CN105445477A - 一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。该传感器以AuAg异质合金为基底材料，氮掺杂石墨烯为检测抗体修饰材料，采用层层纳米自组装技术，构建了一个夹心型免疫传感器。利用AuAg异质合金与氮掺杂石墨烯的协同催化作用，显著提高了环境雌激素传感器的灵敏度、扩展了线性范围，对环境雌激素的检测分析具有重要的意义。

Description

一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用，采用N-GS作为检测抗体的标记物，AuAg异质合金作为基底材料，制备一种检测环境雌激素的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
环境雌激素是指一类进入机体后，具有干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏维持机体稳定性和调控作用的化合物。
目前已有的环境雌激素的检测方法很多，但是大多都是需要大型设备和专业的操作人员。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特异性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。电化学免疫传感器具有结构简单、选择性好、操作简便、灵敏度高、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点。本发明制备了一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器。
本发明采用AuAg异质合金为基底材料，N-GS作为检测抗体的标记物，过氧化氢产生电化学信号，提高了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，实现了对环境雌激素的超灵敏分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前环境雌激素检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是基于AuAg异质合金为基底材料，构建了一种无酶，超灵敏的电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将N-GS作为检测抗体的标记物，实现了对环境雌激素的超灵敏检测。
本发明的技术方案如下：
1.一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用
（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将3~8μL、0.5~2mg/mLAuAg异质合金液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6μL环境雌激素抗体，6μL、质量分数为0.5%~2.5%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（3）滴加6μL、0.003~5ng/mL的一系列不同浓度的环境雌激素抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干。
2.AuAg异质合金的制备
（1）将0.001~1mL、0.05~0.1mol/L氯金酸，0.01mL、0.05~0.5mol/L硝酸银和0.1~5mL、0.1~3.5mol/L的聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐PDDA加入到20~200mL的乙二醇溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液在60~185℃下反应20~100h，将所得固体用超纯水洗涤、在10000~15000r/min下离心3次，35~55℃下在真空干燥箱干燥2~24h，得到AuAg异质合金。
3.氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS的制备
（1）称取20~100mg的氧化石墨烯，分散于30~100mL的超纯水中，并加入50~300mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF，充分摇匀，超声0.5~5h；
（2）将混合液在130~160℃下反应0.5~5h，反应结束后，8000~10000r/min下离心10~30min，所得固体在40~60℃下，于真空干燥箱干燥12~48h得到氮掺杂石墨烯N-GS；
（3）将0.1~0.5gN-GS加入到5~15mL无水乙醇中，加入0.1~3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，50~85℃回流0.5~5h，将所得固体在8000~10000r/min下离心10~30min，所得固体在40~60℃下，于真空干燥箱干燥12~24h，制得氨基化N-GS；
（4）将所得氨基化N-GS分散于10~100mL超纯水中，加入0.01~10mL的戊二醛和0.01~10mL、100μg/mL的环境雌激素抗体，室温下振荡12h。
4.所检测的环境雌激素选自下列之一：雌二醇，炔诺酮，己烯雌酚，雌酮，雌三醇，炔雌醇。
本发明的有益成果
（1）N-GS的使用，实现了对检测抗体的标记，同时能够很好的促进电极表面的电子传递，并且协同AuAg异质合金催化作用，提高传感器的灵敏度。
（2）片状N-GS的使用，增加了检测抗体的孵化量，扩展了传感器的线性范围，降低了检出限。
（3）AuAg异质合金的协同作用，既增加了传感器表面的电子传输能量，稳定了传感器表面捕获抗体的负载，同时协同N-GS的催化作用，实现了超灵敏检测。
具体实施方式
实施例1
一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用
（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将3μL、0.5mg/mLAuAg异质合金液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6μL环境雌激素抗体，6μL、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（3）滴加6μL、0.003~5ng/mL的一系列不同浓度的环境雌激素抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干。
实施例2
一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用
（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将5μL、1mg/mLAuAg异质合金液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6μL环境雌激素抗体，6μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（3）滴加6μL、0.003~5ng/mL的一系列不同浓度的环境雌激素抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干。
实施例3
一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用
（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将8μL、2mg/mLAuAg异质合金液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6μL环境雌激素抗体，6μL、质量分数为2.5%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（3）滴加6μL、0.003~5ng/mL的一系列不同浓度的环境雌激素抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干。
实施例4
AuAg异质合金的制备
（1）将0.001mL、0.05mol/L氯金酸，0.01mL、0.05mol/L硝酸银和0.1mL、0.1mol/L的聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐PDDA加入到20mL的乙二醇溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液在60℃下反应20h，将所得固体用超纯水洗涤、在10000r/min下离心3次，35℃下在真空干燥箱干燥2h，得到AuAg异质合金。
实施例5
AuAg异质合金的制备
（1）将0.1mL、0.09mol/L氯金酸，0.01mL、0.3mol/L硝酸银和3mL、0.5mol/L的聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐PDDA加入到80mL的乙二醇溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液在85℃下反应80h，将所得固体用超纯水洗涤、在13000r/min下离心3次，45℃下在真空干燥箱干燥20h，得到AuAg异质合金。
实施例6
AuAg异质合金的制备
（1）将1mL、0.1mol/L氯金酸，0.01mL、0.5mol/L硝酸银和5mL、3.5mol/L的聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐PDDA加入到200mL的乙二醇溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液在185℃下反应100h，将所得固体用超纯水洗涤、在15000r/min下离心3次，55℃下在真空干燥箱干燥24h，得到AuAg异质合金。
实施例7
氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS的制备
（1）称取20mg的氧化石墨烯，分散于30mL的超纯水中，并加入50mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF，充分摇匀，超声0.5h；
（2）将混合液在130℃下反应0.5h，反应结束后，8000r/min下离心10min，所得固体在40℃下，于真空干燥箱干燥12h得到氮掺杂石墨烯N-GS；
（3）将0.1gN-GS加入到5mL无水乙醇中，加入0.1mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，50℃回流0.5h，将所得固体在8000r/min下离心10min，所得固体在40℃下，于真空干燥箱干燥12h，制得氨基化N-GS；
（4）将所得氨基化N-GS分散于10mL超纯水中，加入0.01mL的戊二醛和0.01mL、100μg/mL的环境雌激素抗体，室温下振荡12h。
实施例8
氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS的制备
（1）称取50mg的氧化石墨烯，分散于67mL的超纯水中，并加入120mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF，充分摇匀，超声2h；
（2）将混合液在145℃下反应2h，反应结束后，9000r/min下离心20min，所得固体在50℃下，于真空干燥箱干燥24h得到氮掺杂石墨烯N-GS；
（3）将0.3gN-GS加入到10mL无水乙醇中，加入2mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，55℃回流3h，将所得固体在9000r/min下离心25min，所得固体在50℃下，于真空干燥箱干燥14h，制得氨基化N-GS；
（4）将所得氨基化N-GS分散于50mL超纯水中，加入1mL的戊二醛和1mL、100μg/mL的环境雌激素抗体，室温下振荡12h。
实施例9
氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS的制备
（1）称取100mg的氧化石墨烯，分散于100mL的超纯水中，并加入300mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF，充分摇匀，超声5h；
（2）将混合液在160℃下反应5h，反应结束后，10000r/min下离心30min，所得固体在60℃下，于真空干燥箱干燥48h得到氮掺杂石墨烯N-GS；
（3）将0.5gN-GS加入到15mL无水乙醇中，加入3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，85℃回流5h，将所得固体在10000r/min下离心30min，所得固体在60℃下，于真空干燥箱干燥24h，制得氨基化N-GS；
（4）将所得氨基化N-GS分散于100mL超纯水中，加入10mL的戊二醛和10mL、100μg/mL的环境雌激素抗体，室温下振荡12h。
实施例10
所检测的环境雌激素为雌二醇。
实施例11
所检测的环境雌激素为雌酮。
实施例12
所检测的环境雌激素为炔雌醇。

