CN105461531A - 一种新的倍半萜类化合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的倍半萜类化合物及其制备方法和医药用途，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的倍半萜类化合物，可以从香鳞毛蕨的干燥叶中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能显著减少ox-LDL诱导的HUVEC凋亡，并且效果呈剂量依赖性，可以用来开发成内皮细胞保护的药物。

Description

一种新的倍半萜类化合物及其制备方法和医药用途
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及从香鳞毛蕨的干燥叶中分离得到的一种倍半萜类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
香鳞毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott.是一种野生多年生蕨类植物，系鳞毛蕨科鳞毛蕨属。主要分布于五大连池、大兴安岭等高寒地区。其生境极其特殊，生于海拔700-2400米的林下或高寒地区的滑石坡、森林中的碎石坡上和火山周围的岩浆缝隙中。主要分布于黑龙江省五大连池地质公园内、塔河县白卡兽山、呼中的大白山的高山地带及小兴安岭北部地区。其中尤以生长于五大连池的香鳞毛蕨活性最强。民间流传香鳞毛蕨对银屑病、头皮炎、干癣、痤疮等多种皮肤病有良好的治疗效果。
香鳞毛蕨的化学成分主要有间苯三酚类、黄酮类以及萜类等，具有多种药理作用，是一种药用价值很高的植物。间苯三酚类不仅是鱗毛蕨属植物的主要特征性化学成分，也是产生药理活性的主要成分。该类化合物主要由各种脂肪链取代的绵马酸片断和绵马酚片断通过亚甲基连接而成。芳香环上的C-或O-被不同的取代基取代形成了不同的化合物。黄酮类化合物发现的数量不多，代表性的有4种，分别为crassirhizomosideA、B、C和sutchuenosideA。萜类化合物，包括倍半萜和三萜类。
在黑龙江省北部的居民用香鳞毛蕨的水提取液涂擦患处治疗牛皮癣、皮疹、皮炎、痤疮等，有的居民还用其水提取液洗头达到去头屑、止痒的目的。民间验方利用香鳞毛蕨已有几十年的历史，通过多年的人体试验，证实香鳞毛蕨对老年性皮肤瘙痒、各种皮肤病的治疗效果显著。现代药理研究表明香鳞毛蕨具有抗皮肤癣菌作用、治疗银屑病的作用、治疗痤疮作用、止痒及抗过敏作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种从香鳞毛蕨的干燥叶中分离得到的一种倍半萜类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的化合物(Ⅰ)：
所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将香鳞毛蕨的干燥叶粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、60:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
进一步地，步骤(a)中，用75％乙醇热回流提取，合并提取液。
进一步地，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
所述的化合物(Ⅰ)在制备内皮细胞保护的药物中的应用。
所述的药物组合物在制备内皮细胞保护的药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式；
图2为化合物(Ⅰ)计算ECD和实验ECD图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
主要材料、试剂来源及仪器类型：
乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
(a)香鳞毛蕨的干燥叶(10kg)粉碎，用75％乙醇热回流提取(30L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物(125g)；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1(8个柱体积)、60:1(8个柱体积)、35:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和1:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(27g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(8个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(15g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(151mg)。
结构确证：无色结晶；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z259.1722，结合核磁特征可得分子式为C15H24O2，不饱和度为4。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，500MHz)：H-2(1.71，dd，J＝15.0，5.3)，H-2(1.29，m)，H-3(1.40，m)，H-3(1.29，m)，H-4(1.87，m)，H-5(1.38，m)，H-6(1.43，m)，H-6(1.19，m)，H-7(1.14，m)，H-8(1.65，m)，H-8(1.16，m)，H-9(1.89，m)，H-9(1.00，t，J＝15.3)，H-12(1.14，s)，H-13(9.58，s)，H-14(0.87，s)，H-15(0.83，d，J＝6.7)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，125MHz)：77.1(C，1-C)，33.8(CH2，2-C)，28.0(CH2，3-C)，27.7(CH，4-C)，42.6(CH，5-C)，24.2(CH2，6-C)，35.9(CH，7-C)，22.7(CH2，8-C)，28.3(CH2，9-C)，37.4(C，10-C)，59.7(C，11-C)，18.3(CH3，12-C)，206.8(CH，13-C)，19.7(CH3，14-C)，18.4(CH3，15-C)；碳原子标记参见图1。