要的话，组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、药丸、胶囊、粉末、持续释放剂型的形式，等等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。这些组合物可包含治疗有效量的猪笼草蛋白酶或其衍生物以及合适量的载体，从而提供适于给药于受治者的形式，优选地，所述猪笼草蛋白酶或其衍生物是纯化的形式。制剂应当与给药模式相称。

对于口服给药而言，猪笼草蛋白酶或其衍生物可单独使用，或与合适的添加剂联合以形成片剂、粉末、颗粒、胶囊、糖浆、液体、悬浮液，等等。例如，猪笼草蛋白酶或其衍生物的固体口服形式可由常规添加剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂制备。赋形剂的非限定性实例包括乳糖、甘露醇、玉米淀粉、土豆淀粉、结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉、羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、调味剂和着色剂。在一些实施方式中，制剂在患者的胃中释放猪笼草蛋白酶或其衍生物，这样，麸质可被猪笼草蛋白酶或其衍生物降解。

猪笼草蛋白酶或其衍生物可在任选地存在合适的缓冲剂(例如，磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑缓冲剂)和赋形剂(例如，诸如蔗糖、乳糖、海藻糖之类的冷冻保护剂)的条件下由水性溶液冷冻干燥。冷冻干燥的饼状物可任选地与赋形剂混合并且制成不同形式。

另一方面，本文提供用于治疗有此需要的患者体内的麸质不耐受或相关病症的方法，所述相关病症例如乳糜泻、小麦过敏、麸质敏感和疱疹样皮炎，所述方法包括在患者食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之前使用有效量的猪笼草蛋白酶或其衍生物处理含有麸质或怀疑含有麸质的食品。在一些实施方式中，在食品的制备过程中，优选地在加热步骤之后，将所述食品与有效量的猪笼草蛋白酶或其衍生物组合。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物作为食品添加剂与由小麦、黑麦和大麦等制成的含有麸质或怀疑含有麸质的食品一同施用，所述食品例如，面包、意大利面，麦片粥，等等。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物作为这些食品中的成分添加。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物在食用食物之前，任选地，在所述猪笼草蛋白酶或其衍生物为惰性的pH条件下，例如，在pH为约5或高于5的条件下分散在所述食物中。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物可制成或掺入粉末、涂抹料、喷雾、酱料、蘸酱、搅打奶油，等等，可在患者食用含有麸质的食品时将它们涂抹于所述食品。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物可制成引起食欲的形式，例如，糖果、口香糖、膳食补充品咀嚼物、糖浆等，以易于施用。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物可与常见食品混合，所述常见食品例如，糖、盐、沙拉酱、香料、奶酪、黄油、人造奶油、涂抹料、黄油、煎炸起酥油，蛋黄酱，乳制品，坚果酱，种子酱，果仁酱，花生酱，等等。优选地，含有猪笼草蛋白酶的食品或添加剂不需要在患者食用之前进行加热，这样，可最小化由于升温而引起的猪笼草蛋白酶或其衍生物的活性的可能的损失。

另一方面，本文提供包含猪笼草蛋白酶或其衍生物的食物产品。在一些实施方式中，所述食物产品包含麸质或怀疑包含麸质，例如，培烤食品(例如，蛋糕、松饼、甜甜圈、甜糕饼、面包卷以及面包)，意大利面，咸饼干，墨西哥炸玉米片，麦片粥等等，它们由小麦、黑麦和大麦制成。在一些实施方式中，所述食物产品可与另一含有麸质或怀疑含有麸质的食物产品一同食用。这些产品的非限定性实例包括粉末、涂抹料、喷雾、酱料、蘸料、搅打奶油、糖果、口香糖、糖浆、糖、盐、沙拉酱、香料、奶酪、黄油、人造黄油、涂抹料、黄油、煎炸起酥油、蛋黄酱，乳制品，坚果酱，种子酱，果仁酱，花生酱，等等。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶或其衍生物与食品混合或用于预处理含有麸质的食物。存在于食品中的猪笼草蛋白酶可以是酶活性的，从而在食用食物之前或在食用食物的过程中降低食物中的麸质水平。

在一些实施方式中，组合物(例如药物组合物或可食用的组合物)或食物产品包含约0.1％至约99％，约0.5％至约95％，约1％至约95％，约5％至约95％，约10％至约90％，约20％至约80％，约25％至约75％的猪笼草蛋白酶。在一些实施方式中，组合物(例如药物组合物或可食用的组合物)或食物产品中的猪笼草蛋白酶占总组合物或食物产品的约0.01％,约0.1％,约0.5％,约1％,约5％,约10％,约20％,约25％,约30％,约35％,约40％,约45％,约50％,约55％,约60％,约65％,约70％,约75％,约80％,约85％,约90％,或约95％，或者上述数值中的任何两个数值之间的范围(包括端点值)。

另一方面，本发明提供用于优化麸质蛋白质在脯氨酸残基处的裂解的组合物，所述组合物包含重组猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II的混合物。一方面，本发明提供用于优化麸质蛋白质在谷氨酰胺残基处的裂解的组合物，所述组合物包含重组猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II的混合物。在一些实施方式中，上述组合物在脯氨酸残基处裂解麸质蛋白质方面的有效性是含有相同量或浓度的单独的猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II的组合物的至少约20％、50％，2倍、5倍或10倍。在一些实施方式中，上述组合物在谷氨酰胺残基处裂解麸质蛋白质方面的有效性是含有相同量或浓度的单独的猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II的组合物的至少约20％、50％、2倍、5倍或10倍。

