CN105486851A - 一种基于荧光共振能量转移技术的前列腺素受体4筛选模型 - Google Patents

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Abstract

一种利用分辨荧光技术实现的前列腺素E2受体4拮抗剂活性高通量筛选，通过确定稳转细胞株293c18/EP4的拮抗剂药物筛选模型造模条件，确定最佳细胞数为2500cells/well，所得到Forskolin刺激结果与标准曲线趋势最为一致。该模型验证了PGD2对EP4的激动作用，和L-161982对EP4的拮抗作用。包括以下步骤：(1)前列腺素E2受体4拮抗剂筛选模型的建立与优化：标准曲线的测定及最佳细胞数确定；(2)验证模型可靠性：激动剂和拮抗剂验证。方法简便快捷；荧光检测值灵敏度高，提高检测精确度；结果稳定可靠，重现性好。

Description

一种基于荧光共振能量转移技术的前列腺素受体4筛选模型
技术领域
本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了前列腺素受体4拮抗剂的高通量筛选模型，用于待测样品对前列腺素受体4拮抗剂活性的高通量检测。
背景技术
前列腺素受体4(EP4)是一种G蛋白偶联受体，与激活性G蛋白(Gs)偶联，激活后可使细胞内下游cAMP含量上升，广泛参与了细胞代谢的过程。EP4在前列腺素类物质介导的过敏性炎症和免疫性炎症疾病进程中发挥着重要的调节作用。所以建立EP4拮抗剂筛选模型对治疗类风湿性关节炎等疾病具有重要意义。
cAMP是一种重要的第二信使，介导神经传导递质，荷尔蒙及药物的不同生理应答。胞内cAMP浓度受到两种膜联酶AC和PDE调控，AC活性促进ATP合成cAMP，PDE可将cAMP降解为AMP。AC活性受到多种GPCRs的调控，GPCRs可与两种作用相反的GTP结合蛋白Gαs和Gαi相互作用而产生不同的效应。这些G蛋白是由Gα，Gβ和Gγ三种亚基组成的异三聚体分子。激动剂介导的GPCRs激活可导致GTP结合上Gα亚基，引起构象改变，导致三聚体解离成Gα和Gβγ。解离后，Gαs主要参与AC的激活，而Gαi和Gβγ对AC有抑制作用。测量胞内cAMP是检测待测化合物对于GPCR介导的AC激活或抑制作用的方法。
cAMPdynamic2assay是一种均相时间分辨荧光共振能量转移免疫分析方法，以检测在GPCRs调控下AC活性变化后产生的cAMP。该方法基于d2标记的cAMP示踪剂与样本cAMP竞争结合Eu3+-穴状物标记的cAMP特异性抗体的结合位点。
当抗体结合了d2-cAMP示踪剂，337nm处的激光可激发Eu3+-穴状物分子，其发出的能量被转移到示踪剂的d2分子上，而发出665nm的荧光，在665nm处的荧光强度随着待测样品中的cAMP含量的增多而减弱，因此信号强度与样品中cAMP浓度成反比。
对于Gαs耦联的受体，细胞受到激动剂作用而激活会导致cAMP水平增加，同时665nm处的荧光强度减弱。加入拮抗剂后该反应逆转，导致信号增强。对于Gαi耦联的受体，细胞在AC激动剂Forskolin和激动剂的共同作用下被激活。激动剂可抑制Forskolin诱导的cAMP的产生，因此cAMP-d2信号相对于由Forskolin单独处理的细胞会增加。而拮抗剂会阻滞激动剂的作用，导致cAMP-d2信号的增加。
时间分辨荧光技术(time-resolvedfluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于荧光的前列腺素受体4拮抗剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
本发明的技术方案：首先用含有zeocin的培养基培293c18/EP4稳转细胞株，培养一段时间后，加入激动剂，反应45min。最后加入d2标记的cAMP示踪剂与样本cAMP竞争结合Eu3+穴状物标记的cAMP特异性抗体的结合位点，反应1小时。最后在ParadigmTMDetectionPlatform检测信号强度评价样品中cAMP浓度，信号与样品中cAMP浓度成浓度依赖。最终实现待测样品对芳香化酶抑制活性的高通量筛选
本发明利用荧光的方法建立了前列腺素受体4拮抗剂高通量筛选模型。
步骤一：前列腺素受体4拮抗剂筛选模型的建立与优化。
步骤二：阳性药验证模型可靠性。
步骤三：高通量筛选模型验证。
附图说明：
图1：Forskolin作用不同细胞数所产生的信号与标准曲线的对比，结果表示为Mean±SD。
图2：PGD2可刺激EP4减少cAMP生成且成量效依赖性，结果表示为Mean±SD
图3：L-161982可拮抗PGD2刺激EP4减少cAMP生成且成量效依赖性，结果表示为Mean±SD。
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式：
一、前列腺素受体4拮抗剂筛选方法建立
1、实验材料
(1)细胞株：293c18/EP4
(2)完全培养：DMEM；10％FBS
(3)选择培养：2μL/mLzeocin
(4)StimulationBuffer(SB)：含1mMIBMX的DMEM。
(5)主要仪器：CO2培养箱；384孔板；ParadigmTMDetectionPlatform
2、实验步骤
(1)细胞培养
1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80％，达到对数生长期。
2)弃去培养基后用1mLPBS冲洗细胞一次。
3)用3mL0.5mMEDTA消化细胞5min后用3mL培养基终止消化。
4)1000rpm离心5min。
5)弃去上清液后用适量培养基重悬细胞，对细胞计数。
6)用培养基稀释细胞悬液至6mL，使细胞密度达到5×105cells/mL，将此细胞悬液移入T25培养瓶中，在37℃/5％CO2环境下培养细胞。
7)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选EP4拮抗剂试验的293c18/EP4细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mMEDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。
(2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定
1)配制cAMP标准稀释液：cAMP标准溶液(试剂盒自带)逐级稀释为最终浓度的2倍。
2)配制Forskolin梯度稀释液：需要用Forskolin对细胞进行刺激，所以应将Forskolin储备液逐级稀释为最终浓度的2倍。
3)配制不同浓度的细胞稀释液：用SB将1.(7)中重悬好的细胞分别稀释为200cells/μL、500cells/μL及800cells/μL。
4)加样：将2.(1)中稀释好的cAMP溶液按每个浓度1个复孔，10μL每孔加入384孔板中，再加入1孔10μL的SB作为negativecontrol(NC)；将2.(2)中稀释好的Forskolin溶液按每个浓度2个复孔，5μL每孔加入384孔板中，再加入2孔每孔各5μL的SB作为cellnegativecontrol(CNC)。接着向不同浓度的Forskolin溶液及CNC中加入2.(3)配制好的不同浓度的细胞稀释液各5μL。将384孔板在500rpm下离心15s，使10μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育45min。
