CN105442022A - 电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法 - Google Patents

电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法，通过本发明方法在AZ91D表面电泳沉积制备的膜层与基体结合紧密，具有良好的生物活性、生物相容性及载药性能，提供了一种新的骨植入材料载药的方法，本发明方法如下:一、镁合金微弧氧化(MAO)处理；二、载庆大霉素(GM)的CNTs电泳液的配制；三、以MAO-AZ91D为阴极，涂覆铱钽的钛合金为阳极电泳；四、在磷酸盐缓冲溶液(PBS)内浸泡。

Description

电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法
技术领域
本发明涉及骨科医疗器械制备领域，特别是涉及一种电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法。
背景技术
在整形外科手术中软组织和骨感染是一个关注的问题，其中臀部和膝盖关节手术感染率在2％-4％，螺钉引起的骨感染已上升至45％。修复手术感染率达40％。可见，感染预防和治疗是整形外科和创伤手术中一个重要的挑战，局部应用抗生素利于骨整合，可以有效降低骨和软骨组织感染，同时避免全身应用抗生素到达感染部位的效果差，又容易引起毒性等缺点。
骨修复材料可分成：金属材料、陶瓷材料、高分子材料及其复合物。金属植入材料力学性能好，但缺乏生物活性，通常不能与骨组织发生键合，并且弹性模量过高，易产生应力屏障效应，在体液作用下，持续放出金属离子。陶瓷植入材料：生物活性好，有一定的孔隙率，但抗疲劳性和抗压性低。高分子植入材料：可塑性强，易加工成型，但生物活性差，大量降解容易造成组织毒性反应，引起病变。针对上述问题，金属基陶瓷-高分子复合材料成为植入材料的发展方向和研究的热点。
CNTs是石墨管状结构，由于其特殊的物理、电学和化学性质引起了人们的关注。CNTs通过各种方式应用于组织工程领域，它们可以提高复合生物材料的机械性能和生物相容性，利于与细胞结合蛋白作用，通过优先与细胞亲和来调节细胞形态、调节细胞分化等。
庆大霉素是由棘孢小单孢菌、绛红小单孢菌等发酵生成的一种氨基糖苷类抗生素。硫酸庆大霉素是为数不多的热稳定性抗生素，具体抗菌谱广，主要用于治疗细菌感染，尤其是对革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌引起的感染。它是通过与细菌核糖体30s亚基结合，从而阻断细菌蛋白质的合成。因此，复合庆大霉素抗生素的骨材料在防治感染性骨缺损方面具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明是为了丰富可降解金属基复合骨植入材料的种类，而提供了可降解镁合金表面电泳法负载庆大霉素的钙磷/壳聚糖/CNTs载药膜层的制备方法，本发明解决了复合材料与基体结合不好、生物相容性差的问题，提供了一种新的骨植入材料载药的方法。
为达上述目的，本发明一种电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法，其包括以下步骤：
一、镁合金微弧氧化(MAO)：
对AZ91D镁合金处理，将AZ91D镁合金放入30g/LKOH、30g/LNa4SiO4、40g/LNa3PO4和15g/LNaF溶液中，在微弧氧化过程中，AZ91D镁合金为阳极，装有电解液的不锈钢槽为阴极，采用恒流氧化方式，电流强度为0.1A/cm2，氧化时间为10s；
二、电解液的配置:
步骤a、将0.25g壳聚糖、1.0gn羟基磷灰石粒子和含庆大霉素注射液的CNTs在超声条件下依次加到200mL醋酸水溶液中，所述醋酸水溶液含醋酸9mL，得到溶液A。其中含庆大霉素注射液的CNTs是将40mg/ml庆大霉素注射液与0.25g/LCNTs醋酸水溶液按7.5-8.75：1(mL/l)的比例混合得到，之后加蒸馏水，搅拌，过滤，干燥得到电泳碳源，以上两次所述醋酸水溶液为每200mL中含醋酸9mL；
步骤b，将1.5gn羟基磷灰石粒子加到300mL无水乙醇中，得到悬浮液B；
步骤c，将溶液A与悬浮液B混合，超声混匀1-2h、陈化24-30h，得到电泳溶液；
三、以MAO-AZ91D为阴极，涂覆铱钽的钛合金为阳极，两电极之间的距离为1cm，在40V下恒压电泳20min；
四、经步骤三处理的MAO-AZ91D浸泡在PBS磷酸盐缓冲液中，在37℃±0.5℃条件下，于250mL的PBS磷酸盐缓冲液中浸泡5d，所获得的样品经蒸馏水润洗后，室温干燥，待用，其中步骤四中的PBS磷酸盐缓冲液需每天更换，PBS磷酸盐缓冲液由10g/LNaH2PO4和10g/LNa2HPO4去离子水构成。
其中步骤四中所述PBS磷酸盐缓冲液中含体积百分比1-8％的庆大霉素注射液。