另一方面，本发明提供用于优化诸如H,K,R,D,E,S,T和/或N之类的氨基酸残基处的蛋白质的裂解的组合物。在一些实施方式中，上述组合物在给定残基处裂解蛋白质方面的有效性是含有相同量或浓度的单独的猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II的组合物的至少约20％、50％、2倍、5倍或10倍。在一些实施方式中，上述组合物在给定残基处裂解蛋白质方面的有效性是含有相同量或浓度的胃蛋白酶的组合物的至少约10倍、100倍、500倍、1000倍、1400倍或2000倍或者更高的倍数。在一些实施方式中，所述残基是可被胃蛋白酶裂解的残基。在一些实施方式中，所述残基是不能被胃蛋白酶有效裂解的残基。

另一方面，本发明提供一种包含片段化的麸质的组合物，其中，所述组合物富含在麸质的脯氨酸残基处裂解麸质而产生的麸质片段。一方面，本发明提供一种包含片段化的麸质的组合物，所述组合物富含在谷氨酰胺残基处裂解麸质而产生的麸质片段。在一些实施方式中，由在麸质的脯氨酸残基处裂解麸质而产生的麸质片段是由含有相同量或浓度的单独的猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II的组合物在麸质的脯氨酸残基处裂解麸质而产生的麸质片段的至少2倍、5倍或10倍。在一些实施方式中，在麸质的谷氨酰胺残基处裂解麸质而产生的麸质片段是由含有相同量或浓度的单独的猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II的组合物在麸质的谷氨酰胺残基处裂解麸质而产生的麸质片段的至少2倍、5倍或10倍。

另一方面，本发明提供用于优化诸如H,K,R,D,E,S,T和/或N之类的其他氨基酸残基处的蛋白质的裂解的组合物。在一些实施方式中，在蛋白质的给定氨基酸残基处裂解蛋白质而产生的蛋白质片段是由含有相同量或浓度的单独的猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II的组合物在蛋白质的给定氨基酸残基处裂解蛋白质而产生的蛋白质片段的至少2倍、5倍或10倍。在一些实施方式中，在蛋白质的给定氨基酸残基处裂解蛋白质而产生的蛋白质片段是由含有相同量或浓度的胃蛋白酶的组合物在蛋白质的给定氨基酸残基处裂解蛋白质而产生的蛋白质片段的至少约10倍、50倍、500倍、1000倍、1400倍或2000倍或更高的倍数。在一些实施方式中，所述残基是可被胃蛋白酶裂解的残基。在一些实施方式中，所述残基是无法被胃蛋白酶有效裂解的残基。

制备方法

猪笼草蛋白酶可通过已知方法从天然来源中浓缩(或提取)或纯化，所述已知方法例如过滤或基于固定胃酶抑素的亲和性纯化，所述天然来源例如诸如猪笼草之类的植物的瓶状叶分泌物。在天然植物分泌物中发现相对较少量的猪笼草蛋白酶I和II。猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II的产量可通过使用例如生物工程技术产生表达和/或分泌增加量的猪笼草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II或其衍生物的转基因植物来提高。

除了从植物来源中分离之外，诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物可通过化学合成制备。化学合成可根据猪笼草蛋白酶的序列通过氨基酸的偶联完成。各种不同的肽偶联方法和商售肽合成设备可用于合成肽或蛋白质，例如，Applied Biosystems,Inc.,Foster City,Calif.,Beckman,以及其他生产厂商的自动合成仪。

另一方面，本发明提供一种使用重组生产系统通过由猪笼草蛋白酶的DNA和/或信使RNA转化或转染细胞而使细胞能够生成猪笼草蛋白酶的制备猪笼草蛋白酶的方法。例如，猪笼草蛋白酶可通过在微生物和植物细胞培养物中建立宿主-载体系统而生成，所述微生物例如大肠杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母菌，乳酸菌，杆菌，曲霉菌；所述植物细胞培养物例如，烟草细胞，等等。

本发明还提供包含多核苷酸的诸如大肠杆菌之类的载体和宿主细胞以及包含多核苷酸或多肽中的任一种的组合物。

另一方面，本发明提供一种生产诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的重组猪笼草蛋白酶或其衍生物的方法，所述方法包括在所选择的宿主生物体内表达编码所述猪笼草蛋白酶或其同源物的核酸序列，以及将所述核酸序列插入适当设计的载体中。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。

另一方面，本发明提供一种包含诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的重组猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。

猪笼草蛋白酶具有两种已知的同种型：猪笼草蛋白酶I(已知其具有两种变体猪笼草蛋白酶Ia和猪笼草蛋白酶Ib)和猪笼草蛋白酶II。猪笼草蛋白酶的序列和编码猪笼草蛋白酶的cDNA的核苷酸序列是本领域已知的，例如，在Athauda SB等人,Enzymic andstructural characterization of nepenthesin,a unique member of a novelsubfamily of aspartic proteinases,Biochem.J.381:295–306(2004)中所描述的。已对来自若干物种的猪笼草蛋白酶I mRNA序列进行了描述，例如，奇异猪笼草(Nepenthesmirabilis)(GenBank Accession No.JX494401),小猪笼草(Nepenthes gracilis)(GenBank Accession No.AB114914),和翼状猪笼草(Nepenthes alata)(GenBankAccession No.AB266803)。已对来自若干物种的猪笼草蛋白酶II mRNA序列进行了描述，例如，奇异猪笼草(GenBank Accession No.JX494402)，小猪笼草(GenBank AccessionNo.AB114915)，玉米(Zea mays)(GenBank Accession No.NM_001147869)。已对来自若干物种的猪笼草蛋白酶I蛋白质序列进行了描述，例如，奇异猪笼草(GenBank AccessionNo.AFV26024),小猪笼草(GenBank Accession No.BAD07474),翼状猪笼草(GenBankAccession No.BAF98915),和玉米(NCBI Reference Sequence:NP_001150925)。已对来自若干物种的猪笼草蛋白酶II蛋白质序列进行了描述，例如，奇异猪笼草(GenBankAccession No.AFV26025),小猪笼草(GenBank Accession No.BAD07475),和玉米(NCBIReference Sequence:NP_001149229)。已对水稻的推定猪笼草蛋白酶I蛋白质进行了描述(GenBank Accession No.BAD38020).已对水稻的推定猪笼草蛋白酶II蛋白质进行了描述(GenBank Accession No.BAD82000)。

