CN105420402A - 一种与奶牛体细胞评分相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与奶牛体细胞评分相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种与奶牛体细胞评分相关的分子标记及其应用，具体为一种影响奶牛体细胞分表型差异的CXCL10基因3ˊUTR区功能性分子标记位点及其在奶牛遗传改良中的应用。通过测定奶牛基因组DNA中CXCL10基因分子标记g.1742A>G，根据第1742位点是否A→G突变，预测SCS表型高低，当奶牛CXCL10基因第1742位点之间发生GG突变时，奶牛SCC表型最低。本发明首次阐明CXCL10基因功能性分子标记g.1742A>G与奶牛SCC表型差异的相关性，为奶牛优势品种的辅助育种提供了有效手段。

Description

一种与奶牛体细胞评分相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及家畜遗传育种技术领域，具体涉及一种与奶牛体细胞评分相关的分子标记及其应用，具体为一种影响奶牛体细胞分表型差异的CXCL10基因3'UTR区功能性分子标记位点及其在奶牛遗传改良中的应用。
背景技术
我国奶牛产业发展迅速，培育高产奶牛群体、奶牛养殖向数量与质量并重转变已成为我国奶牛产业发展的关键。奶牛的较重要的经济性状是与产奶性能有关的性状(产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳汁率、乳蛋白率)和乳腺炎抗性性状。
乳腺炎是奶牛乳腺器官的一个重要传染性疾病，会使产奶量减少，弃奶量增加，增加药物用量，淘汰率增加，造成巨大经济损失，还会引发其他疾病。产奶量和乳腺炎之间存在负的遗传相关性。因此，监视乳腺炎的发生并且及早治疗是非常重要的。牛奶中的体细胞数(SomaticCellCount，SCC)是乳腺炎及其细胞免疫防御系统的一个指示物，指的是牛奶吞噬细胞、脱落上皮细胞、中性白细胞的总称。正常情况下中性白细胞(PMN)百分比为0～11％，巨噬细胞66～88％，淋巴细胞10～7％。健康乳房得到的牛奶显示了一个基础生理细胞数，其变化范围为1.8万～20万cells/mL，几何平均数为6.8万cells/mL，而患有隐性乳房炎的奶牛，这一数值可以达到50万/ml以上，因此，在某种程度上，SCC是反应乳腺感染程度的标记，又称“金标准”。乳房炎一般可分为临床型和亚临床型两种。亚临床型乳房炎又称隐性乳房炎，其特点是临床上不易察觉，但往往在牛群中广泛流行。乳房炎所造成的损失70％是由隐性乳房炎导致的。据统计，美国牛群隐性乳房炎发病率是30％～70％，而中国为50％～80％。乳中体细胞数量是诊断奶牛隐性乳房炎的标准，被广泛应用于评定奶牛各乳区和奶牛的健康状况。当乳腺发生炎症反应时，多形核白细胞(PMN)大量进入乳腺，成为主要成分细胞，使乳汁中体细胞数量明显上升。由于体细胞数(SCC)存在着非正态性分布，而体细胞评分(SomaticCellScore，SCS)具有正态分布的特性，因此在进行关联分析时，一般将SCC转换成SCS，其公式为：SCS＝log2(SCC/100,000)+3。乳腺炎的遗传力较低，加上大多数牛群中不能准确记录乳腺炎的发生率，因此，直接选择乳腺炎抗性比较困难，体细胞评分与乳腺炎之间存在中等或较强的相关性，可作为乳腺炎抗性的辅助育种性状。
近年来，随着生物技术，特别是基因组学及生物信息学的迅速发展，以功能基因组学、分子标记辅助育种和转基因为代表的分子育种技术已成为动物育种的发展方向和重要标志，奶牛育种也正在迅速的朝着分子育种方向迈进。单核苷酸多态性(SNP)是哺乳动物基因组最常见的变异类型，它们可以调控基因的表达，从而对其作用的发挥产生影响，进而引起表型的差异。通常情况下，我们将SNP分为三类，即编码区的SNP、基因间的SNP以及基因周边的SNP。基因3'UTR区的SNP便属于基因周边SNP中的一种。研究表明，基因3'UTR的SNP主要影响MicroRNA与3'UTR结合，促进或抑制基因翻译，发挥着重要的作用。其单核苷酸多态性(突变)是导致不同奶牛个体间生产性能产生差异的遗传学基础。因此，基于功能性的分子标记辅助选择低体细胞分的奶牛具有很好的应用潜力。