1H和13CNMR谱显示了三个甲基信号[δH1.14(3H，s，H-12)，0.87(3H，s，H-14)和0.83(3H，d，J＝6.7Hz，H-15)；δC18.3(C-12)，19.7(C-14)和18.4(C-15)]，五个亚甲基，三个次甲基[一个醛基δH9.58(s，H-13)；δC206.8(C-13)]和三个季碳[一个含氧季碳δC77.1(C-1)]。通过核磁数据分析可知C-11为连有一个醛基；HMBC相关性H-13(δH9.58，s)与C-12(δC18.3)，C-1(δC77.1)和C-7(δC35.9)的相关性验证了上述推论。ROESY谱中H-3β与Me-12和H-6β，Me-12与H-6β，以及H-6β与Me-15的相关性表明Me-12和Me-15为β构型；H-4与H-5和Me-14，Me-14与H-5和H-9α，以及9α与H-7交叉峰表明H-4，H-5，H-7和Me-14为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、材料和仪器
人脐静脉内皮细胞珠(HUVEC)由上海午立生物技术有限公司细胞库提供。化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％。RPMI-1640培养基、MTT、二甲基亚砜均购于Sigma公司。胎牛血清购于HyCLone公司。FITC标记羊抗兔IgG、兔抗人第八因子相关抗原购于北京博奥森生物技术有限公司。MDA含量检测试剂盒购于南京建成生物研究所。AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购于Centrebio公司。乙二胺四乙酸(EDTA)购于广州威佳科技有限公司。
DK-8AD型电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司)，ER-120A型电子分析天平(岛津公司)，6219型电子pH计(上海任氏电子有限公司)，高速低温离心机(Sigma公司)，L420台式低速自动平衡离心机(湘仪离心机仪器有限公司)，SYC-2101水平摇床(其林贝尔仪器制造有限公司)，1000μL微量加样枪×1支、20-100μL微量加样枪×1支、1-20μL微量加样枪×1支(法国吉而森公司)，CO2(培养箱Heraeus公司)，超净台(苏净集团安泰公司)，倒置相差显微镜(德国莱卡公司)，酶标仪(Sigma公司)，FACSCaLibur(流式细胞仪)。
二、试验方法
1、脐静脉内皮细胞的培养
1.1培养条件
将新购入的HUVEC细胞株接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。置于37℃，5％CO2培养箱中，每2天更换1次培养基。
1.2细胞传代
取一瓶HUVEC在倒置相差显微镜下观察细胞，如长成致密的单层，即可进行传代；将培养瓶轻轻摇动数次，悬浮起浮在细胞表面的碎片，然后连培养液一起倒出，吸取2～3mLPBS液加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，重复3次；加入1mL0.25％胰酶，以能覆盖瓶底为限，转动培养瓶，使湿润整个细胞层，置37℃孵育箱内消化2～3min，待确认细胞己收缩变圆时为止；加1mL培养液于培养瓶中终止消化，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液，注入离心管离心(800r/min，5min)后弃去上清液；加入3mL培养液于离心管中，用吸管吸取培养液轻轻吹打数次，使细胞悬重，然后按1:3或1:4分配传代培养；置于孵育箱内37℃、5％CO2恒温箱中培养，24h后换液，通常3-4天可形成单层，此时便可换维持液供实验用。
1.3HUVEC的计数
首先取待测的细胞悬液50μL滴入细胞计数板内，按白细胞计数法，于低倍镜下计数4角的4个大方格内的细胞总数，然后用以下公式计算细胞浓度：4个大方格内的活细胞数/4×104＝细胞数/mL
2、脐静脉内皮细胞的鉴定
在6孔培养板内放置无菌盖玻片1cm×1cm，将内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待内皮细胞长至汇合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗盖玻片，放入100％丙酮中固定15min，用PBS冲洗3次，每次2min，滴加3％的H2O2室温孵育8min，PBS冲洗3次，每次2min，滴加兔抗人硼因子单克隆抗体(1:100)，另一盖玻片上不加一抗作阴性对照4℃过夜。次日，用PBS冲洗3次，每次2min，滴加FITC标一记的羊抗兔IgG，37℃孵育60min，用PBS冲洗3次，每次2min，荧光显微镜下观察并拍照。
3、利用MTT比色法测定HUVEC的细胞活性
3.1利用MTT比色法观察不同浓化合物(Ⅰ)对脐静脉内皮细胞活性的影响
3.1.1传代培养
将HUVEC按2×104/mL的密度用含10％FBS的RPMI-1640培养基接种于96孔板，每孔种植200μL。
3.1.2分组加药
传代细胞培养24h后，用含10％FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为6组：对照组(control)，化合物(Ⅰ)5μg/mL组，化合物(Ⅰ)10μg/mL组，化合物(Ⅰ)20μg/mL组，化合物(Ⅰ)40μg/mL组，化合物(Ⅰ)80μg/mL组，每孔6孔。继续培养48小时后，MTT法检测细胞活性。
3.1.3MTT法检测
直接向每孔加入20μL己配制好的MTT溶液，37℃孵育4h，吸净上清，然后加入150μLDMSO。待结晶充分溶解后，利用酶标仪在波长490nm处测定OD值。
3.2利用MTT比色法观察不同浓度ox-LDL对脐静脉内皮细胞活性的影响