已知的猪笼草蛋白酶蛋白质(和推定蛋白质)的序列比对在图9中显示，并且对应的成对比对分数在表1中显示。代表数据的系统树在图10中显示。Athauda等人进一步将猪笼草蛋白酶和相关典型天冬氨酸蛋白酶进行了比较。Athauda等人基于猪胃蛋白酶A的结构预测了猪笼草蛋白酶Ia的骨架结构(猪笼草蛋白酶Ib和II预计与猪笼草蛋白酶Ia基本相同)。基于该分析推定的催化性天冬氨酸残基是保守的。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶的生物合成可通过由包含cDNA的载体转化细胞而实现，所述cDNA编码猪笼草蛋白酶I，例如，核苷酸序列SEQ ID NO.1，GenBank登录号：JX494401,GenBank登录号：AB114914,或GenBank登录号：AB266803。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶的生物合成可通过由包含与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有同源性的序列的载体转化细胞而实现，其中，与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有同源性的序列编码具有蛋白酶活性的蛋白质。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约60％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约70％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约80％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约85％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约90％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约95％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约96％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约97％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约98％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶I的cDNA具有至少约99％的同源性。

在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶的生物合成可通过由包含编码猪笼草蛋白酶II的cDNA的载体转化细胞而实现，所述cDNA例如，GenBank登录号为JX494402或GenBank登录号为AB114915的核苷酸序列。在一些实施方式中，猪笼草蛋白酶的生物合成可通过由包含与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有同源性的序列的载体转化细胞而实现，其中，与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有同源性的序列编码具有蛋白酶活性的蛋白质。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约60％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约70％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约80％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约85％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约90％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约95％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约96％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约97％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约98％的同源性。所述序列可与编码猪笼草蛋白酶II的cDNA具有至少约99％的同源性。

诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的合成的猪笼草蛋白酶或其衍生物可根据已知的方法浓缩或纯化，例如，从植物瓶状叶液体中分离猪笼草蛋白酶或其衍生物的那些方法。

在一些实施方式中，从天然来源或合成来源中分离的蛋白质产品包含至少20重量％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，分离的蛋白质产品包括至少约50重量％、约75重量％、约90重量％，约95重量％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，分离的蛋白质产品包括至少99重量％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。

在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶基本上只包含猪笼草蛋白酶I。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶基本上只包含猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约100:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约90:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约70:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约60:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约50:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约40:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约30:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约20:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约10:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约5:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约4:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约3:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约2:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:1的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:2的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:3的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:4的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:5的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:10的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:20的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:30的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:40的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:50的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:60的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:70的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:80的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:90的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。在一些实施方式中，重组猪笼草蛋白酶包含比例为至少约1:100的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II。

在一些实施方式中，从天然来源或合成来源分离的蛋白质产品包含与猪笼草蛋白酶I具有至少约70％的同源性的蛋白质并且保持蛋白酶活性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶I具有至少约80％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶I具有至少约85％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶I具有至少约90％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶I具有至少约95％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶I具有至少约96％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶I具有至少约97％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶I具有至少约98％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶I具有至少约99％的同源性。

在一些实施方式中，从天然来源或合成来源分离的蛋白质产品包含与猪笼草蛋白酶II具有至少约70％的同源性的蛋白质并且保持蛋白酶活性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶II具有至少约80％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶II具有至少约85％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶II具有至少约90％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶II具有至少约95％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶II具有至少约96％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶II具有至少约97％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶II具有至少约98％的同源性。所述蛋白质可与猪笼草蛋白酶II具有至少约99％的同源性。

在一些实施方式中，从天然来源或合成来源分离的蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约10％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约20％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约30％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约40％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约50％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约60％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约70％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约80％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的至少约90％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含活性大于猪笼草蛋白酶I的原始蛋白酶活性的约100％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。

在一些实施方式中，从天然来源或合成来源分离的蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约10％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约20％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约30％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约40％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约50％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约60％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约70％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约80％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含具有猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的至少约90％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。在一些实施方式中，所述蛋白质产品包含活性大于猪笼草蛋白酶II的原始蛋白酶活性的约100％的猪笼草蛋白酶或其衍生物。

实施例

除非另有说明，说明书全文使用的缩写具有如下含义：

g＝克

kDa＝千道尔顿

kg＝千克

L＝升

LC＝液相色谱

mg＝毫克

min＝分钟

mL＝毫升

mM＝毫摩尔

MS＝质谱

nM＝纳摩尔

pM＝皮摩尔

s.d.＝标准偏差

μCi＝微居里

μg微克

μL＝微升

μΜ＝微摩尔

μm＝微米

℃＝摄氏度

这些单个字母标识在代表氨基酸时具有下列含义：

A＝丙氨酸

R＝精氨酸

N＝天冬酰胺

D＝天冬氨酸

C＝半胱氨酸

E＝谷氨酸

Q＝谷氨酰胺

G＝甘氨酸

H＝组氨酸

I＝异亮氨酸

L＝亮氨酸

K＝赖氨酸

M＝蛋氨酸

F＝苯丙氨酸

P＝脯氨酸

S＝丝氨酸

T＝苏氨酸

W＝色氨酸

Y＝酪氨酸

V＝缬氨酸

实施例1

猪笼草蛋白酶提取物的制备

化学品

来自Burdick和Jackson的HPLC级的水和乙腈，购自VWR。甲酸、Tris、甘氨酸购自Sigma Aldrich。

植物培养

莱佛士猪笼草(Nepenthes rafflesiana)、苹果猪笼草(Nepenthes ampularia)、奇异猪笼草(Nepenthes mirabilis)和海盗猪笼草(Nepenthes globosa)的移植株购自Keehns Carnivores(http://www.keehnscarnivores.ca)。这些移植株用木皮、珍珠岩、泥煤苔和腐殖土栽培(分别为40％、35％、10％、5％)。生长条件包括每天14小时光照，80％湿度和23℃至28℃的温度以及每周浇水两次至三次。在猪笼草的瓶状叶成熟之后，以每个瓶状叶一只或两只果蝇的条件供养植株，并且一周之后收获瓶状叶液体。对瓶状叶及其分泌物进行回收持续一周，随后进行第二轮供养和提取。