CXC趋化因子配体10(CXCchemokineligand-10，CXCL10)又称为干扰素γ诱导蛋白10，属于CXC趋化因子超家族的非ELR(glutamicacid—leueinerginine)，目前研究表明CXCL1参与多种疾病的免疫调控。CXCL10主要介导Thl型炎性反应，趋化单核细胞和T细胞，可加强Thl反应的进程，破坏Th2反应的进程。CXCL10不仅可以趋化白细胞向炎症部位聚集，而且在肿瘤的生长、血管的新生和器官硬化等方面起着重要的作用。
虽然现有技术中有多种基因的SNP与奶牛SCS存在关联，如CN103045727A一种与中国荷斯坦奶牛产奶形状及体细胞评分相关的SNP标记及其应用，其SNP位点位于HAL基因；何阳花等，荷斯坦牛STAT5b多态性与SCS和产奶性状的关联分析，2009；高帅，中国荷斯坦牛HSTN基因多态性与乳SCS及产奶性状的关联分析，2012等，但到目前为止，CXCL10基因3'UTR区功能性分子标记位点及其在奶牛遗传改良中的应用尚未见报道。
发明内容
为解决现有技术的不足，发明人通过研究，提供一种影响奶牛体细胞评分高低差异的CXCL10基因3'UTR区功能性分子标记与应用。选取有利的等位基因型个体留种，可降低奶牛群体的SCS，降低奶牛乳腺炎病的发病率，减少经济损失，最终为育成抗乳腺炎的优良奶牛新品系打下一定的基础。
本发明的目的是提供一种与奶牛体细胞评分相关的SNP分子标记，所述分子标记位于SEQIDNO:6所述序列的第312位，第312位核苷酸为A或G。
所述SNP分子标记位于CXCL10基因3'UTR区，g.1742A>G，是检测奶牛自GenBankAccessionNoAC_000163.1(92623585..92625937,CXCL10基因起始密码子ATG作为+1)。
上述CXCL10基因3'UTR区功能SNP位点可用于筛选和鉴定奶牛群体的低SCS。该CXCL10基因3'UTR区SNPg.1742G>A可作为功能性分子标记，继而对奶牛的乳腺炎抗性辅助育种提供了一种新的方法。经细胞瞬时转染实验验证，通过双荧光素报告系统进行分析，结果表明，CXCL10基因3'UTR区SNP能够改变bta-miR-339结合能力，突变后3'UTR区靶序列与bta-miR-339不结合，这样使CXCL10在突变前后呈现出不同表达水平，从而影响奶牛的SCS。
本发明的另一目的是提供用于检测与奶牛体细胞评分相关的SNP分子标记的引物对，具体的，所述引物对为SEQIDNO.1所示的上游引物与SEQIDNO.2所示的下游引物，或为SEQIDNO.4所示上游引物与SEQIDNO.5所示的下游引物。
其中SEQIDNO.4所示上游引物与SEQIDNO.5所示的下游引物，PCR所扩增的片段含有CXCL10第1742位核苷酸(PCR扩增的片段序列如SEQIDNO.6所示)。
本发明的另一目的是提供用于筛选低体细胞评分或降低奶牛体细胞评分的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对。
所述试剂盒还包括dNTPs、TagDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应液。
优选的，本发明提供一种用于筛选低体细胞评分或降低奶牛体细胞评分的试剂盒，该试剂盒包括：SEQIDNO.4所示上游引物与SEQIDNO.5所示的下游引物；dNTPs、TagDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应液；FastDigest限制酶ManlI，酶切缓冲液。
本发明的另一目的是提供所述SNP分子标记在奶牛辅助育种中的应用。优选的，利用所述分子标记筛选和鉴别体细胞评分低的奶牛优势品种。
本发明的另一目的是提供上述检测该SNP分子标记的引物对在筛选和/鉴定体细胞评分低的奶牛优势品种中的应用。
优选的，本发明提供一种筛选低体细胞评分或降低奶牛SCS的辅助育种方法，提取奶牛基因组DNA为模板，利用SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的引物进行扩增，将PCR产物用FastDigest限制酶ManlI进行切割，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并最终根据电泳结果进行判定：对于CXCX10基因3'UTR区SNP位点(g.1742A>G)，共有三种基因型，分别是GG基因型(电泳显示有300bp，70bp两条带)，GA基因型(电泳显示有370bp，300bp，70bp三条带)以及AA基因型(电泳显示仅有370bp一条带)，其中AA基因型可使bta-miR-339与CXCL10基因3'UTR结合，不利于CXCL10的表达，且SAS统计分析显示AA基因型个体的SCS显著高于其它基因型个体的SCS，选择SCS低的基因型作为候选基因的功能性分子标记，用于辅助育种。