本发明与现有技术不同之处在于本发明取得了如下技术效果：
通过本发明在镁合金表面电泳法负载庆大霉素的钙磷/壳聚糖/CNTs载药膜层的制备方法，膜层与基体结合良好，具有良好的生物活性及细胞相容性，电泳载药制备的AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖/GNS沉积层，在m-SBF介质中药物持续释放时间达60d以上。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是本发明实施例1中，泳液中不同浓度CNTs时钙磷/壳聚糖膜层在m-SBF中浸泡4周XRD谱图((a)0.05g/L；(b)0.1g/L；(c)0.15g/L；(d)0.25g/L；(e)0.3g/L；(f)0.4g/L)；
图2是本发明实施例1中，泳液中不同浓度CNTs时钙磷/壳聚糖膜层在m-SBF中浸泡4周FTIR谱图((a)0.05g/L；(b)0.1g/L；(c)0.15g/L；(d)0.25g/L；(e)0.3g/L；(f)0.4g/L)；
图3是本发明实施例1中，泳液中不同浓度CNTs时钙磷/壳聚糖膜层在m-SBF中浸泡4周SEM照片((a)0.05g/L；(b)0.1g/L；(c)0.15g/L；(d)0.2g/L；(e)0.25g/L；(f)0.3g/L；(g)0.4g/L)；
图4是本发明实施例1中，泳液中不同浓度CNTs时钙磷/壳聚糖膜层的划痕金相照片((a)0.05g/L；(b)0.1～0.25g/L；(f)0.3g/L)；
图5是本发明实施例2中，优化制备条件下钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡不同时间条件下的XRD谱图((a)0week；(b)1week；(c)2weeks；(d)4weeks；(e)6weeks；(f)8weeks；(g)10weeks；(h)12weeks)；
图6是本发明实施例2中，优化制备条件下钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡不同时间条件下的FTIR谱图((a)0week；(b)2weeks；(c)4weeks；(d)6weeks；(e)8weeks；(f)10weeks；(g)12weeks)；
图7是本发明实施例2中，优化制备条件下钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡不同时间条件下的SEM照片((a)0week；(b)1week；(c)4weeks；(d)8weeks；(e)10weeks；(f)12weeks)；
图8a-e是本发明实施例2中，优化制备条件下AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs在m-SBF中浸泡不同时间时Nyquist图((a)0days(b)2weeks(c)4weeks(d)10weeks(e)12weeks)；
图9是本发明实施例4中，优化制备条件下CCK8法研究MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料与AZ91D,MAO-AZ91D,AZ91D基钙磷/壳聚糖浸渍m-SBF不同时间浸提液的细胞生存率；
图10是本发明实施例5中，优化制备条件下AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料与AZ91D,MAO-AZ91D,MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖浸渍m-SBF不同时间的浸提液的碱性磷酸酶活性(ALK)；
图11是本发明实施例6中，优化制备条件下，AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖、AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖/CNTs膜层试样在不同GM含量的PBS中浸渍3d后膜层中释放GM吸光度；
图12是本发明实施例7中，优化制备条件下GM与CNTs不同比例混合时电泳载药试样膜层中释放GM吸光度；
图13是本发明实施例8中，优化制备条件下渍载药试样膜层中GM在m-SBF中释放浓度随浸泡时间的变化；
图14是本发明实施例9中，优化制备条件下电泳载药试样在不同条件下膜层中GM释放曲线(a)100mLPBS+6mLGM浸泡5d后于250mLm-SBF中释放，(b)100mLPBS浸泡5d后于m-SBF释放。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
实施例1：
本实施例中可降解镁合金表面电泳法负载庆大霉素钙磷/壳聚糖/CNTs骨植入材料制备方法是按下述步骤进行：