提取物的制备

从所有四种植物中收集瓶状叶液体并将其合并。粗瓶状叶液体首先通过0.22μm的过滤器进行净化，随后使用Amicon Ultra离心10kDa分子量截留过滤器(均来自Millipore)使液体浓缩80倍至100倍。在用于消化之前，用100mM甘氨酸HCl(pH 2.5)酸活化浓缩液持续3小时，随后在过滤设备中用100mM甘氨酸-HCl(pH 2.5)洗涤3次，每次洗涤使用10X液体体积。最后的分离物随后基于瓶状叶液体的原始采样再次稀释至11倍浓度。

猪笼草瓶状叶液体提取物的表征

浓缩猪笼草植物的液体分泌物并且通过降低pH(pH 2.5)活化消化酶。富集过程的影响和对流体蛋白质组的活化通过使用蛋白质组学方法来确定。首先，为了确认猪笼草蛋白酶的存在，由SDS-PAGE分离无活性的浓缩物。带有非常弱的考马斯亮蓝染色的七个连续凝胶区域由胰蛋白酶消化并且使用标准方法通过nanoLC-MS/MS分析。虽然并不预期这是活化的流体蛋白质组的完整目录，但是该分析确认了天冬氨酸蛋白酶猪笼草蛋白酶I/II，和葡聚糖酶，壳多糖酶，羧肽酶和植物来源的过氧化物酶的存在以及适度水平的果蝇和细菌污染。流体蛋白质组的低复杂性与最近的分析(Hatano N,Hamada T(2012)Proteomicanalysis of secreted protein induced by a component of prey in pitcher fluidof the carnivorous plant Nepenthes alata.Journal of Proteomics 3；75(15):4844-52(Epub Jun.15,2012))一致，但是发现猪笼草蛋白酶-I在该分析中分布在宽得多的质量范围内(40-70kDa)。酸活化的流体随后以类似的方式处理和分析。活化过程降低了总蛋白质产量并且还看起来简化了组合物。除了猪笼草蛋白酶I之外，仅证实了来自角蛋白和肌动蛋白的少量污染。这些分析意味着富集的流体的低复杂性，其中，猪笼草蛋白酶是主要成分。活化的且80倍富集的流体的总蛋白质浓度由BCA分析测量为22ng/μL。该值与描述流体富集的较早的研究一致。Tokes ZA,et al.,Digestive Enzymes Secreted byCarnivorous Plant Nepenthes-Macferlanei-L.Planta 119(1):39-46(1974)。

实施例2

胃蛋白酶和猪笼草蛋白酶提取物的蛋白质消化绘图

通过质谱绘制猪笼草蛋白酶的消化图

如实施例1制备猪笼草蛋白酶提取物。

蛋白质的消化使用LEAP HTX-PAL自动进样仪和设计为氢/氘交换(HDX)应用的分配系统在溶液中进行，并且使用AB Sciex Triple-TOF 5600 QqTOF质谱仪收集数据。使用Mascot(v2.3)通过MS/MS数据识别肽。简言之，在10℃，将8μL，8μM蛋白质(XRCC4,XLF,连接酶IV-串联BRCT结构域，PNK，肌红蛋白或细胞色素C)与10μL，11倍浓缩的液体混合2分钟。肌红蛋白和细胞色素C购自Sigma。在稀释至1μM底物浓度之后，注射15μL至冷冻反相LC系统中(4℃)，该系统连接至质谱仪。肽被捕获在5cm，200μm i.d.Onyx C18整体式柱(PhenomenexInc.)上并且在10分钟内用梯度为3％至40％的乙腈洗脱。选择这些分析中检测到的肽的MS/MS光谱的多信息依赖性获得物中的CID片段，类似于气相分馏策略。Blonder J,等人，Proteomic investigation of natural killer cell microsomes using gas-phasefractionation by mass spectrometry.Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins andProteomics 1698(1):87-95(2004)。根据包含所有六个蛋白质序列的小型数据库搜索光谱。测序结果由人工核实。

结果

在适于HDX-MS实验的条件下由富集的流体消化一系列蛋白质。浓缩物的消化特异性在P1和P1’位置(图1)表征，从而支持了与应用于胃蛋白酶的类似研究的比较。Hamuro Y,et al.,Specificity of immobilized porcine pepsin in H/D exchange compatibleconditions.Rapid Communications in Mass Spectrometry 22(7):1041-1046(2008)。在该实施例中，基于如下假设：在富集的流体中所有测量的蛋白质均为猪笼草蛋白酶(即便明显存在一些污染蛋白质)，酶和底物的比例为1：85。