上述所用的奶牛基因组DNA，是通过苯酚/氯仿抽提法或高盐法提取得来，并最终将其浓度稀释至50ng/μl，-20℃保存备用。
上述是25μlPCR扩增反应的体系，主要包括：上游引物GF(如SEQIDNO.4所示)和下游引物GR(如SEQIDNO.5所示)各1μl，引物浓度为10μmol/L；2×TaqPCRMasterMix12.5μl；模板DNA1μl，DNA浓度为50ng/μl；ddH2O9.5μl。
上述PCR扩增反应的条件是：第一步预变性，温度94℃，时间5min；第二步35个循环，包括94℃变性30s，58℃退火50s，72℃延伸30s；第三步终延伸，温度72℃，时间10min。
上述所用的FastDigest限制酶ManlI，用于识别CXCL10基因3'UTR区SNP位点(g.1742A>G)。
上述是20μl的FastDigest限制酶ManlI的酶切体系：PCR产物10μl，FastDigest限制酶ManlI1μl，10×FastDigestbuffer2μl，ddH2O7μl。
上述FastDigest限制酶TaqⅠ的酶切反应条件是：37℃，30min。
上述琼脂糖凝胶电泳所用的凝胶的质量浓度为：2％。
本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明用于筛选SCS低的优良奶牛新品系，既涉及到SNP对MicroRNA结合能力的影响，又运用了统计学手段进行分析，二者相互结合，大大增加了结果的可靠性，且具有新颖、操作简便、低成本等优点。
(2)本发明提供了一种应用性极强的新型试剂盒，利用CXCL10基因3'UTR区SNP位点(g.1742A>G)进行低SCS奶牛的筛选。GG基因型作为低SCS特征的有效分子标记，予以留种。应用该试剂盒可增加检测效率，减少了检测的盲目性，使成本费用更低、操作更加简单化。
(3)本发明提供的分子遗传标记不受奶牛的年龄、性别等限制，可用于奶牛的早起选育，在实际中，可以大规模用于早期对低SCS奶牛的筛选，缩短育种所用时间，以期可以积极的推动我国奶牛行业的发展。
附图说明
图1：牛CXCL10基因3'UTR区SNP位点(g.1742A>G)的测序图及位置；
图2：牛CXCL10基因3'UTR区SNP位点(g.528A>G)在2％琼脂糖凝胶电泳中的基因分型图；
图3：细胞瞬时转染实验验证g.1742A>G对bta-miR-339与牛CXCL10基因3'UTR区结合的影响。
具体实施方式
下面对本发明的一种鉴定影响奶牛体细胞分表型差异的功能性分子标记的方法及其应用作以下详细说明。
实施例1：牛CXCL10基因3'UTR区SNP的鉴定及功能验证
1.采集245头奶牛血液(本发明所使用的这些奶牛血样来自青岛和济南奶牛场，这245头牛的DHI数据记录完全)。采用苯酚/氯仿抽提法提取血液基因组DNA，然后利用紫外分光光度计对提取的DNA样品进行纯度和浓度的检测，并最终稀释成50ng/μl，-20℃保存备用。
2.以牛基因组DNA为模板，利用PrimerPremier5.0软件设计引物CXCL10-F(如SEQIDNO.1所示)和CXCL10-R(如SEQIDNO.2所示)，进行PCR扩增，扩增后的序列如SEQIDNO.3所示。PCR扩增产物直接测序，测序结果与GenBank登录号AC_000163.1(92623585..92625937)的牛CXCL10基因序列进行比对，发现1个SNP位点g.1742A>G(以CXCL10基因的起始密码子ATG作为+1)，位于CXCL10基因3'UTR区域内(图1)。
3.利用miRNA在线预测软件RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)预测与CXCL10基因3'UTR区域SNP结合的miRNAs。结果表明CXCL10基因3'UTR上的SNPg.1742A>G位于bta-miR-339的种子区，可与野生型型AA的CXCL103'UTR片段结合，但突变后不与bta-miR-339结合。