一、镁合金微弧氧化(MAO)：将AZ91D镁合金放入30g/LKOH、30g/LNa4SiO4、40g/LNa3PO4和15g/LNaF溶液中。在微弧氧化过程中，AZ91D镁合金为阳极，装有电解液的不锈钢槽为阴极。采用恒流氧化方式，电流强度为0.1A/cm2，氧化时间为10s；
二、电泳液的配制：
步骤a、将0.25g壳聚糖(简称CS)、1.0gnHA粒子和不同比例CNTs(0.05g/L；0.1g/L；0.15g/L；0.25g/L；0.3g/L；0.4g/L)，在超声条件下依次加到200mL醋酸水溶液(含醋酸9mL)中，得到溶液A；
步骤b，将1.5gnHA粒子在超声条件下加到300mL无水乙醇中，得到悬浊液B；
步骤c，将溶液A与悬浮液B混合，制成电泳液。实验中所使用的是多壁CNTs，直径50-70nm，长度5-12nm，CNTs在使用前先经浓硝酸活化处理，再经超声分散和微孔滤膜过滤除去杂质；
三、以MAO-AZ91D为阴极，涂覆铱钽的钛合金为阳极，两电极之间的距离为1cm左右，在40V下恒压电泳20min；
四、经步骤三处理的MAO-AZ91D浸泡在不同成分的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在37℃±0.5℃条件下，于250mLPBS中浸泡5d，所获得的样品经蒸馏水润洗后，室温干燥，待用。其中步骤四中的PBS需每天更换，PBS由10g/LNaH2PO4和10g/LNa2HPO4去离子水构成；
五、经步骤四处理的含有不同浓度CNTs的钙磷/壳聚糖膜层的MAO-AZ91D复合材料浸泡在250mL模拟体液(m-SBF)中，，m-SBF的pH约为7.4，其化学组成见表1。溶于去离子水中，试样表面积(cm2)与m-SBF(mL)的比值是1:250。在37℃±0.5℃条件下，浸泡4周，所获得的样品经蒸馏水润洗后，室温干燥，待用。
表1m-SBF化学成分
HEPES为2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonicacid2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
本实施例所述方法对镁合金进行微弧氧化会增加材料的结合力及耐蚀性。
由图1结果可见在含有不同浓度CNTs的钙磷/壳聚糖膜层的MAO-AZ91D复合材料浸泡在m-SBF中，膜层中主要成分是HA和HCA，泳液中CNTs浓度为0.1g/L到0.3g/L时，HA和HCA衍射峰强度增加,当CNTs浓度从0.1g/L变化到0.25g/L时，所获得钙磷/壳聚糖/CNTs膜层的结合力和生物活性均较好。
本实施例中CNTs沉积在钙磷/壳聚糖膜层中的反应方程式：
CHIT-NH2+H3O+→CHIT-NH3 ++H2O(1)
CNTs+CHIT-NH3 +→CNTs-CHIT-NH3 +(2)
2H2O+2e-→H2+2OH-(3)
CHIT-NH3 ++OH-→CHIT-NH2+H2O(4)
CNTs-CHIT-NH3 ++OH-→CNTs-CHIT-NH2+H2O(5)
由图1及图2结果可见当钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡后，主要成分为HA和HCA，泳液中CNTs浓度为0.1g/L到0.3g/L时PO4 3-和CO3 2-吸收峰呈现增强趋势，说明钙磷/壳聚糖膜层中添加CNTs有利于磷酸盐的结晶生长。由图3可见，钙磷/壳聚糖膜层中出现膜层表面清晰地呈现出管状结构，而且，泳液中CNTs浓度从0.05g/L增加到0.4g/L时，管状结构的数量随之增加。当CNTs浓度从0.25g/L增加到0.4g/L时，CNTs开始聚集和交织，这可能会延缓HA和HCA的生长。由图4结果可见当钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡后，当CNTs浓度是0.05g/L时，所获得的膜层不能承受70N载荷。当CNTs浓度从0.1g/L变化到0.25g/L时，膜层的结合力很好。当CNTs浓度达到0.3g/L时，钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在70N载荷作用下发生了破坏，过量的CNTs促使膜层与金属基体之间的结合力反而降低了。
实施例2：
本实施例与实施例1不同的是：采用优化制备条件CNTs浓度为0.2g/L。其它步骤和参数与实施例1相同。