猪笼草蛋白酶数据代表了1612个残基的评估，虽然这没有对应的胃蛋白酶数据(13,766个残基)那么广泛，但是蛋白质组中的序列多样性足够高，从而确保了在P1和P1’位置的水平上的比较。胃蛋白酶的最大特异性看起来位于P1位置。它对于疏水残基F,L和M表现出高效裂解，但是对于P,H,K和P之后的位点的裂解基本被禁止。猪笼草蛋白酶裂解除了G,S,T,V,I和W之外的大多数残基之后的位点。它不仅支持了预期的胃蛋白酶P1残基之后的位点的高速裂解，还在胃蛋白酶消化中禁止的残基处也发生高速裂解，尤其是在K,R和P位点。在P1’位置，胃蛋白酶总体上显示出对疏水残基的倾向性，包括任何带有芳香性的残基。相反，猪笼草蛋白酶表现出在P1’位置几乎没有选择性，除了可能针对G,P和H具有选择性。总体上，猪笼草蛋白酶在P1位置相对于胃蛋白酶显示出显著松弛的特异性，并且提供了非常高效的迹象。

实施例3

通过胃蛋白酶和猪笼草蛋白酶提取物绘制多结构域蛋白质XRCC4的消化图

DNA损伤修复中所涉及的络合物的HD交换

如实施例1制备猪笼草蛋白酶提取物。

含有BRCT的XRCC4(1-200)的母液以及含有BRCT的XRCC4(全长)的母液在缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5)中稀释至等摩尔浓度(10μM)并且在4℃下孵育最少30分钟以提升络合作用。样品保持在4℃下直至进行HDX分析。等份样品在20℃下通过加入D₂O(25％v/v)进行氘化持续2分钟。随后以两种方式对等份样品进行消化。在第一消化策略中，蛋白质氘化作用通过将样品加至冷冻的100mM甘氨酸-HCl(pH2.5)中进行淬灭，并且淬灭的蛋白质溶液被注入胃蛋白酶微反应器中。该微反应器安装在注射器阀和C18柱之间的HTX-PAL系统中。蛋白质消化物捕获在整体式C18毛细柱上并且洗脱至质谱仪中。所有射流元件，包括微反应器，冷冻在4℃下以在分析时间期间(<15min)最小化氘返回交换。在第二消化策略中，在10℃下，等量的氘化蛋白质分别被3μL或5μL的11倍浓度的猪笼草液体同时淬灭和消化持续3min或5min。样品被注入连接至质谱仪的冷冻LC-系统中。

重复进行质量位移测量(4次或更多次)并且所述质量位移测量参考对照蛋白质状态—游离XRCC4(1-200)，游离XRCC4(全长)以及游离LigIV-BRCT。每种肽的平均氘水平使用Mass Spec Studio测定，Mass Spec Studio是Hydra v1.5重建的。Slysz GW,et al.,Hydra:software for tailored processing of H/D exchange data from MS or tandemMS analyses.Bmc Bioinformatics 10(2009)。(a)如果质量位移中的微小扰动使用来自每种状态的分析结果的汇集的标准偏差通过了双尾t测试(p<0.05)那么被认为是显著的；(b)如果质量位移中的微小扰动通过了分配分析以防止光谱重叠那么被认为是显著的，以及(c)如果质量位移中的微小扰动超过了基于位移噪音的测量值且假设其正常分配的临界位移值(±2s.d.)那么被认为是显著的。Bennett MJ,等人,Discovery andCharacterization of the Laulimalide-Microtubule Binding Mode by Mass ShiftPerturbation Mapping.Chemistry & Biology 17(7):725-734(2010)。

结果

为了确定松弛的特异性是否体现为对用于HDX-MS应用的序列绘图中的改进，分析全长XRCC4，其是含有球状结构域和延长的螺旋状茎以及长的无序C-末端的蛋白质。HammelM,等人,XLF Regulates Filament Architecture of the XRCC4.Ligase IVComplex.Structure 18(11):1431-1442(2010)；和Junop MS,等人,Crystal structure ofthe Xrcc4DNA repair protein and implications for end joining.Embo J 19(22):5962-5970(2000)。将这些多结构域蛋白质包含在单一消化规程中具有挑战性，具体而言，在体内，无序区域会导致胃蛋白酶消化不良，因为它们相对缺少疏水残基并且富含脯氨酸和带电荷的残基。Dunker AK,et al.Intrinsically disordered protein.Journal ofMolecular Graphics & Modelling 19(1):26-59(2001)。对这种蛋白质的胃蛋白酶和猪笼草蛋白酶绘图在图2中显示。在该比较中，使用各种不同的蛋白酶的量和回归MS/MS实验对这两种酶进行详尽绘图。相对于胃蛋白酶的187个肽(浅灰色柱)，猪笼草蛋白酶提供更好的全长蛋白质覆盖范围：猪笼草蛋白酶的357个肽(深灰色柱)。(两种酶的11个残基的平均肽长度相同。)两种酶表现出带有大量重叠肽的球状和茎区域，但是由猪笼草蛋白酶提供的互补性更加明显。例如，猪笼草蛋白酶在球状结构域(残基1-30)中提供显著更深的β-片区域的覆盖。无序的C-末端区域也以大得多的程度被覆盖，并且以显著较高的冗余水平覆盖。使用猪笼草蛋白酶的条件下，该无序尾部区域中的每个残基得到16倍的覆盖，使用胃蛋白酶仅得到4.7倍的覆盖。

肽检测中任何偏差的存在通过选择平均检索分数作为度量标准进行研究(图3)。该方法强调了作为限定序列绘图的原则方式的序列识别中的置信度。一个柱形概括(outliner)是R。末端在R的肽的较高的分数可能反映了较高的平均肽强度和较好的片段化的组合，这与从基于胰蛋白酶的自下而上的蛋白质组学所获知的一致。Warwood S,etal.Guanidination chemistry for qualitative and quantitative proteomics.RapidCommunications in Mass Spectrometry 20(21):3245-3256(2006)。