Claims (4)

1.一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将3~8μL、0.5~2mg/mLAuAg异质合金液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6μL环境雌激素抗体，6μL、质量分数为0.5%~2.5%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（3）滴加6μL、0.003~5ng/mL的一系列不同浓度的环境雌激素抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干。
2.如权利要求1所述的一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用，所述的AuAg异质合金，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将0.001~1mL、0.05~0.1mol/L氯金酸，0.01mL、0.05~0.5mol/L硝酸银和0.1~5mL、0.1~3.5mol/L的聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐PDDA加入到20~200mL的乙二醇溶液中，混合均匀；
（2）将混合溶液在60~185℃下反应20~100h，将所得固体用超纯水洗涤、在10000~15000r/min下离心3次，35~55℃下在真空干燥箱干燥2~24h，得到AuAg异质合金。
3.如权利要求1所述的一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用，所述的氮掺杂石墨烯与环境雌激素抗体孵化物Ab-N-GS，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取20~100mg的氧化石墨烯，分散于30~100mL的超纯水中，并加入50~300mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF，充分摇匀，超声0.5~5h；
（2）将混合液在130~160℃下反应0.5~5h，反应结束后，8000~10000r/min下离心10~30min，所得固体在40~60℃下，于真空干燥箱干燥12~48h得到氮掺杂石墨烯N-GS；
（3）将0.1~0.5gN-GS加入到5~15mL无水乙醇中，加入0.1~3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，50~85℃回流0.5~5h，将所得固体在8000~10000r/min下离心10~30min，所得固体在40~60℃下，于真空干燥箱干燥12~24h，制得氨基化N-GS；
（4）将所得氨基化N-GS分散于10~100mL超纯水中，加入0.01~10mL的戊二醛和0.01~10mL、100μg/mL的环境雌激素抗体，室温下振荡12h。
4.如权利要求1所述的一种基于氮掺杂石墨烯标记的环境雌激素传感器的制备方法及应用，所述的环境雌激素选自下列之一：雌二醇，炔诺酮，己烯雌酚，雌酮，雌三醇，炔雌醇。
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