由图5至图6的结果可见钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡前，其主要化学成分是DCPD、HA和HCA；浸泡m-SBF之后，DCPD会转化为HA和HCA，并且，膜层中HA和HCA呈结晶生长的趋势。其中，当浸泡时间从1周变化到4周时，HA和HCA衍射峰增强，表明膜层中HA和HCA生长趋势增强。当浸泡时间从4周变化到12周时，HA和HCA衍射峰强度有所降低，说明磷酸盐生长趋势变弱。由图7的结果可见，钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡前，膜层表面未观察到CNTs，这是因为CNTs几乎被HA、DCPD和壳聚糖覆盖，在m-SBF中浸泡后，随浸泡时间的延长钙磷/壳聚糖/CNTs膜层中CNTs将逐渐被暴露出来，当浸泡时间达到4周时，膜层表面会观察到大量的CNTs。CNTs可促使HA在其表面沉积和矿化。一些研究结果已表明CNTs表面可为针状纳米磷灰石晶体提供结晶位置和生长支架，从而促进磷酸盐的成核和生长，CNTs附近逐渐被磷灰石或类骨磷灰石覆盖。当浸泡时间到达12周时，CNTs几乎被磷灰石或类骨磷灰石淹没。]由图8a-8e的结果可见，当AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖/CNTs在m-SBF中浸泡10d、2周和4周时，Rct增加Rs降低，AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖/CNTs在m-SBF中浸泡4周左右时膜层没有发生破裂，说明钙磷/壳聚糖膜层中复合CNTs后膜层与基体结合力有所提高。浸泡时间增加到10周和12周时，金属基体上的腐蚀产物、MAO层和钙磷/壳聚糖/CNTs膜层会发生局部的破坏，这将导致金属基体的保护层缺失，因此，Nyquist图中Rs降低到零。
实施例3：
本实施例与实施例1不同的是：采用优化制备条件下制备的MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料与MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖，MAO-AZ91D镁合金、AZ91D镁合金浸泡在m-SBF中，在37℃±0.5℃条件下，浸泡6and12h,and1d，2d，5d，8d，16d，20d，24d，30d，45d，60d及90d，所获得的样品经滤器消毒，待用。
实施例4：
本实施例与实施例1不同的是：采用CCK8法研究MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料、MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖，MAO-AZ91D镁合金、AZ91D镁合金浸渍在m-SBF不同时间浸提液的细胞生存率，其它步骤和参数与实施例1相同。
由图9的结果可见，优化制备条件下细胞生存率：MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料＞MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖＞MAO-AZ91D镁合金＞AZ91D镁合金。
实施例5：
本实施例与实施例1-3不同的是：采用优化制备条件下制备的MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料与MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖，MAO-AZ91D镁合金、AZ91D镁合金浸渍在m-SBF不同时间浸提液，研究四种浸提液的碱性磷酸酶活性(ALK)，其它步骤和参数与实施例1-3相同。
由图10的结果可见，MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料与MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖材料的ALK活性相似，浸提液时间为45天时，MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖材料的ALK活性高于MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料。
实施例6：
本实施例与实施例1-3不同的是：采用下述步骤配制的PBS替代步骤四所述的PBS,在37℃条件下置于100mL含1％-8％GM的PBS中浸泡5d，每天更换一次溶液，测量其吸光度，其它步骤和参数与实施例1-3相同。
由图11的结果可见浸渍载药试样膜层中GM的负载量随浸泡液中药物浓度的增加而增加，而且，当PBS浸泡液中GM注射液体积含量大于6％时，膜层中释放的GM吸光度值变化不大，说明此时浸渍载药效果较好,同时，MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料的载药能力高于MAO-AZ91D基钙磷/壳聚糖材料。
实施例7：
本实施例与实施例1-3不同的是：将GM注射液与CNTs混合比例由10:1逐渐增加至大于40:1(mL/g)，其它步骤和参数与实施例1-3相同。