实施例4

不同酶-底物比例的XRCC4的消化

更加详细地检测了酶效率。简单地通过改变酶-底物比例可使肽质量绘图发生改变的程度或可调节的程度在图4中显示。对于溶液中消化而言，猪笼草蛋白酶载荷在50倍的范围内发生改变。对于胃蛋白酶实验而言，使用浆状物形式的固定的胃蛋白酶，而非游离胃蛋白酶，以避免大量胃蛋白酶自溶。酶载荷在8倍范围内发生改变，较低的量产生不良肽强度，较高的量对绘图没有影响。已发现猪笼草蛋白酶产生非常低的自溶曲线，甚至在较高的载荷条件下也产生非常低的自溶曲线。聚集肽离子色谱(PIC)用作有效消化的测量。在0.38:1(猪笼草蛋白酶：底物)与520:1(胃蛋白酶：底物)条件下相对类似的分布的比较代表了在HDX-样应用中猪笼草蛋白酶相对于胃蛋白酶的效率显著提高了1400倍。

猪笼草蛋白酶消化物可通过改变酶载荷更加容易地从大片段调节至小片段，由此产生可变的XRCC4表示。这通过图4A中在PIC中从低载荷条件下的长滞留时间转变至高载荷条件下的短滞留时间来说明。这种转变与最丰富的肽的平均肽长度从低酶载荷条件下的大于12转变至高酶载荷条件下的10相关。相反，改变胃蛋白酶载荷并未显著改变PIC或平均肽长度(图4B)。强迫流动胃蛋白酶微反应器可改善调节，但不太可能产生较小的片段。

实施例5

通过猪笼草蛋白酶提取物消化麦胶蛋白

通过猪笼草蛋白酶消化麦胶蛋白使用LEAP HTX-PAL自动进样器和设计用于氢/氘交换(HDX)应用的分配系统在溶液中执行。使用AB Sciex Triple-TOF 5600QqTOF质谱仪采集数据。使用Mascot(v2.3)从MS/MS数据中识别肽。简言之，将12pmol粗麦胶蛋白(购自Sigma Aldrich)与2μL实施例1生成的100倍浓缩的提取物混合。消化之后，将整体量注入与质谱仪连接的反相LC系统。在7cm，150μm i.d.Magic C18柱上捕获肽并且在10分钟或30分钟内用从10％至40％梯度的乙腈洗脱。选择在这些分析中所检测到的肽的MS/MS图谱的多信息依赖性获得物的CID片段。在含有所有识别的小麦麦胶蛋白(α,β,γ,ω)蛋白质以及低分子量和高分子量麦谷蛋白的序列的微小数据库中进行光谱检索。图5显示了37℃下，对来自小麦的麦胶蛋白进行猪笼草蛋白酶消化1分钟，5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，60分钟，130分钟，360分钟或810分钟之后，使用LC-MS/MS所识别的所有肽的平均长度。分数上95％的置信度切割(p＜0.05)用于除去假阳性识别。肽长度的相对标准偏差在插图中显示。

图6显示了在37℃下，消化1分钟，5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，60分钟，130分钟，360分钟或810分钟之后通过LC-MS/MS识别的肽的数量，以长度分组。数据如图5所示。

图7显示了与图5的数据相同的数据，作为在37℃下消化10分钟，60分钟，120分钟，360分钟或810分钟之后获得某一长度的概率。

实施例6

猪笼草蛋白酶提取物的纯化

提取物的纯化

50x 2cm ID柱中的琼脂糖固定的胃酶抑素在20mM甘氨酸-HCl(pH2.5-3)中平衡。过滤的瓶状体液体(如实施例1所述的制备)通过柱循环两次，并且用100mL平衡缓冲液(20mM甘氨酸HCl，pH2.5)洗涤柱。用100mM碳酸氢铵(pH 8.7)洗脱柱并且收集各部分。为了保持最大酶活性，在用pH2.5的2M甘氨酸HCl收集部分之后立即将pH降低至4。使用消化分析验证活性，合并最大活性部分并且基于原始流体体积将其浓缩至大约80倍。

实施例7

重组猪笼草蛋白酶I

猪笼草蛋白酶I的基因(参见SEQ ID NO:1，编码氨基酸残基20-413，来自小猪笼草，没有植物信号序列)由猪笼草蛋白酶I cDNA制备，使其位于Ndel和HindIII限制位点之间。使用T4DNA连接酶(1U)(New England Bio,NEB)，T4DNA连接酶缓冲液(NEB)，ATP(0.5mM)(NEB)，0.5μg pET21a载体和2μg猪笼草蛋白酶I cDNA，将该序列克隆至pET21a中。在18℃下孵育4小时。将连接反应混合物(5μL)加至200μL NovaBlue感受态细胞中并在冰上孵育15分钟。通过热休克(42℃下45秒，随后立即放在冰上，带有1ml LB培养基)转化细胞并且在37℃下孵育1小时，且与抗生素(四环素和氨苄青霉素)一同接种。在确认基因存在于若干白色集落中之后，选择代表性的集落用于大量质粒提取(maxiprep)。得到的重组质粒pET21a/R.NepI通过上述热休克转化至大肠杆菌C41中，以在IPTG的诱导下进行表达。在此，细胞生长至OD₆₆₀为0.6并且在37℃下用0.1mM IPTG诱导四个小时。所表达的蛋白质进入包涵体内。

包涵体如下进行分离。对细胞进行离心处理，加入蔗糖裂解缓冲液(25％蔗糖，50mM TrisCl pH 7.4，1mM EDTA，1mM NaN₃，以及蛋白酶抑制剂)，细胞经历四轮冷冻/融化并且进行超声处理。随后加入DNAse和RNAse持续30分钟，在室温下孵育。对制备得到的产物进行离心(约15min，在5000x g条件下)以使包涵体和膜片段成为小粒。将这种小粒重悬于Triton缓冲液(50mM TrisCl pH 7.4，10mM NaCl，1mMβ-巯基乙醇，1mM NaN₃，0.5％TritonX100+蛋白酶抑制剂)并在冰上进行超声处理。再进行一次离心处理，以使包涵体成为小粒，并且用不含Triton的缓冲液(50mM TrisCl pH 7.4，10mM NaCl，1mMβ-巯基乙醇，1mM NaN₃，蛋白酶抑制剂)在冰上洗涤小粒两次(搅拌并进行超声处理)。