3.2.1传代培养：同上。
3.2.2分组加药
细胞培养24h后，用含10％FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为6组：对照组(control)，ox-LDL(为自制)10μg/mL组，ox-LDL20μg/mL组，ox-LDL40μg/mL组，ox-LDL80μg/mL组，ox-LDL160μg/mL组，每孔6孔。继续培养24小时，MTT法检测细胞活性。
3.3利用MTT比色法观察化合物(Ⅰ)对ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞损伤的干预作用
3.3.1传代培养：同上。
3.3.2分组加药
细胞培养24h后，用10％FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为6组：对照组(control)，ox-LDL50μg/mL组，ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)5μg/mL组，ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)10μg/mL组，ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)20μg/mL每孔6孔。继续培养24小时后，MTT法检测细胞活性。
4、利用流式细胞技术观察化合物(Ⅰ)对ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞凋亡的干预作
4.1用传代培养
将HUVEC按2×105/mL的密度用含10％FBS的RPMI-1640培养基接种于6孔板，每孔种植1500μL。
4.2分组加药
细胞培养24h后，以RPMI-1640无血清培养基血清剥夺24h，使细胞进入静止状态。用含RPML-1640血清培养基配制药物，将细胞随机分为5组：对照组(control)，ox-LDL50μg/mL组，ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)5μg/mL组，ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)10μg/mL组，ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)20μg/mL每孔加1mL含药培养基。
4.3操作步骤
加药后12h取材，把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶细胞消化液消化细胞。细胞消化下来后，转移到离心管内，PBS洗三次(1000g离心10分钟)。加入200μL结合缓冲液，重悬细胞。加入10μLAnnexinv-FITC、10μLPI染色液轻轻混匀。室温避光孵育15分钟，30分钟内上机检测细胞凋亡。
5、统计学分析
采用SPSS13.0统计一软件进行分析，结果表示为：均数士标准差方差齐时，两组比较采用LSD，如多组与对照组比较使用Dunnett检验，当方差不齐时，采用WeLch稳健估计，再采用T3方法两两比较。P<0.05表示有统计学意义。
三、结果及结论
1、不同浓度化合物(Ⅰ)对HUVEC细胞活力的影响
化合物(Ⅰ)药物在一定的浓度范围才能发挥其药理作用，而且不同的细胞体系对药物的敏感性也会有所不同。为此，首先用MTT法确定实验用的药物浓度范围。结果如表1(VS对照组#P<0.01)显示，不同浓度的化合物(Ⅰ)对内皮细胞的作用效应不同，低剂量的药物浓度(5～20μg/mL)细胞活性与对照组比较，没有统计学差异。40μg/mL作用48小时后细胞活力下降了约50％，80μg/mL作用48小时后细胞活力下降了70％，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)，产生了一定的毒副作用。因此本实验所用的化合物(Ⅰ)浓度为5、10、20μg/mL，以排除药物自身对细胞的毒性作用。
2、不同浓度ox-LDL对脐静脉内皮细胞活力的影响
由于氧化低密度脂蛋白氧化程度的差异，氧化低密度脂蛋白的细胞毒性范围会有所不同。因此我们先采用MTT确定ox-LDL细胞毒的范围。结果如表2(VS对照组*P<0.05#P<0.01)所示，不同浓度ox-LDL对HUVEC细胞活性影响不同。与对照组相比，10μg/mL组有促进HUVEC细胞活性增加的趋势，但与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)；20～100μg/mL各组内皮细胞活性随浓度增加而减少，与对照组比较有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。
3、化合物(Ⅰ)对ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞损伤的干预作用
结果如表3(VS.ox-LDLgroup#P<0.01)所示，ox-LDL(50μg/mL)组的细胞活性下降，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)，说明ox-LDL组细胞活性显著降低，ox-LDL(50μg/mL)对正常HUVEC具有损伤作用。化合物(Ⅰ)不同剂量组的细胞活性均高于ox-LDL组，与ox-LDL组比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明此三个剂量组的细胞活性显著高于ox-LDL组，提示化合物(Ⅰ)可抑制ox-LDL诱导的HUVEC损伤。化合物(Ⅰ)10μg/mL和化合物(Ⅰ)20μg/mL组的细胞活性高于化合物(Ⅰ)5μg/mL组，与化合物(Ⅰ)5μg/mL比较有统计学差异(P＝0.01或P<0.01)。化合物(Ⅰ)20μg/mL细胞活性较化合物(Ⅰ)10μg/mL组有升高趋势，但没有统计学差异(P＝0.185)。提示化合物(Ⅰ)的内皮保护作用在一定范围内具有量效关系。
4、化合物(Ⅰ)对ox-LDL诱导损伤的脐静脉内皮细胞凋亡的影响