由图12的结果可见GM与CNTs不同比例混合时所制备电泳载药试样膜层中释放的GM吸光度。随GM与CNTs混合比例的增加，所得到AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs膜层中释放GM的吸光度值也增加，即两种电泳载药试样膜层中GM负载量随药物与碳源混合比例的增加而增加。当GM注射液与CNTs混合比例大于30:1(mL/g)时，钙磷/壳聚糖/CNTs膜层中释放GM的吸光度值变化不大，说明此时膜层中药物负载量几乎达最大。
实施例8：
本实施例与实施例1-3不同的是：采用下述步骤配制的PBS替代步骤四所述的PBS,在37℃条件下置于含GM注射液体积含量为6％的PBS溶液中浸泡5d，每天更换一次溶液。然后在250mLm-SBF中释放药物。测定不同时间点各溶液吸光度值。其它步骤和参数与实施例1-3相同。
由图13的结果可见浸渍载药试样膜层中GM在1d内，三种试样中GM呈崩发式释放，药物浓度急剧增加，2-5d时GM释放浓度略微降低。浸泡时间达5d时，膜层中药物基本释放完全，m-SBF中药物浓度随浸泡时间的延长不再增加，对于AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖/CNTs试样，在整个浸泡周期内，药物一直持续释放，浸泡15d之前药物释放浓度增加较快，浸泡15d之后药物释放浓度增加缓慢。
实施例9：
本实施例与实施例1-3不同的是：在37℃条件下，将负载GM注射液与CNTs混合比例为30:1(mL/g)时，制备负载GM的AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖、AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖/CNTs电泳载药试样，采用下述步骤配制的PBS替代步骤二所述的PBS,在37℃条件下置于100mL含及不含6mlGM的PBS中浸泡5d，每天更换一次溶液。然后在250mLm-SBF中释放药物。测定不同时间点各溶液吸光度值。其它步骤和参数与实施例1-7相同。
由图14的结果可见电泳载药制备的AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖/CNTs沉积层，在含GM的PBS中进行转化时的膜层中药物释放浓度在整个释放周期内分别略高于无GM的PBS中浸泡的试样,当浸泡时间约为12d左右时，AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs和AZ91D基钙磷/壳聚糖/GNS在m-SBF中已释放78％-92％的药物，此后GM的浓度变化很小。试样在m-SBF介质中药物持续释放时间达10d以上。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
一、镁合金微弧氧化(MAO)：
对AZ91D镁合金处理，将AZ91D镁合金放入30g/LKOH、30g/LNa4SiO4、40g/LNa3PO4和15g/LNaF溶液中，在微弧氧化过程中，AZ91D镁合金为阳极，装有电解液的不锈钢槽为阴极，采用恒流氧化方式，电流强度为0.1A/cm2，氧化时间为10s；
二、电解液的配置:
步骤a、将0.25g壳聚糖、1.0gn羟基磷灰石粒子和含庆大霉素注射液的CNTs在超声条件下依次加到200mL醋酸水溶液中，所述醋酸水溶液含醋酸9mL，得到溶液A。其中含庆大霉素注射液的CNTs是将40mg/ml庆大霉素注射液与0.25g/LCNTs醋酸水溶液按7.5-8.75：1(mL/l)的比例混合得到，之后加蒸馏水，搅拌，过滤，干燥得到电泳碳源，以上两次所述醋酸水溶液为每200mL中含醋酸9mL；
步骤b，将1.5gn羟基磷灰石粒子加到300mL无水乙醇中，得到悬浮液B；
步骤c，将溶液A与悬浮液B混合，超声混匀1-2h、陈化24-30h，得到电泳溶液；
三、以MAO-AZ91D为阴极，涂覆铱钽的钛合金为阳极，两电极之间的距离为1cm，在40V下恒压电泳20min；
四、经步骤三处理的MAO-AZ91D浸泡在PBS磷酸盐缓冲液中，在37℃±0.5℃条件下，于250mL的PBS磷酸盐缓冲液中浸泡5d，所获得的样品经蒸馏水润洗后，室温干燥，待用，其中步骤四中的PBS磷酸盐缓冲液需每天更换，PBS磷酸盐缓冲液由10g/LNaH2PO4和10g/LNa2HPO4去离子水构成。
2.根据权利要求1所述的电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法，其特征在于：步骤四中所述PBS磷酸盐缓冲液中含体积百分比1-8％的庆大霉素注射液。
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