随后对蛋白质小粒进行再折叠。将1g包涵体悬浮于1L pH为10.5的50mM CAPS，8M尿素，1mM EDTA，1mM甘氨酸，500mM NaCl，300mMβ-巯基乙醇中并震荡1小时。用pH为11的50mM Tris透析悬浮液两次，每次持续1小时，随后用pH为7.5的50mM Tris透析一天，最后用含有300mM的NaCl的pH为7.0的磷酸盐缓冲液透析。

在高速条件(10000x g，持续15分钟)下离心处理溶液，以除去任何未再折叠的蛋白质，并且通过0.22μm的膜过滤上清液。在pH为2.5(甘氨酸-HCl)、4℃条件下活化猪笼草蛋白酶I过夜。从1L细胞培养物开始，折叠的活化的蛋白质的产量为10mg至100mg。

实施例8

重组猪笼草蛋白酶II

猪笼草蛋白酶II的cDNA(来自小猪笼草，没有植物信号序列)用于制备猪笼草蛋白酶II cDNA。使用T4DNA连接酶(1U)(New England Bio,NEB)，T4DNA连接酶缓冲液(NEB)，ATP(0.5mM)(NEB)，0.5μg pET21a载体和2μg猪笼草蛋白酶II cDNA，将该序列克隆至pET21a中，位于Ndel和HindIII限制位点之间。在18℃下孵育4小时。将连接反应混合物(5μL)加至200μL NovaBlue感受态细胞中并在冰上孵育15分钟。通过热休克(42℃下45秒，随后立即放在冰上，带有1ml LB培养基)转化细胞并且在37℃下孵育1小时，且与抗生素(四环素和氨苄青霉素)一同接种。在确认基因存在于若干白色集落中之后，选择代表性的集落用于大量质粒提取。得到的重组质粒pET21a/R.NepI通过上述热休克转化至大肠杆菌C41中，以在IPTG的诱导下进行表达。在此，细胞生长至OD₆₆₀为0.6并且在37℃下用0.1mM IPTG诱导四个小时。所表达的蛋白质进入包涵体内。

包涵体如下进行分离。对细胞进行离心处理，加入蔗糖裂解缓冲液(25％蔗糖，50mM TrisCl pH 7.4，1mM EDTA，1mM NaN₃，以及蛋白酶抑制剂)，细胞经历四轮冷冻/融化并且进行超声处理。随后加入DNAse和RNAse持续30分钟，在室温下孵育。对制备得到的产物进行离心(约15min，在5000x g条件下)以使包涵体和膜片段成为小粒。将这种小粒重悬于Triton缓冲液(50mM TrisCl pH 7.4，10mM NaCl，1mMβ-巯基乙醇，1mM NaN₃，0.5％TritonX100+蛋白酶抑制剂)并在冰上进行超声处理。再进行一次离心处理，以使包涵体成为小粒，并且用不含Triton的缓冲液(50mM TrisCl pH 7.4，10mM NaCl，1mMβ-巯基乙醇，1mM NaN₃，蛋白酶抑制剂)在冰上洗涤小粒两次(搅拌并进行超声处理)。

随后对蛋白质小粒进行再折叠。将1g包涵体悬浮于1L pH为10.5的50mM CAPS，8M尿素，1mM EDTA，1mM甘氨酸，500mM NaCl，300mMβ-巯基乙醇中并震荡1小时。用pH为11的50mM Tris透析悬浮液两次，每次持续1小时，随后用pH为7.5的50mM Tris透析一天，最后用含有300mM的NaCl的pH为7.0的磷酸盐缓冲液透析。

在高速条件(10000x g，持续15分钟)下离心处理溶液，以除去任何未再折叠的蛋白质，并且通过0.22μm的膜过滤上清液。在pH为2.5(甘氨酸-HCl)、4℃条件下活化猪笼草蛋白酶II过夜。从1L细胞培养物开始，折叠的活化的蛋白质的产量为10mg至100mg。

实施例9

猪笼草蛋白酶对麦胶蛋白的消化绘图

猪笼草蛋白酶提取物如实施例1所描述的那样制备。纯化的猪笼草蛋白酶提取物如实施例6所描述的那样制备。重组猪笼草蛋白酶I如实施例7所描述的那样制备。

麦胶蛋白消化如实施例5所描述的那样进行，除了底物与酶的比例为约1000:1。麦胶蛋白用猪笼草蛋白酶提取物、纯化的猪笼草蛋白酶提取物或重组的猪笼草蛋白酶I在37℃下消化2小时。

麦胶蛋白是在小麦和其他谷物中发现的一类蛋白质。麦胶蛋白高度富含脯氨酸和谷氨酰胺残基。我们已确定重组猪笼草蛋白酶I在pH为2-3的条件下非常有效地消化麦胶蛋白。重组猪笼草蛋白酶I优先进行P1裂解非常类似于浓缩的液体提取物和提取物的纯化部分(图8A)。意想不到的是，相对于纯化的提取物和重组猪笼草蛋白酶I，提取物表现出对谷氨酰胺更高的优先性。

重组猪笼草蛋白酶I优先进行P1裂解与浓缩的液体提取物以及提取物的纯化部分非常类似(图8B)。意想不到的是，相对于纯化的提取物或重组猪笼草蛋白酶I，提取物表现出对脯氨酸更高的优先性。