4.利用酶切的方法，设计出特异性的专用分型引物GF(如SEQIDNO.4所示)和GR(如SEQIDNO.5所示)，使牛CXCL10第1742位碱基A→G突变(g.1742A>G)可以被FastDigest限制酶ManlI识别。以牛基因组DNA为模板，利用上述特异性的专用分型引物GF(如SEQIDNO.4所示)和GR(如SEQIDNO.5所示)进行PCR扩增，扩增后的序列如SEQIDNO.6所示。PCR扩增产物经FastDigest限制酶ManlI切割后，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并最终根据电泳结果进行判定(如图2)：对于CXCX10基因3'UTR区SNP位点(g.1742A>G)，共有三种基因型，分别是AA基因型(电泳显示仅有370bp一条带)，AG基因型(电泳显示有370bp，300bp，70bp三条带)以及GG基因型(电泳显示有300bp，70bp两条带)。
5.利用细胞瞬时转染实验对上述预测结果进行验证，分别将含有野生型(AA)和突变型(GG)的3'UTR片段与pMIR载体连接，构建3'UTR荧光素酶表达质粒，并对应命名为pMIR-3'UTR-A和pMIR-3'UTR-G；同时，构建bta-miR-339质粒。随后将3'UTR荧光素酶表达质粒pMIR-3'UTR-A和pMIR-3'UTR-G，分别与bta-miR-339质粒、内参β-gal质粒共转染293T细胞，培养36小时后,通过双荧光素报告系统进行分析，结果如图3所示。野生型质粒的活性低于突变型的质粒，这和上述的预测结果一致。说明突变后即GG基因型时，bta-miR-339与牛CXCL10基因3'UTR区结合能力比突变前即AA基因型时低，从而使CXCL10基因表达量增加。CXCL10基因的高表达有利于辅助选择具有低SCS表型的个体，从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系，因此再次可以认定GG基因型是有利的分子标记，AA基因型为不利的分子标记。
实施例2：牛CXCL10基因3'UTR区SNP分子标记与体细胞分SCS表型关联性分析
利用统计学软件SAS9.0，比较分析牛CXCL10基因3'UTR区SNP(g.1742A>G)的不同基因型体细胞分表型关联性分析。其模型为：Yijk＝μ+Gi+Yj+Hk+eijk。Yijk为体细胞分表型的观察值；μ为群体平均值；Gi:基因型的固定效应；Yj：季节的固定效应；Hk：胎次的固定效应；eijk：随机残差效应。以期通过此关联分析，选择具有更高乳腺炎抗性的个体留种。
关联性分析的结果如表1所示，可以得出结论：野生(AA)基因型的体细胞分显著高于突变(GG)基因型个体(P<0.01)。因此，野生(GG)基因型是具有低SCS表型的有利基因型，可以在奶牛育遗传改良过程中作为有效地功能性分子标记，选择低SCS表型的有利基因型作为候选基因的功能性分子标记，可用于辅助选择具有高乳腺炎抗性的个体，从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系。
表1奶牛CXCL10基因3'UTR区SNPg.1742A>G的不同基因型与体细胞分表型关联性分析
实施例3：制备筛选低SCS表型个体的CXCL10基因3'UTR区SNP检测试剂盒
如实施例1中所示，牛CXCL10基因3'UTR区SNP(g.1742A>G)突变前后可以改变bta-miR-339的结合能力，影响CXCL10基因的表达。其中，GG基因型使bta-miR-339与CXCL10基因3'UTR区序列不结合，有利于CXCL10基因的高表达。而高表达的CXCL10基因对选择具有更低SCS表型的个体是极其重要的。又如实施例2中的关联分析所示，此SNP(g.1742A>G)与体细胞分表型显著相关，AA基因型的乳中体细胞分显著高于GG和AG基因型个体(P<0.05)，GG基因型是低SCS表型的有利基因型。两个实施例共同阐明了牛CXCL10基因3'UTR区SNP位点(g.1742A>G)与筛选奶牛乳腺炎抗性密切相关，GG基因型作为有利的分子标记，可参与筛选具有更低SCS表型的个体。鉴于此，本发明提供了一种用于筛选奶牛SCS表型高低的方法及CXCL10基因3'UTR区的SNP检测试剂盒。其详细成分如下：
上游引物GF(10μmol/L)，其序列如SEQIDNO.4所示；
下游引物GR(10μmol/L)，其序列如SEQIDNO.5所示；
2×TaqPCRMasterMix；
ddH2O；
FastDigest限制酶ManlI；
10×FastDigestbuffer；
该试剂盒的使用说明书包括四部分：