各组流式细胞结果显示：各组细胞的凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)，ox-LDL组的增殖指数明显升高，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)说明ox-LDL(50μg/mL)对正常HUVEC具有损伤作用。化合物(Ⅰ)不同剂量组的凋亡率均低于ox-LDL组，与ox-LDL组比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明此三个剂量组的凋亡率显著低于ox-LDL组，提示化合物(Ⅰ)可抑制ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。化合物(Ⅰ)不同剂量组的凋亡率随着剂量升高逐渐降低，各组之间差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表4(VSox-LDLgroup#P<0.01)。提示化合物(Ⅰ)的内皮保护效应在一定范围内具有量效关系。
结论，本研究采用MTT法检测发现化合物(Ⅰ)能明显提高ox-LDL损伤的人脐静脉内皮细胞的细胞活力，说明其具有抑制ox-LDL诱导的HUVEC损伤的作用。进一步采用AnnexinV-FITC、PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡，研究发现各浓度组化合物(Ⅰ)均能显著减少ox-LDL诱导的HUVEC凋亡，并且效果呈剂量依赖性。提示化合物(Ⅰ)能通过抑制ox-LDL诱导的HUVEC凋亡来实现内皮保护作用。
表1不同浓度化合物(Ⅰ)对HUVEC细胞活力的影响(n＝6)
组别 细胞活力(％)
Control(对照组) 100.14±3.82
化合物(Ⅰ)5μg/mL 100.45±9.67
化合物(Ⅰ)10μg/mL 101.22±10.57
化合物(Ⅰ)20μg/mL 92.77±8.54
化合物(Ⅰ)40μg/mL 48.92±5.62#
化合物(Ⅰ)60μg/mL 32.79±2.54#6 -->
化合物(Ⅰ)80μg/mL 30.21±2.28#
F value 298.51
P value <0.01
表2ox-LDL对HUVEC细胞活力的影响(n＝6)
组别 细胞活力(％)
Control(对照组) 100.02±5.01
ox-LDL10μg/mL 104.52±4.01
ox-LDL20μg/mL 93.484.77*
ox-LDL40μg/mL 86.96±5.78#
ox-LDL60μg/mL 64.22±3.58#
ox-LDL80μg/mL 57.21±2.54#
F value 116.248
P value <0.001
表3不同剂化合物(Ⅰ)对ox-LDL诱导HUVEC损伤的干预作用(n＝6)
组别 细胞活力(％)
Control(对照组) 100.01±3.74#
ox-LDL50μg/mL 73.92±7.04
ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)5μg/mL 82.59±4.80#
ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)10μg/mL 90.01±3.70#
ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)20μg/mL 93.61±2.11#
F value 29.15
P value <0.001
表4不同剂量化合物(Ⅰ)对ox-LDL诱导HUVEC凋亡的作用(n＝3)
组别 凋亡率(％)
Control(对照组) 1.84±0.05#
ox-LDL50μg/mL 9.87±0.40
ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)5μg/mL 4.65±0.56#
ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)10μg/mL 3.67±0.23#
ox-LDL50μg/mL+化合物(Ⅰ)20μg/mL 2.51±0.17#
F value 274.678
P value <0.001
实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (7)

1.具有下述结构式的化合物（Ⅰ）：
。
2.权利要求1所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：（a）将香鳞毛蕨的干燥叶粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b）步骤（a）中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用70%乙醇洗脱8个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c）步骤（b）中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、60:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d）步骤（c）中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e）步骤（d）中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（Ⅰ）。
3.根据权利要求2所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，其特征在于：步骤（a）中，用75%乙醇热回流提取，合并提取液。
4.根据权利要求2所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（Ⅰ）和药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的化合物（Ⅰ）在制备内皮细胞保护的药物中的应用。
7.权利要求5所述的药物组合物在制备内皮细胞保护的药物中的应用。
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