5)终止试剂：用Lysisbuffer(LB)将cAMP-d2稀释40倍，将anti-cAMP稀释20倍。取适量LB与稀释好的anti-cAMP溶液按1∶1混合，向NC及CNC中每孔各加入10μL；将剩余cAMP-d2溶液与anti-cAMP溶液按1∶1混匀后加入到其余各孔，每孔10μL。将384孔板在500rpm下离心15s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
6)检测：孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的ParadigmTMDetectionPlatform上检测。处理数据，确定最佳细胞数及Forskolin的EC80。
(3)激动剂验证
1)EP4激动剂PGD2使用DMSO配制成10mM储备液，因EP4偶联Gαi，需加入Forskolin刺激cAMP产生。首先根据2.(6)中Forskolin的EC80配制FSB，再用FSB逐级稀释为最终浓度的2倍。
2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将1.(7)中重悬好的细胞稀释为2.(6)中得到的最佳细胞浓度。
3)加样：将3.(1)中稀释好的PGD2溶液按每个浓度2个复孔，5μL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5μL的SB，其中2孔作为CNC，另2孔作为non-stimulatedcontrol(NSC)。将3.(2)配制的细胞溶液按每孔5μL加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心15s，使10μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育45min。
4)按2.(5)配制终止试剂。向CNC中每孔加入10μLLB/anti-cAMP溶液(1∶1)，向NSC及其余各孔每孔加入10μLcAMP-d2/anti-cAMP溶液(1∶1)。将384孔板在500rpm下离心15s使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
5)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的BeckmanParadigm上检测。处理数据，确定PGD2的EC50及EC80。
(4)拮抗剂验证
1)293c18/EP4拮抗剂L-161982使用DMSO溶液配制成100mM储备液，以SB逐级稀释为最终浓度的4倍。
2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将1.(7)中重悬好的细胞稀释为2.(6)中得到的最佳细胞浓度。
3)加样：将4.(1)中稀释好的L-16182溶液按每个浓度2个复孔，2.5μL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5μL的SB，其中2孔作为CNC，另2孔作为NSC，再加入2孔每孔各2.5μL的SB，作为cellpositivecontrol(CPC)。将4.(2)配制的细胞溶液按每孔5μL加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心15s，使7.5μL试剂(CNC及NSC为10μL)混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育30min。
4)根据2.(6)中Forskolin的EC80配制FSB，用FSB按3.(5)中PGD2的EC80配制PGD2溶液。向CPC中加入FSB，每孔2.5μL；其余各孔加入PGD2溶液，每孔2.5μL；CNC及NSC不加操作。将384孔板在500rpm下离心15s，使10μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育45min。
5)按2.(5)配制终止试剂。向CNC中每孔加入10μLLB/anti-cAMP溶液(1∶1)，向NSC、CPC及其余各孔每孔加入10μLcAMP-d2/anti-cAMP溶液(1∶1)。将384孔板在500rpm下离心15s使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
6)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的ParadigmTMDetectionPlatform上检测。处理数据，确定拮抗剂的IC50。
实验结果
确定了稳转细胞株293c18/EP4的拮抗剂药物筛选模型造模条件，每孔细胞数为500cells/μL，即为2500cells/well，所得到Forskolin刺激结果与标准曲线趋势最为一致(见图1)。通过该模型验证了PGD2对EP4的激动作用，其EC50为1.333198.4nM(见图2)；验证了L-161982对EP4的拮抗作用，其IC50为580.7nM(见图3)。

Claims (1)

1.前列腺素E2受体4拮抗剂药物筛选模型高通量筛选模型，用激动剂对培养过的293c18/EP4稳转细胞株进行反应后加入d2标记的cAMP示踪剂与样本cAMP竞争结合Eu3+穴状物标记的cAMP特异性抗体的结合位点反应1小时，最后在ParadigmTMDetectionPlatform检测信号强度评价样品中cAMP浓度。其特征在于确定了稳转细胞株293c18/EP4的拮抗剂药物筛选模型造模条件，所用的cAMP-d2assay方法简便省时，只需两到三个小时即可得到结果，即开即用，毋需用放射性同位素和有机溶剂。灵敏度高，步骤少，无损失，结果准确，能够满足高通量筛选的要求。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1477960A (zh) * 2000-10-19 2004-02-25 治疗类风湿性关节炎的ep4受体抑制剂

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Non-Patent Citations (2)

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Title
AKIO MURASE等: "Effect of prostanoid EP4 receptor antagonist,CJ-042,794,in rat models of pain and inflammation", 《EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY》 *
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