第一部分，25μlPCR扩增反应的体系，主要包括：上游引物GF(如SEQIDNO.4所示)和下游引物GR(如SEQIDNO.5所示)各1μl，引物浓度为10μmol/L；2×TaqPCRMasterMix12.5μl；模板DNA1μl，DNA浓度为100ng/μl；ddH2O9.5μl。
第二部分，PCR扩增反应的条件，①预变性，温度94℃，时间5min；②35个循环，包括94℃变性30s，58℃退火30s,72℃延伸30s；③终延伸，温度72℃，时间10min
第三部分，10μl的FastDigest限制酶ManlI的酶切体系：PCR产物10μl，FastDigest限制酶ManlI1μl，10×FastDigestbuffer2μl，ddH2O7μl。
第四部分，FastDigest限制酶ManlI的酶切反应条件是：37℃，30min。
本发明实际上根据CXCL10基因3'UTR区的SNP，进而提出一种用于筛选影响奶牛体细胞分差异的方法及试剂盒。牛CXCL10基因3'UTR区SNP(g.1742A>G)与体细胞分表型性状显著相关，具有GG基因型的抗乳腺炎较优，因此，GG基因型可以作为有效地功能性分子标记，参与奶牛遗传改良。利用此试剂盒，将GG基因型的奶牛筛选出来，予以留种，淘汰AA基因型奶牛个体。
本发明与常规的测序手段进行分型相比，具有费用更低、耗时更少及效率更高等优点，符合现代科学发展的理念，可以在未来奶牛遗传育种中被广泛的使用。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种与奶牛体细胞评分相关的SNP分子标记，所述分子标记位于SEQIDNO:6所述序列的第312位，第312位核苷酸为A或G。
2.用于检测与奶牛体细胞评分相关的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQIDNO.1所示的上游引物与SEQIDNO.2所示的下游引物，或为SEQIDNO.4所示上游引物与SEQIDNO.5所示的下游引物。
3.用于筛选低体细胞评分或降低奶牛体细胞评分的试剂盒，该试剂盒包括权利要求2所述引物对。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TagDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应液。
5.一种用于筛选低体细胞评分或降低奶牛体细胞评分的试剂盒，该试剂盒包括：SEQIDNO.4所示上游引物与SEQIDNO.5所示的下游引物；dNTPs、TagDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应液；FastDigest限制酶ManlI，酶切缓冲液。
6.权利要求1所述SNP分子标记在奶牛辅助育种中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，利用所述分子标记筛选和/鉴别体细胞评分低的奶牛优势品种。
8.权利要求2所述引物对或权利要求3-5任一项所述试剂盒在鉴定和/筛选体细胞评分低的奶牛优势品种中的应用。
9.一种降低奶牛SCS的辅助育种方法，包括如下步骤：
(1)提取奶牛基因组DNA为模板；
(2)利用SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的引物进行PCR扩增；
(3)将PCR产物用FastDigest限制酶ManlI进行切割，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并最终根据电泳结果进行判定：电泳显示有300bp、70bp两条带的是GG基因型，电泳显示有370bp、300bp、70bp三条带的是GA基因型，电泳显示仅有370bp一条带的是AA基因型，AA基因型个体的SCS显著高于其它基因型个体的SCS，选择SCS低的基因型作为候选基因的功能性分子标记，用于奶牛辅助育种。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，PCR扩增反应的条件是：第一步预变性，温度94℃，时间5min；第二步35个循环，包括94℃变性30s，58℃退火50s，72℃延伸30s；第三步终延伸，温度72℃，时间10min。
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