提取物包含猪笼草蛋白酶I和II，但是纯化策略回收的活性猪笼草蛋白酶II比猪笼草蛋白酶I少得多。不受任何理论的限制，提取物在P1谷氨酰胺位置和P1’脯氨酸位置的裂解的加强被认为是由猪笼草蛋白酶II和/或猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II的协同作用引起的。

实施例10

猪笼草蛋白酶蛋白质的比较

已知和推定的猪笼草蛋白酶蛋白质的蛋白质序列使用Clustal 2.1多序列比对进行比对。猪笼草蛋白酶I的序列是：奇异猪笼草(GenBank登录号：AFV26024)，小猪笼草(GenBank登录号：BAD07474)，翼状猪笼草(GenBank登录号：BAF98915)，玉米(NCBI参考序列:NP_001150925)和水稻(GenBank登录号：BAD38020)。猪笼草蛋白酶II的序列是：奇异猪笼草(GenBank登录号：AFV26025)，小猪笼草(GenBank登录号：BAD07475)，玉米(NCBI参考序列:NP_001149229)和水稻(GenBank登录号：BAD82000)。得到的比对结果在图9中显示。图10显示了说明不同物种之间的猪笼草蛋白酶蛋白质的相关性的系统树。表1显示了各个序列之间成对比对分数。

表1

序列1	序列2	分数
			奇异猪笼草猪笼草蛋白酶I	奇异猪笼草猪笼草蛋白酶II	65
奇异猪笼草猪笼草蛋白酶I	小猪笼草猪笼草蛋白酶I	94
			奇异猪笼草猪笼草蛋白酶I	小猪笼草猪笼草蛋白酶II	66
奇异猪笼草猪笼草蛋白酶I	翼状猪笼草猪笼草蛋白酶I	99
			奇异猪笼草猪笼草蛋白酶I	水稻猪笼草蛋白酶I	39
奇异猪笼草猪笼草蛋白酶I	水稻猪笼草蛋白酶II	24
			奇异猪笼草猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶I	39
奇异猪笼草猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶II	26
			奇异猪笼草猪笼草蛋白酶II	小猪笼草猪笼草蛋白酶I	64
奇异猪笼草猪笼草蛋白酶II	小猪笼草猪笼草蛋白酶II	96
			奇异猪笼草猪笼草蛋白酶II	翼状猪笼草猪笼草蛋白酶I	65
奇异猪笼草猪笼草蛋白酶II	水稻猪笼草蛋白酶I	37
			奇异猪笼草猪笼草蛋白酶II	水稻猪笼草蛋白酶II	24
奇异猪笼草猪笼草蛋白酶II	玉米猪笼草蛋白酶I	36
			奇异猪笼草猪笼草蛋白酶II	玉米猪笼草蛋白酶II	23
小猪笼草猪笼草蛋白酶I	小猪笼草猪笼草蛋白酶II	66
			小猪笼草猪笼草蛋白酶I	翼状猪笼草猪笼草蛋白酶I	94
小猪笼草猪笼草蛋白酶I	水稻猪笼草蛋白酶I	40
			小猪笼草猪笼草蛋白酶I	水稻猪笼草蛋白酶II	25
小猪笼草猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶I	38
			小猪笼草猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶II	26
小猪笼草猪笼草蛋白酶II	翼状猪笼草猪笼草蛋白酶I	66
			小猪笼草猪笼草蛋白酶II	水稻猪笼草蛋白酶I	38

小猪笼草猪笼草蛋白酶II	水稻猪笼草蛋白酶II	27
			小猪笼草猪笼草蛋白酶II	玉米猪笼草蛋白酶I	39
小猪笼草猪笼草蛋白酶II	玉米猪笼草蛋白酶II	23
			翼状猪笼草猪笼草蛋白酶I	水稻猪笼草蛋白酶I	39
翼状猪笼草猪笼草蛋白酶I	水稻猪笼草蛋白酶II	25
			翼状猪笼草猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶I	39
翼状猪笼草猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶II	26
			水稻猪笼草蛋白酶I	水稻猪笼草蛋白酶II	28
水稻猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶I	35
			水稻猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶II	23
水稻猪笼草蛋白酶II	玉米猪笼草蛋白酶I	24
			水稻猪笼草蛋白酶II	玉米猪笼草蛋白酶II	15
玉米猪笼草蛋白酶I	玉米猪笼草蛋白酶II	26

上述实施例中列举的数据表明猪笼草蛋白酶(不论作为混合物或其纯化的成分或重组成分)有效消化麸质，然而，胃蛋白酶却不能有效消化麸质。因此，本发明提供了通过使用猪笼草蛋白酶的混合物或其纯化的成分或重组成分消化含有麸质的蛋白质中的麸质的方法。

虽然出于清楚理解的目的通过举例说明以及实例的方式对上述内容做了详细描述，但是本领域技术人员会理解的是，可在所附的权利要求的范围内进行一些改变和改良。此外，本文提供的每个参考文献的全部内容通过引用并入本文，这与通过引用单独合并每个参考文献的程度相同。

Claims (4)

1.有效量的猪笼草蛋白酶在制备用于调节有此需要的患者体内的麸质不耐受、乳糜泄、小麦过敏症或疱疹样皮炎的药物中的应用，其中，所述猪笼草蛋白酶由SEQ ID NO:1编码，并且所述猪笼草蛋白酶保持蛋白酶活性，从而使麸质被所述猪笼草蛋白酶降解。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述猪笼草蛋白酶在所述患者食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之前给药于所述患者

3.如权利要求1所述的应用，其中，所述猪笼草蛋白酶在所述患者食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品的同时给药于所述患者。

4.如权利要求1所述的应用，其中，所述猪笼草蛋白酶在所述患者食用含有麸质或怀疑含有麸质的食品之后给药于所述患者。

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